עבודה זו מומנה על ידי אגודת מקס פלנק.

1. הכנת הצלחות Matrigel מצופות ומדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Matrigel הצלחות Matrigel המצופה כבר מצא להיות מצע מועדף לצירופה של הבחנת EBS וגם מקדמת היעילה התולדה של נוירונים מ10 אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מיליליטר הפשרה של Matrigel הלילה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, מדלל דמוי הג&#39;לי Matrigel עם שני כרכים של DMEM/F-12 קר כקרח ולהכין aliquots של 1 מ&quot;ל ב15 צינורות חרוטי מ&quot;ל prechilled אשר עשוי להיות מאוחסן קפוא ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלט על פורמט צלחת להתמיינות עצבית. לדוגמה, כנקודת התחלה, אנו ממליצים לבצע סבב ראשוני של בידול בפורמט 12-כן. טרום מגניבות ארבע צלחות 12-גם ב 4 ° C. ממס aliquot אחד Matrigel הקפוא על ידי הוספת 9 מ&quot;ל של DMEM/F-12 מראש מצונן ואחרי pipetting מעלה ומטה עד שכל Matrigel prediluted כבר הפשיר ונמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז, להעביר את התוכן לתוך צינור חדש מ&quot;ל 50 המכיל 15 מ&quot;ל של DMEM/F-12 על קרח (דילול סופי Matrigel: 1:75). לאחר מכן יש להוסיף 0.5 מ&quot;ל של Matrigel המדולל לכל אחד גם מהצלחות מראש המקוררות 12-כן. לעטוף צלחות עם Parafilm ולתת לעמוד בRT בן הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר צלחות עד 4 ° C. צלחות מצופות יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר שבועות לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי תקשורת </li></ol> בינוני היווצרות EB (~ 15 מ&quot;ל צורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב - ראה טבלה 1 וסכימה באיור 2): DMEM/F-12 עם 0.4% (PVA) 1x N2 1x B27 0.05% BSA 20 ng / ml FGF2 10 מיקרומטר Y-27632 1x PenStrepGln בידול בינוני (~ 30 מ&quot;ל הצורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב, ואחרי היווצרות נוירון בצלחת Matrigel מצופית 1 12-כן, ראה טבלה 1): DMEM/F-12 1x N2 <br/&gt; 1x B27 0.05% BSA 0.5 מיקרומטר PD0325901 15 SB431542 מיקרומטר Dorsomorphin מיקרומטר 0.5 1x PenStrepGln 2. גיבוש EB כפייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בתנאי hPSCs מזין נטולי המועדפים שלך. אנו משתמשים במדיום MEF ממוזג על צלחות Matrigel מצופות 6-כן 15. עם זאת, מערכות תרבות אחרות כגון מדיה ביתית או מסחרית שהוגדרה צריכות גם לעבוד. בעת התחלת ניסוי בידול, hPSCs צריך להיות תת confluent ופעילה הולכים וגדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני להסיר מושבות ספונטניות נבדלות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק סטרילי תחת מיקרוסקופ סטריאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף מושבות עברו התמיינות נותרת באמצעות PBS ולעכל לתאים בודדים באמצעות Accutase המכיל 1X Y-27632. תאים גלולים בודדים על ידי צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום EB היווצרות ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot של תאים כדיהבינוני נותר EB היווצרות כדי לגרום titre בין 40,000 ל 80,000 תאים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה רב, להעביר 100 μl להיטב לצלחת 96V בתחתית, וכתוצאה מכך 4,000 עד 8,000 תאים לכל היטב. ספין הצלחת 96-גם בצנטריפוגה צלחת נדנדה החוצה ב 400 XG ל1 דקות כדי לאסוף תאים בחלק התחתון של הבארות, ולהעביר לתא תרבות חממה. EBS יהווה בין הלילה, כפי שמוצג באיור 1. </li></ol> 3. אינדוקצית Neuroectoderm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (יום 0), לאסוף EBS מצלחת 96V תחת מיקרוסקופ והעברת סטריאו בנפח קטן לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ&quot;ל של מדיום בידול. עדינות להתסיס את המנה לכמה שניות כדי לשטוף את EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מדיום התמיינות לטובה של U-תחתון נמוך במיוחד-96-מצורף צלחת היטב. תחת stereomicroscope, ההעברה EBS בנפחים קטנים מתבשיל הכביסה ל96U הבארות (EB אחד לכולנוLL). צלחת המקום 96U לתוך תא תרבות החממה במשך 4 ימים כדי לאפשר היווצרות neuroectoderm. </li></ol> 4. גיבוש Neuron <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, להכין תבשיל כביסה כמו בשלב 3.1 ובנוסף להחליף DMEM/F-12 בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופת 12-היטב על ידי מדיום התמיינות (1 מ&quot;ל לטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של EBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף EBS מצלחת 96U, לשטוף אלה כאמורים לעיל, ובזהירות זרעם אחד אחד לתוך בארות של צלחת Matrigel המצופית 12-היטב (כ 8 EBS לטוב): EBS צריך להיות מופץ באופן שווה בתוך הבארות כדי לאפשר תולדה של הפרעה נוירונים במשך הימים הקרובים (ראה &quot;היום 5&quot; תמונה באיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההעברה של גב הצלחת 12-גם לתוך החממה, תאפשר EBS לרפיון לצרף עבור סביב 10 דקות ב RT. ואז, להעביר צלחת 12-היטב בזהירות לתא תרבות חממה. הנוירונים יצמחו מEBS מצופה בצורה רדיאלית בתוך 4 הימים הבאים, כפי שshown באיור 2 (&quot;יום 8&quot; תמונה מהימין). </li></ol></li></ol> 5. גיבוש נוירון כmonolayers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחלופה למדרגות נקודה 4), ביום 4 להליך, לאסוף EBS לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ&quot;ל של מדיום התמיינות, ולאחר מכן להעביר את EBS בנפח קטן לצלחת המכילה PBS, ולאחר מכן אל מנה נוספת המכילה Accutase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לעכל לתאים בודדים, צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום בידול ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer. התאם titre ל1-2x10 6 תאים למ&quot;ל באמצעות מדיום התמיינות (ללא Y-27632). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים את הצלחת בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופית 12-כן (1 מ&quot;ל לטוב), והעברה לתא תרבות חממה. היווצרות נוירון כmonolayers נצפתה בין ימים 7 עד 8 ​​(האיור 3C). יש לציין, עם זאת, כי גרסה זו של monolayerהנוהל אינו מותאם באופן מלא בכל קשור להישרדות תא ומצע המתאים ביותר. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rosette-type,+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration.">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li><li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin.">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li><li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity.">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li><li>Greber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+inhibits+neural+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells.</a> EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).</li><li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene.">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

