עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF IOS 1121692, ועל ידי אוניברסיטת קרן המחקר של וושינגטון.

1. Follection ההפכפך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוגמה זו, אנו משתמשים בדגימות נדיפים ממ &#39; פרחי lewisii - יליד אלפיני פרחי בר בקליפורניה. נדיפים נאספים באמצעות שיטות ספיחה דינמיות לפי Riffell et al. 14. בקצרה, שיטה זו מעסיקה מערכת השמנת לולאה סגורה שבו פרחים מוקפים בשקית טפלון. שימוש במשאבת ואקום אינרטי, האוויר סביב הפרחים נשאב באמצעות &quot;מלכודת&quot; המורכבת מפסטר פיפטה מלאה Porapak Q מטריצה. אוויר ההחזרה מהמשאבה מסונן על ידי פחם פעיל. לאחר פרק זמן שנקבע, במקרה שלנו 24 השעות, Porapak Q מטריצת eluted עם הלא קוטבי ממס, בדרך כלל הקסאן, לאסוף את התמצית המרוכזת. אז התמצית מאוחסנת ב-80 ° C עד ניתוח. במידת צורך, דגימות יכולות להיות מרוכזות לקראת ניתוח תחת זרם של גז חנקן. אם המדגם הוא גם מאופיין כבר, לרוץ aliquot שלו דרךגז כרומטוגרף מסת ספקטרומטר (GC-MS) כדי לזהות רכיבים תנודתיים לפני שימוש במדגם. </li></ol> 2. הכנת אלקטרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כ 1 סנטימטר מהקצה של קצה פיפטה 1000 μl. הנח דבורה (רקפת Bombus) לבסיס של קצה פיפטה ודחף בעדינות לכיוון הקצה השני של הקצה עד שרק ראשו חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס שעוות שיניים ולעצב אותו סביב ראשו החשוף, ולוודא כי נדבק השעווה על העיניים המתחמות לביטחון וכדי שהראש של הדבורה נייחת לחלוטין. הקפד שלא לקבל כל שעווה על האנטנה של הדבורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שראשו כבר מובטח, להפוך את הכיכר, חתך, חלון דמוי לתוך כמוסת הראש באמצעות תער להב מפסק או בגודל מתאים אזמל כדי לחתוך את הציפורן. שימוש בלהב המפסק, להתחיל מהצד הגבי של כמוסת הראש, מייד מאחורי אחד האנטנה וסמוך לעיניים המורכבות. חותךקו ישר, מעין אחת למתחם העין המתחמת הנגדית. לאחר חיתוך קו ישר לעין המורכבת ההפוכה, להתחיל לבצע חתך dorsally עד עקומות ראש הקפסולה ומסתיימת באזור בית החזה שלה. בשלב זה, מתחיל לחתוך לכיוון הקצה השני של הקפסולה בראש. לבסוף, לאחר השורה נחתכה לקצה השני, לחתוך קו בחזרה למצב ההתחלתי של החתך הראשוני. חשוב להסיר את הציפורן שנמצאה בסמוך לאנטנה, כפי שזה יעכב את הכניסה של האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהציפורן היא לחתוך, השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את ציפורן הדבורה, שאמור לחשוף ואז המוח של הדבורה, וחשוב יותר, את אונות מחושים. מייד מתחיל superfusing המוח עם מלח חרקים, כך שהמוח אינו הופך מיובש. אחרי המוח חשוף, להשתמש בזהירות זוג מלקחיים עדינים מאוד כדי להסיר את נדן perineural מייד מעל אונות מחושים. להיות זהיר מאוד שלאלנקב המוח של הדבורה עם המלקחיים. </li></ol> 3. כרומטוגרפיה של גז עם הקלטה מרובים ערוצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבורה &quot;ההכנה&quot; - קבועה בצינור עם המוח שלה נחשף - עכשיו הוא מוכן להקלטת אלקטרו. הנח את הדבורה במלחציים, מחובר לבסיס מגנטי שנמצא על שולחן אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר שקית האינפוזיה, בקר זרימה, וצינור (מלא בתמיסת מלח חרקים) כך שמלוח ברציפות superfuses המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micromanipulator, אלקטרודה insertareference, עשוי חוטי טונגסטן, לתוך העין של הדבורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micromanipulator נפרד, הכנס אלקטרודה ערוץ רב, כגון tetrode מפותל תיל, או האלקטרודה רבה ערוצי סיליקון (טכנולוגיות Neuronexus), לאונות המחושים של הדבורה. אלקטרודה זו מחוברת למגבר מראש כגון סדרה של מערכת TDT S-3 Z למעבד bioamp Z-אוטובוס של מערכת TDT. פלט מהגז Chroהגלאי של matogram באמצעות כבל BNC מסוכך יכול להיות ממשק עם מערכת רכישת המגבר ונתונים כגון ששניהם אות העצבית ומסונכרנת GC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להמתין כ 30-60 דקות להקלטות העצביות לייצוב. ברגע שהפעילות ספונטנית ובצורת גל של יחידות בערוצי ההקלטה הפכו עקבית, השתמש במזרק ריח כדי לעורר את הדבורה ולבחון את התגובה של ערוצי ההקלטה לריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט קוצים תאיים מתאי עצב על ידי קביעת ערכי סף אוטומטי את ערוצי ההקלטה של ​​3.5-5 סיגמא של האות בערוצי ההקלטה הבודדים. thresholding הידני עשוי להידרש לערוצים מסוימים, כדי למנוע זיהום מרעש חשמלי. את פוטנציאל הפעולה מהנוירונים יופיע כקוצי מתח בערוץ ההקלטה. כאשר המתח של הערוץ עולה על הסף, המערכת אוגרת וחוסכת את כמה אלפית לפני ואחרי חציית הסף, ובכך לוקחתga Snap-זריקה של הגל, או ספייק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד בסמוך לשולחן האוויר הוא GC. לפני הזרקת התמצית הפרחונית לGC, לוודא שהשיטה לרמפת הטמפרטורה של ריצת GC היא נכונה. בדוגמא שלנו, אנו משתמשים בשיטת הטמפרטורה מתחילה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות אחרי עלייה של טמפרטורה בשיעור של 10 מעלות צלזיוס / דקה. עד 220 מעלות צלזיוס, שבזמן שאנו מחזיקים GC ל6 דקות נוספות. אנו משתמשים DB-5 עמודת GC (J &amp; W מדעי, פולסום, קליפורניה, ארה&quot;ב), עם הליום כגז המוביל. הכניסה