רוב פרוטוקולי בידול מעורבי היווצרות EB מhPSCs, כולל ההליך שלנו שפורסם בעבר 10, מבוססים על קצירה ידנית או בסיוע של האנזים hESCs כאגרגטים, שמוביל בהכרח להטרוגניות בגדלי EB. עובדה זו מובילה לשונות ביעילות בידול עם כמה שורות תאים, ובכך הופך את הניתוח שיטתי קשה, במיוחד בקנה מ...

hPSCs, המהווים עוברי מופקים תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (hiPSCs), הוא משמעות pluripotent שהם יכולים להצמיח שושלות תאים שונות במבחנת 1-2. סוגי תאים מובחנים רבים שנגזרים מhESCs עד כה, תומכים ברעיון כי התאים הללו מהווים כלים חשובים למחקר מדעי וגישות הקרנה מבוססות תאים, והבטחה עבור תרופות מבוססות תאים. פרוטוקולי בידול עצביים לhESCs הם בדרך כלל מורכבים ודורשים זמן רבים כפי שהם לעתים קרובות מבוססים על גורל 1 התרמה כולל עצבי, ואחרי בידוד ידני של אבות עצביים, ובידול מסוף רציף שסוג נוירון עניין מסוים 3-6. בהקשר מסוים, מורכבות זו אינה מפתיעה ובלתי נמנעת בהתחשב בכך שפרוטוקולי בידול מכוון כגון מדינה-of-the-art נוטים לחקות שלבי התפתחות אנושית מוקדמת, whicח הוא בעצמו מורכב ביותר. מצד השני, היא עשויה בחלקו גם משקפת חוסר ההבנה שלנו את התהליכים המולקולריים שבבסיס, וכתוצאה מפרוטוקולי בידול, כי הם עדיין רחוקים מלהיות מותאמים באופן מלא. בכל קשור להמרה של hPSCs עבר התמיינות לneuroectoderm, פרה et al. מצא כי דיכוי איתות BMP / SMAD1/5/8 משפר השראה עצבית של 7 hESCs. יתר על כן, איון של SMAD2 / 3 איתות הוכח לקדם היווצרות neuroectoderm 8. בהתאם לכך, בשילוב של איון שני מסלולים אלה נוטה להוביל להשראה עצבית יעילה יותר של hPSCs 4,9. לאחרונה, שהראינו כי מסלול איתות שלישית, FGF / ERK, משמש כמדכא חזקה של את הצעדים הראשונים של מחויבות neuroectodermal בhESCs. מנגד, דיכוי סימולטני של כל שלושה מסלולים אלו מובילים להמרה כמעט הומוגנית של hESCs לneuroectoderm עםבארבעה ימים בלבד 10. לאחר מכן, בידול מסוף היעיל ביותר לנוירונים פונקציונלי נצפה בתוך שמונה ימים. הנוירונים שהושגו היו עשויים להיות נוירונים חושיים של מערכת עצבים ההיקפית, שעשוי בחלקו להסביר הגזירה המהירה שלהם 10. ליקויים בתחזוקת נוירון חושית נחשבים סיבה להפרעות אדם מסוימות, כגון 11 דיסאוטונומיה משפחתית. לדוגמנות מחלות כאלה המבוססים על טכנולוגית hiPSC 12, לאפיון פונקציונלי נוסף, כמו גם למטרות שימושיות שלא דורשים כל סוג מסוים של תאי עצב, הליך הבחנה זו עשויה להציג בסיס שימושי. עם זאת, אסטרטגית הבידול העסקנו היווצרות מעורבת של גופים עובריים (EBS) במקור מגושים של מושבות hESC 10, וזה הביאה די מידת ההטרוגניות לגבי גדלי EB, והופיעה גם להתפשר יעילות היווצרות תא עצב בחלק ceקווי LL. יתר על כן, בשל ההטרוגניות בגדלי EB, היכולת השיטתית כדי לבחון השפעות של גורמי גדילה נוספים או מולקולות קטנות במהלך ואחרי היווצרות נוירון נראה היה מבולבלת במקצת. בדו&quot;ח זה, התאמן ההליך הקודם שלנו לטכניקה בינונית תפוקה תואמת, נאלצה צבירה מבוססת לייצר EBS באופן מאוד גודל מבוקר, כפי שהראה גם בהקשרים אחרים 13. כתוצאה מכך, נוצר EBS בבארות בצורת V של צלחות גם 96-הועברו לקובץ מצורף בצורת U נמוך במיוחד 96-גם צלחות, ליזום היווצרות neuroectoderm בהשעיה. ארבעה ימים לאחר מכן, EBS יכול להיות מצופה מהוליד הנוירונים נבדלים סופנים ביעילות גבוהה והומוגניות. לחלופין, יום-4 EBS