היא splitless, עם טמפרטורה להגדיר עד 200 ° C. טמפרטורת גלאי להבת היינון מוגדרת עד 230 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק מדגם התמצית של אמיץ הפרחוני ליציאת ההזרקה המחוממת של GC לשחרר את נדיפים adsorbed לעמודת GC. השפכים מהעמודה מפוצלים 01:01 בין גלאי להבת היינון (FID) ואנטנת הדבורים באמצעות זכוכית &quot;Y&quot; מחבר (J &amp; W מדעי). בגין recציוד רפואי ומדעי מאלקטרודה כפי שאתה מזריק לתוך מדגם GC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ריצת GC סיימה, הניח להכנה במשך 5 עד 15 דקות. אז או להזריק דוגמה נוספת לGC או לעורר באמצעות הכנת תרכובות נדיפות בודדות או תערובות של תרכובות. בשיטה שנייה זה של גירוי ההכנה, פולסים של אוויר מזרם אוויר קבוע מופנים באמצעות מזרק זכוכית המכיל פיסת נייר מסנן שבו התרכובות הופקדו. גירוי הריח היה פעם באמצעות שסתום סולנואיד הופעל נשלט על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פעילות של יחידה מפסיקה לפתע או שינויים, בדוק את עירוי תמיסת המלח ולהניח להכנה במשך 15 דקות. אם הפעילות הספונטנית אינה להשיב את רמתה הקודמת ולאחר מכן את ההכנה אמורה להיות מושלכת ועוד דבורה בשימוש אם הוא זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי, לתקן את המוח עם 5% פורמלין למשך 20 דקות עם הבדיקה עדיין ברקמה. בשלב הבא, בלו המוחולמקם אותו בglutaraldehyde 2% ל 4 שעות, ולאחר מכן לעשות סדרת התייבשות אתנול מדורגת ולנקות את המוח עם סליצילט תיל. בהתבסס על התיקון והניקוי של רקמות, מקומות בAL בי האלקטרודות נקבה את הרקמה צריכה להיות ניכרת היטב על ידי מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים שנאספו לאחר הניסוי להפריד ולזהות את היחידות העצביות המוקלטות. השתמש בתוכנות טיפוסיות (סדרן מנותק, MClust, וSClust) לגל נפרד, או &quot;קוצים&quot;, המבוסס על צורות ספייק, כמו שיא או העמק אמפליטודה, חץ רוחב שיא, וכו &#39;, או באמצעים מופחתים (רכיבים עיקריים) 17 , 18 (איור 2). השתמש רק בצבירים אלה של קוצים שהפרידו במרחב תלת ממדי (PC1-PC3) ובחינה סטטיסטית שונה אחד מהשני (ANOVA הרב המשתנה, p &lt;0.05) (איור 2) לניתוח נוסף. עייןצל&quot;ש # של 17-19 לתיאור מלא של הקלטת tetrode ומתודולוגיות ספייק מיון-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצי חותמת זמן בכל אשכול, ולייצא נתונים אלה לניתוח באמצעות MATLAB או Neuroexplorer (טכנולוגיות Nex, ווינסטון סאלם, צפון קרוליינה) ליצירת חלקות רסטר ותגובות קצב ירי (איורים 2, 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את זמני השמירה של נדיפים תוך שימוש בנתוני GC נרשם בו זמנית. השתמש בזמני השימור של נדיפים, שנקבעו על ידי השיא של השיא מהכרומתוגרמה, לבחון תגובות יחידה בנקודתי הזמן אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון תגובות יחידה בודדות באמצעות הפעלת GC, ייפטר מספר הקוצים במרווחי 100 msec ולבחון את הזמן במהלך ירי תגובת שיעור תוך התייחסות לזמן השמירה של משחררי נדיפים. Binning שיבולים במרווחי 100 msec מספק מספיק פרטים, או אות, על הזמן כמובן של התגובה העצבית לodorant משחררים מGC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לExaלכרות את תגובות אוכלוסייה לנדיפים המשחררים השונים, לשלב את תגובות קצב הירי של יחידות בודדות מעל חלון 3 שניות דגימה, 1.5 שניות לפני, ו -1.5 שניות אחרי, זמן השמירה של נדיף (איור 3). פרק זמן זה הוא אופייני לתקופת משחררים הפכפכים מGC. אנחנו מראים ירי תגובות תעריפים, ביחידות על ידי קידוד צבעיהם (אדום הוא תגובת קצב ירי גבוהה; הכחול הוא תגובה נמוכה) וסידורם כמטריצת פעילות עם כל שורה מייצגת את התגובה להרכב שפכי GC (עמודות) ( איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+olfactory:+converging+evidence+for+common+principles+across+phyla.">Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla.</a> Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).</li><li>Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+effects+of+floral+scent+in+an+insect-plant+interaction.">Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).</li><li>Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).</li><li>Alarc&#243;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+between+visitation+and+pollen-transport+networks+in+a+California+plant-pollinator+community.">Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community.</a> Oikos. 119, 35-44 (2010).</li><li>Alarc&#243;n, R., Waser, N. M., Ollerton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Year-to-year+variation+in+the+topology+of+a+plant-pollinator+interaction+network.">Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network.</a> Oikos. 117, 1796-1807 (2008).</li><li>Riffell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+consequences+of+innate+preferences+and+olfactory+learning+in+hawkmoth-flower+interactions.">Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).</li><li>De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore-infested+plants+selectively+attract+parasitoids.">Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids.</a> Nature. 393, 570 (1998).</li><li>Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+reception+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature. 464, 66-71 (2010).</li><li>Turner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-prolonged+activation+of+CO2-sensing+neurons+disorients+mosquitoes.">Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes.</a> Nature. 474, 87-91 (2011).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1725 (2010).</li><li>Syed, Z., Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+measurements+from+a+moth+olfactory+system.">Electrophysiological measurements from a moth olfactory system.</a> J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).</li><li>Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+attractant+of+the+codling+moth:+characterization+with+electroantennogram+technique.">Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique.</a> Science. 174, 297-299 (1971).</li><li>Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+coding+of+behaviorally+significant+odor+mixtures.">Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures.</a> Current Biology. 19, 335-340 .</li><li>Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+correlates+of+behavior+in+the+moth+Manduca+sexta+in+response+to+complex+odors.">Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).</li><li>Raguso, R. A., Pellmyr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+headspace+analysis+of+floral+volatiles:+a+comparison+of+methods.">Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods.</a> Oikos. 81, 238-254 (1998).</li><li>Rodriguez-Saona, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore-induced+blueberry+volatiles+and+intra-plant+signaling.">Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling.</a> J Vis Exp. , e3440 (2011).</li><li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording:+tetrode+assembly.">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. , e1098 (2009).</li><li>Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+large-scale+neuronal+ensembles+with+silicon+probes+in+the+anesthetized+rat.">Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat.</a> J Vis Exp. , e3282 (2011).</li><li>Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+representation+of+olfactory+mixtures+in+the+honeybee+antennal+lobe.">Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe.</a> European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).</li><li>St&#246;kl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deceptive+pollination+system+targeting+drosophilids+through+olfactory+mimicry+of+yeast.">A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast.</a> Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).</li><li>Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elektrophysiologische+untersuchungen+von+chemo-+und+mechanorezeptoren+der+antenne+des+seidenspinners+Bombyx+mori+L.">Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).</li><li>Arn, H., St&#228;dler, E., Rauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroantennographic+detector:+a+selective+and+senstitive+tool+in+the+gas+chromatographic+analysis+of+insect+pheromones.">The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones.</a> Zeitschrift f&#252;r Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).</li><li>Schneider, D., Boeckh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rezeptorpotential+und+nervenimpulse+einzelner+olfaktorischer+sensillen+der+insektenantenne.">Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).</li><li>Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antennal+perception+of+oilseed+rape+Brassica+napus+(Brassicaceae)+volatiles+by+the+cabbage+seed+weevil+Ceutorhynchus+assimilis+(Coleoptera,+Curculionidae).">Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).</li><li>Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+of+natural+stimuli+in+the+rodent+main+olfactory+bulb.">Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb.</a> Neuron. 50, 937-949 (2006).</li><li>Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiking+patterns+and+their+functional+implications+in+the+antennal+lobe+of+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta.">Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> PLoS ONE. 6, e23382 (2011).</li><li>Syed, Z., Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+olfactory+response+of+Culex+mosquitoes+to+a+human-+and+bird-derived+attractant.">Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