היו ניתק לתוך תאים בודדים ומצופה כאמורים, אשר הביא monolayers צפיפות הנמוכה של תאי עצב אנושיים. תוצאות עקביות וכך התקבלו הרבה באופן עצמאי 2 דהקווים מבוקעים hESC, HuES6 וNCL3. כתנאי מוקדם, היווצרות EB המוצלחת הייתה בהחלט תלויה בשימוש בפולימר סינטטי, אלכוהול פוליוויניל (PVA), יחד עם מעכב ROCK Y-27632 הידועים כדי לקדם הישרדות hESC 13-14. כתוצאה מכך, ההומוגניות של EBS נוצרה ב96-V-צלחות היה משופר באופן משמעותי בהשוואה להיווצרות של EBS כתרבויות המוניות המבוססות על טכניקות פיצול אקראיות. מערכת זו ובכך מספקת פלטפורמה השתפרה באופן משמעותי להיווצרות neuroectoderm בתרבות השעיה, ואחרי היווצרות נוירון מבוקרת מאוד בתנאי חסיד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 354263 </td><td> ראה טקסט לפרטים על הטיפול </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> פולי (ויניל אלכוהול) </td><td> סיגמא </td><td> 363170 </td><td> ממס ב 0.4% בDMEM/F-12 באמצעות waterbath קולי / למנוע התחממות יתר / יכול להיות כל זמן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות </td></tr><tr><td> מוסף N2 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, לאחסן aliquots הקפוא </td></tr><tr><td> B27 מוסף </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 12587-010 </td><td> , חנות 50x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> שור הסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, חנות כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> L-גלוטמין עם פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Paa </td><td> P11-013 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> להמס ב10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב0.1% BSA / PBS =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> ROCK המעכב Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> עולים-129 </td><td> ממס ב 10 המ&quot;מ DMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Paa </td><td> H15-002 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Paa </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> 96-גם צלחות V-תחתונות </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> אקסון Medchem </td><td> אקסון 1408 </td><td> להמס ב0.5 מ&quot;מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> עולים-163 </td><td> להמס ב15 מ&quot;מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-200689 </td><td> להמס ב0.5 מ&quot;מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> צלחות התקשרות נמוכות במיוחד תחתונות U-96-היטב </td><td> קורנינג </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן טובולין בטא שלישי (עכבר) </td><td> סיגמא </td><td> T8660 </td><td> להשתמש ב1:1000 </td></tr><tr><td> נוגדן טובולין בטא שלישי (ארנב) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> להשתמש ב1:2000 </td></tr><tr><td> נוגדן BRN3A (POU4F1) </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-8429 </td><td> להשתמש ב1:500 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. &lt;/ Strong&gt; ריאגנטים וציוד ספציפיים. </td></tr></tbody></table>

rapid and efficient generation of neurons from human pluripotent stem cells in a multititre plate format

פרוטוקולים קיימים לדור של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם (hPSCs) הם לעתים קרובות מייגעים שבהם נהלים רבים שלבים המעורבים הבידוד וההתרחבות של תאים מבשרים עצביים, לפני ההתמיינות סופנית. בהשוואה לגישות זמן רב אלה, שמצאנו לאחרונה כי עיכוב משותף של שלושה מסלולי איתות, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 וFGF / ERK, מקדם אינדוקציה מהירה של neuroectoderm מhPSCs, ואחריו בידול מיידי לנוירונים פונקציונלי. הנה, יש לנו הנוהל שלנו הותאמו לפורמט צלחת multititre רומן, כדי לשפר עוד יותר את השחזור שלה וכדי לעשות את זה תואם עם יישומי אמצע תפוקה. היא כוללת ארבעה ימים של היווצרות neuroectoderm בתחומים צפים (גופי embryoid), ואחריו ארבעה ימים נוספים של בידול לנוירונים בתנאי חסיד. רוב התאים שהושגו עם פרוטוקול זה להיראות נוירונים חושיים דו קוטביים. יתר על כן,ההליך הוא יעיל ביותר, אינו דורש מיומנויות מומחה מסוימות, והוא מבוסס על מדיום הגדרה כימית פשוט עם מולקולות קטנות חסכוניות. בשל תכונות אלה, ההליך עשוי לשמש כפלטפורמה שימושית לחקירה פונקציונלית נוספת וגם להקרנה מבוססת תאים מתקרב דורש נוירונים חושיים אדם או נוירונים מכל סוג.

בדו&quot;ח הקודם שלנו, בקו אחד עם רבים אחרים, EBS מhPSCs יכול להיות שנוצר פשוט על ידי replating אגרגטים בזמן חלוקה שגרתית של hPSCs למאכלים-התקשרות נמוכה 10. בדרך כלל זה גורם הפצה רחבה של גדלים וכתוצאה EB (האיור 1C, למעלה). בעיה נוספת שנובעת מכך היא שמרה EBS בהשעיה נוטה לצבור...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format at JoVE.com

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

rapid-efficient-generation-neurons-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

43.5K Views.  Max Planck Institute for Molecular Biomedicine. פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

Video: Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

נביגה יעילה של<em&gt; שמר האפייה</em&gt; בתוך פורמט 96 multiwell

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...