התנהגויות חרקי חוש ריח בתיווך לנהוג תהליכים רבים ושונים, כולל רבייה, בחירת מארח אתר, וזיהוי משאבי מזון המתאימים. חקר התהליכים הללו מחייב את היכולת לזהות את נדיפים הנפלטים מהמקור, כמו גם את היכולת לזהות תרכובות אלו המתווכים את ההתנהגויות. מסבך עניינים הוא שריחות מורכבים מעשרות עד מאה הבודדות של תרכובות היוצרות שילוב ניחוח ייחודי שנתפס באופן שונה מהמרכיבים הבודדים 6,7,13,19,20. מחקר, שנערך בתחילה במערכת מין פרומו 12, ולאחרונה בריחות מזון והטלה הקשורות 13,20, הראה כי היעילות ההתנהגותי של התערובת מתגוררת כפונקציה של כמה נדיפים, מפתח בתערובת, ו כי התערובות לעורר תגובות התנהגותיות גבוהה משמעותיות מהמרכיבים הבודדים. לזהות את אלה מפתחמרכיבים הם אפוא מרכיב חשוב באקולוגיה הכימית של ימינו, כמו גם ריח נוירוביולוגיה. מגוון טכניקות שהתעורר בחמישים השנים האחרונות לזיהוי של תרכובות ביו שלנהוג התנהגות בחרקים. הטכניקה העיקרית לגילוי נדיפים ידי אנטנת החרקים היא גז כרומטוגרפיה electroantennography (GC-EAG). EAG פותח במקור על ידי 21 שניידר, שנרשם תנודות מתח קטנות בדרך כלל מניחים להיגרם על ידי depolarisations החשמלי של תאי עצב הרחה רבים בין הקצה ובסיס אנטנת חרקים בזמן הגירוי. EAG מאוחר יותר משולב עם GC לזיהוי מדויק של נדיפים אמיצים שיעוררו תגובות מחושים 12,22. בנוסף, ההקלטה של נוירונים הקולטן בודדים מאנטנת החרקים מאוחר יותר פתחה 11,23 ויחד עם GC לספק הקלטות חד sensillum, או GC-SSR.lthough GC-SSR הוא יותר זמן אינטנסיבי וקשה מאשר GC-EAG, את ההקלטות מספקות מידע על תגובות תא הבודדות באמצעות פוטנציאלי פעולה בתגובה לGC-שפכים, ומאפשרות זיהוי של קולטנים המתמחים לתרכובות מסוימות ה לא יכול להבחין 24 GC-EAG. GC-EAG וטכניקות GC-SSR להציע זיהוי של נדיפים אלה שיעוררו תגובות בפריפריה, ובכך מעורבים בקבלת odorant. טכניקות מאוחרות יותר החלו לבחון תגובות במערכת העצבים המרכזית של שני יונקים וחרקים, ולכן הם מעורבים בתפיסת odorant. טכניקות אלה נופלים תחת שתי קטגוריות רחבות: שיטות הדמיה 25 כינה GC-I (גז כרומטוגרפיה הדמיה) ושיטות אלקטרו ישירים (למשל GCMR). GC-אני וGCMR מציעים מספר יתרונות בגלל ההתכנסות של תאי העצב התחושתי להקרנה, או הפלט, נוירונים באל על, כמו גם ששיטות אלו מאפשרות לקבוע כיצד odorants מיוצג במוח החרק. יתר על כן, בשיטות דומות כיום בשימוש במוח של היונקים 25. למרות יתרונות אלה, GCMR וGC-אני מציע גם מגרעותיו. ניתוח נתונים יכול לגזול זמן רב, ובמקרה של GCMR, תחזיות גלומרולרי של היחידות העצביות המוקלטות אינן ידועות בשל היותם הקלטות תאיות. יתר על כן, אל על החרק מעוצבבים על ידי מספר סוגים עצביים שונים, כוללים נוירונים הקרנה (PNS) וinterneurons המקומי (LNS) ובכך הופך את זיהוי של היחידות הקשות המוקלטות. עם זאת, בעש, מ &#39; סקסטה, העבודה אחרונה הוכיחה שניתן לזהות PNS וLNS ידי התנהגות spiking של הנוירונים, ובכך מאפשרים לזיהוי סוגי תאי עצב אלה על ידי הפעילות הספונטנית שלהם 26. עם זאת, GCMR וGC-אני מאפשר זיהוי של odorants שactivatדואר נוירונים הקולטן ייחודיים שלא יכול לעורר תגובות חזקות EAG, כמו גם קביעה כיצד האוכלוסייה של תאי עצב במוח בתהליך נדיפים. מחקר שהשווה בין שיטות שונות אלו טרם נערך, למרות שהנתונים הראשוניים שלנו עולים כי GCMR עשויה להיות מתאים יותר מאשר GC-EAG לתרכובות שנמצאות ביו אך נמצאים ברמות קורט בתמצית (לא פורסמו תוצאות Riffell). עבודה עתידית עשויה לבחון את התחלופה ברגישות של גילוי odorants יו עם זמן הניתוח בין מתודולוגיות השונות. אמנם יש לנו התמקדנו כאן במפרט את שיטות assay אנו משתמשים לB. דבורי רקפת וריח ממ &#39; lewisii, התמצית ומיני החרקים משמשים יכולים להיות שונים אם שינויים מסוימים עשויים. מיני חרקים ניתן להציב לתוך פיפטה טיפים שונים (10-200 μl) בהתאם הגודל שלהם. מין גדול יותר, כמו הפרפר, Manducaסקסטה, ניתן להציב לתוך 6 בקבוקונים מדגמים מ&quot;ל. באופן כזה, ההכנה היא כל זמן בחיים ובכך לאפשר הקלטות יציבות כמה שעות בזמן. יחדיו, שיטות אנליטיות לבידוד של תרכובות יחד עם הקלטות אלקטרו בכלי חרקי המוח הנוכחיים הרבים העצמה לזיהוי תרכובות ביו, וכאשר משתמשים בו במקביל לניסויים התנהגותיים, עשוי להציג באמצעותו לקבוע נדיפים חשובים הלקשורה מזון התנהגויות בחרקים 13, כמו גם את אלה העוסקים במארח האתר 2, והתנהגויות הקשורות בדם מארח 27 שחשובים למזיקים ווקטורים של מחלה חקלאיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של פריט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Porapak סוג ש 80-100 רשת </td><td> ווטרס </td><td> WAT027060 </td><td></td></tr><tr><td> שקיות תנור ריינולדס </td><td> ריינולדס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GC </td><td> Agilent </td><td> 7820A </td><td></td></tr><tr><td> טור GC </td><td> J &amp; W מדעי, פולסום, קליפורניה, ארה&quot;ב </td><td> DB-5 (30 מ &#39;, 0.25 מ&quot;מ, 0.25 מיקרומטר) </td><td></td></tr><tr><td> גז מוביל הליום אנליטי </td><td> Praxair </td><td> הוא K </td><td> 1 סמ&quot;ק / דקה </td></tr><tr><td> האלקטרודה 16-ערוץ סיליקון </td><td> Neuronexus technologies </td><td> a4x4-3mm50-177 </td><td></td></tr><tr><td> NiCr פיין תיל, קוטר מ&quot;מ 0.012) </td><td> Sandvik Kanthal HP ריד </td><td> PX000004 </td><td> להכנת tetrodes וstereotrodes מותאם אישית </td></tr><tr><td> קדם מגבר </td><td> טאקר-דייוויס מערכת </td><td> PZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> מגבר </td><td> טאקר-דייוויס מערכת </td><td> RZ-2 </td><td></td></tr><tr><td> נתוני רכישת מערכה - OpenEx חבילה </td><td> טאקר-דייוויס מערכת </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תוכנה מקוונת מחודד מיון - SpikePac </td><td> טאקר-דייוויס מערכת </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תוכנה מנותקת מחודד מיון - ארגז כלי Mclust ספייק מיון- </td><td> הדוד Redish, מחלקה למדעי המוח, האוניברסיטהמינסוטה </td><td> הורדה חינם <a href="http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html" target="_blank">בhttp://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html</a> </td><td> MATLAB ארגז כלים </td></tr></tbody></table>

identification of olfactory volatiles using gas chromatography-multi-unit recordings (gcmr) in the insect antennal lobe

כל היצורים חיים בעולם מלא בגירויים חושיים שקובעים התגובה התנהגותית ופיזיולוגית שלהם לסביבתם. Olfaction חשוב במיוחד בחרקים, המשתמשים במערכות חוש הריח שלהם כדי להגיב, ולהפלות בין גירויי ריח, מורכבים. ריחות אלה לעורר התנהגויות אשר מתווכים תהליכים כגון רבייה ובית גידול בחירת 1-3. בנוסף, חישה כימית על ידי חרקי התנהגויות מתווכות שהם משמעותיים ביותר לחקלאות ולבריאותו של אדם, כוללים האבקה 4-6, תזונה צמחונית של גידולי מזון 7, והעברת מחל 8,9. זיהוי אותות ריח ותפקידם בהתנהגות חרקים כן חשוב להבנת שני תהליכים אקולוגיים ומשאבי מזון אדם ורווחתו. עד כה, זיהוי נדיפים המניעים את התנהגות חרקים כבר קשה ולעתים מייגע. טכניקות שוטפות כוללותהקלטת גז כרומטוגרפיה מצמידי electroantennogram (GC-EAG), וגז כרומטוגרפיה שילוב הקלטות sensillum יחידות (GC-SSR) 10-12. טכניקות אלה הוכחו כחיוניים בזיהוי של תרכובות ביו. אנחנו פתחנו שיטה שמשתמשת בגז כרומטוגרפיה מצמידה להקלטות אלקטרו מרובים ערוצים (מכונה &#39;GCMR&#39;) מתא העצב באונת המחושים (AL; מרכז ההרחה הראשוני של החרק) 13,14. טכניקה זו מדינה-of-the-art מאפשרת לנו לחקור כיצד מידע ריח מיוצג במוח החרק. יתר על כן, בגלל תגובות עצביות לריחות ברמה זו של עיבוד חוש ריח הן בגלל רגישות גבוהה למידת ההתכנסות של נוירונים הקולטן של האנטנה לנוירונים AL, הקלטות AL תאפשרנה זיהוי של רכיבים פעילים של ריחות טבעיים ביעילות וברגישות גבוהה. כאן אנו מתארים GCMR ולתת דוגמה לשימוש בו. כמה צעדים כלליים הם involVED בזיהוי של ביו נדיפים ותגובה של חרקים. נדיפים ראשונים צריכים להיות שנאספו ממקורות העניין (בדוגמה זו אנו משתמשים בפרחים מסוג פרח הקוף (Phyrmaceae)) ומאופיין במידת הצורך באמצעות טכניקות הסטנדרטיות GC-MS 14-16. חרקים מוכנים למחקר באמצעות נתיחה מינימאלית, לאחר שחוט רושם מוכנס לתוך אונת מחושים ורבי ערוצי הקלטה עצבית מתחילה. לאחר העיבוד של הנתונים העצביים ואז מגלה שodorants מסוים לגרום לתגובות עצביות משמעותיות על ידי מערכת העצבים של החרקים. למרות הדוגמא שנציג כאן היא ספציפית למחקרי האבקה, GCMR ניתן להרחיב למגוון רחב של אורגניזמים לימוד ומקורות נדיפים. לדוגמה, בשיטה זו ניתן להשתמש בזיהוי odorants מושך או דוחה חרקים ומזיקי וקטור צומח. יתר על כן, GCMR יכול לשמש גם כדי לזהות משיכה לחרקים מועילים, כגון פוllinators. הטכניקה עשויה להיות מורחבת לנושאים שאינם חרקים, כמו גם.

בבדיקה באמצעות GCMR מ &#39; ניחוח פרחוני lewisii, אנחנו מזריקים 3 μl של התמצית לGC. המספר הכולל של נדיפים משחררים דרך GC הוא בדרך כלל 60-70 נדיפים. הריח של מ &#39; lewisii מורכב בעיקר מmonoterpenoids, כולל myrcene β (אציקליים) וα-pinene, יחד עם שארית הריח המורכב מנדיפים שש פחמן, כגון 2-hexanol וsesquiterpenoids המרכיבים &lt;1% מאמיצים. GCMR מנצל את הרגישות של תאי עצב באונת מחושים כמו גם העיבוד העצבי של נדיפים ביולוגיים חשובים. עם זאת, הקלטות מרובות ערוצים מסוג זה, למעשה, לוקחים מדגם אקראי של תאי עצב באונת המחושים. הסיבה לכך היא שינויים קלים במיקום של עמדת הבדיקה בין הכנות שונות יכולים לגרום למערך ההקלטה לטעום נוירונים שונים. יתר על כן, את העמדות המדויקות ומוrphologies של הנוירונים המוקלטים אינם ידוע משום שההקלטה היא תאית. כדי להתאים לתופעות אלה, בדרך כלל להריץ ניסויי GCMR עם 8-16 הכנות, עם 8-18 יחידות עצביות בכל הכנה. לצורך ההמחשה, לעומת זאת, אנחנו נשתמש בנתונים מהכנה אחת בלבד (8 יחידות). מניסויי GCMR, מצאו כי יחידות הן סלקטיבית מפתיעה בתגובתם לנדיפים, כמתואר באיור 3 א. העקבות התחתונות (בשחור) מציינות הכרומתוגרמה היון, שבו שיא כל המקבילה תנודתי בהתחשב בכך שהוא מגיע לגלאי לאורך זמן. העקבות העליונות (כחול) מראות את תגובות קצב הירי של יחידה. תגובות יחידה חושבו על ידי binning את המספרים של דוקרנים המיוצרים במרווח 100 אלפיות שני, והחלוקה ידי שמסגרת זמן כדי לייצר קצב. בדוגמא, היחידה העצבית היא סלקטיבי בתגובה ל D-limonene. שים לב, כי ביחידה זו, firin הספונטנישיעור גרם עדיין יכול להיות משתנה ונתון לתנודות אקראיות. עם זאת, תגובות לD-limonene היינו הרבה מעל 95%, כפי שמחושבים על ידי השונות בתגובות קצב הירי לאורך זמן. לא כל היחידות, לעומת זאת, הגיבו לנדיפים משחררים מGC. למעשה, בממוצע כ 50% מיחידות שנרשמו בכל הרכב היו מגיבים (איור 3 ב &#39;). זה מפתיע בהתחשב במגוון של תרכובות נדיפות באמיצים הפרחוני המשחררים מGC. עם זאת, חלקם של יחידות שאינן מגיבים כלל בהרכב הוא עקבי מפתיע בין הכנות, כפי שנמצאו במחקרים קודמים, 13,14. מעבר לתגובות של יחידות בודדות, מערכת GCMR גם מאפשרת הניתוח של תגובות אוכלוסייה ברמה לodorants משחררים מGC. בדוגמא שמוצגת כאן, יש סלקטיביות הרכב חזקה לקבוצה של כמה odorants ( <sטרונג&gt; איור 3 ב &#39;). העלילה העליונה מראה הכרומתוגרמה עם כל שיא מקביל לodorant (ממוספר בציר ה-X). Odorants 33 ו35 (D-limonene, וטרנס β-ocimene, בהתאמה) לתגובות חזקות בהרכב, כפי שהוא מיוצג על ידי קצב הירי המנורמל של כל יחידה בהרכב (בסולם צבעים). <img src="/files/ftp_upload/4381/4381fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4381/4381fig1highres.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי של אמיץ את הספיחה ומערכת GCMR. (א) בסכמטית, פרח סגור בתוך שקית טפלון, ובאמצעות משאבת ואקום, האוויר מהשקית נשאב דרך מלכודת נדיף (Porapak ש) להתרכז נפלט נדיפים. האוויר מסונן וחזר לפרח הסגור. (ב) מדגם התמצית של אמיץ הפרחוני הוא להזריקאד GC והשפכים מהעמודה חצוי של הזרימה כזאת שנכנסה לגלאי יינון הלהבה של GC או, ובמחצית השנייה של השפכים מתבצעת על ידי העברת קו מחומם ומגיע במקביל באנטנה של הדבורה. פוטנציאל פעולה מההרכב העצבי AL נרשם ברציפות extracellularly במהלך 20 דקות של מסירת ריח באמצעות GC. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4381/4381fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/4381/4381fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4381/4381fig2highres.jpg" /> איור 2. מיון של יחידות הוקלט באמצעות מערך הקלטה רבה ערוצית (MR) באל של הדבורה. שני אנקס הם מרווחים באופן שהמערך מקיף נפח גדול של אל. () אופייני צורת הגל (לדוגמא מגבר<html> litude, עמק) של כל אחד &quot;ספייק&quot; בהקלטת tetrode ניתן להתוות בחלל תלת ממדים. בדוגמא שמוצגת כאן, הגובה של כל ספייק ב3 של 4 ערוצי ההקלטה זמם ב 3-D. מכיוון שכל יחידה תהיה צורת ספייק שלו, את הקוצים מיחידה נתונה אשכול יחד, ובכך מאפשרים ליחידות להיות מזוהות וממוינים אחד מהשני. יחידות מיון הראו הבדלים ברורים בתגובות ירי (B; עלילת רסטר) וצורת גל (C) מיקום של ארבעת הערוצים בכל שוק שמספקים הקלטה של אזורים רחבים בעיבוד glomeruli וneuropil. פעילות עצבית נרשמה בכל אחד מארבעת הערוצים, זמם בחלל 3-ממדי (כפי שמוצג ב), ומסודר על פי מאפייני צורת גל. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4381/4381fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> דרכים &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4381/4381fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4381/4381fig3highres.jpg"/> איור 3. () ירי היסטוגרמות שיעור של תגובות יחידה לתרכובות משחררים ממ &#39; lewisii אמיץ את התמצית (3 הזרקת μl) (עקבות תחתונות, שחור). odorants מסוים (לדוגמא D-limonene; חץ אדום) עורר תגובות משמעותיות ביחידות (ב &#39;) תגובה של כל היחידות שנרשמו מMR לכל odorant eluted מGC.. עלילת המשטח מקודדת באמצעות צבע בהתאם לתגובות קצב הירי המנורמלות של היחידות הבודדות. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4381/4381fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe at JoVE.com

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

רמזי ריח לתווך התנהגויות רבות ושונות בחרקים, ולעתים קרובות הם תערובות מורכבות מורכבות מעשרות עד מאה תרכובות נדיפות. שימוש בגז כרומטוגרפיה עם הקלטה רבה ערוצית באונת מחושי החרקים, אנו מתארים שיטה לזיהוי של תרכובות ביו.

זיהוי נדיפים חוש ריח באמצעות קלטות כרומטוגרפיה-Multi-יחידת גז (GCMR) באונת מחושי החרקים

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

identification-olfactory-volatiles-using-gas-chromatography-multi

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

14.2K Views.  University of Washington. רמזי ריח לתווך התנהגויות רבות ושונות בחרקים, ולעתים קרובות הם תערובות מורכבות מורכבות מעשרות עד מאה תרכובות נדיפות. שימוש בגז כרומטוגרפיה עם הקלטה רבה ערוצית באונת מחושי החרקים, אנו מתארים שיטה לזיהוי של תרכובות ביו.

Video: Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

באמצעות חיישני Electroantennogram חרקים על אוטונומי רובוטים לחיפושי חוש הריח

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

קביעת תא קולטת אור הרגישות ספקטרלית במודל חרקים מן<em&gt; In vivo</em&lt;הקלטות תאיות

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Insect-controlled Robot: A Mobile Robot Platform to Evaluate the Odor-tracking Capability of an Insect

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor sources is an essential task for organism survival. Insects are well-studied organisms with regard to odor tracking, and their behavioral strategies have been applied to mobile robots for evaluation. This "bottom-up" approach is a fundamental way to develop biomimetic robots; however, the biological analyses and the modeling of behavioral mechanisms are still ongoing. Therefore, it is still unknown how such a biological system actually works as the controller of a robotic platform. To answer this question, we have developed an insect-controlled robot in which a male adult silkmoth (Bombyx mori) drives a robot car in response to odor stimuli; this can be regarded as a prototype of a future insect-mimetic robot. In the cockpit of the robot, a tethered silkmoth walked on an air-supported ball and an optical sensor measured the ball rotations. These rotations were translated into the movement of the two-wheeled robot. The advantage of this "hybrid" approach is that experimenters can manipulate any parameter of the robot, which enables the evaluation of the odor-tracking capability of insects and provides useful suggestions for robotic odor-tracking. Furthermore, these manipulations are non-invasive ways to alter the sensory-motor relationship of a pilot insect and will be a useful technique for understanding adaptive behaviors.

The capability to localize an odor source is necessary for insect survival and is expected to be applicable to artificial odor-tracking. The insect-controlled robot is driven by an actual silkmoth and enables us to evaluate the odor-tracking capability of insects through a robotic platform.

חרקים שבשליטת רובוט: פלטפורמת רובוט נייד על מנת להעריך את יכולת ריח המעקב של חרק

Robotic odor source localization has been a challenging area and one to which biological knowledge has been expected to contribute, as finding odor ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Investigating Object Representations in the Macaque Dorsal Visual Stream Using Single-unit Recordings

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined curved surfaces, and images of real-world objects (with and without disparity) in a similar manner as described in the ventral visual stream. In addition, parieto-frontal areas are believed to convert visual object information into appropriate motor outputs, such as the pre-shaping of the hand during grasping. To better characterize object selectivity in the cortical network involved in visuomotor transformations, we provide a battery of tests intended to analyze the visual object selectivity of neurons in parieto-frontal regions.

A detailed protocol to analyze object selectivity of parieto-frontal neurons involved in visuomotor transformations is presented.

חוקרים ייצוגי האובייקט בזרם Visual הגבי מקוק באמצעות הקלטות יחיד-יחידה

Previous studies have shown that neurons in parieto-frontal areas of the macaque brain can be highly selective for real-world objects, disparity-defined ...