עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן, CA131967.

1. התאגדות BrdU (סימון מסוף) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט לכ 70% במפגש 24 שעתי 150 מ&quot;מ רקמת תרבות צלחת לפני התוספת של BrdU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת עם תקשורת מלאה טריה המכילה 20 מיקרוגרם / המ&quot;ל BrdU (סיגמא) בנקודתי זמן מתאימות לפני הקציר. אורכם של תאים בתרבית בזמן שתקשורת עם BrdU ישתנה עם סוג תא ומין, בדרך כלל שלב G2 נמשך בין 2 ל 5 שעות (איור 1). </li></ol> 2. קציר כרומוזום תרבויות תאי Monolayer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת תרבות מהצלחת ולאסוף 10 מ&quot;ל בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ&quot;ל. השלך תקשורת נותרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ&quot;ל Versine [או HBSS (סיגמא)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מ&quot;ל טריפסין 0.25% 5 בVersine (או HBSS) לצלחת. דגירה בטמפרטורת חדר עד שתאים מנותקים מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעית התא trypsinized לצינור המכיל 10 מ&quot;ל של תקשורת מצעד 2.1. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 400 למשך 10 דקות לגלולת התאים. לשאוב supernatant, והשאיר 0.5 מ&quot;ל של תקשורת בתוספת התא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ביסודיות על ידי pipetting עם פסטר פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 טיפין של תמיסת hypotonic (0.075 M KCl (סיגמא) חמם עד 37 מעלות צלזיוס): מערבב את השעית התא עם פסטר פיפטה. הוסף פתרון hypotonic מ&quot;ל 0.5 ולערבב שוב עם פסטר פיפטה. להביא נפח של פתרון hypotonic עד 5 מ&quot;ל ומערבב שוב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-45 דקות, תלוי בסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 400 למשך 10 דקות. לשאוב supernatant, והשאיר 0.5 מ&quot;ל של תקשורת בתוספת התא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול ידי מצליף את הצינור בעדינות. התאים אוסמוטי הנפוחים יהיו שבירים בנקודה זו, ולכן יש להיזהר שלא לפגוע בקרומי cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 טיפין (החומצה אצטית קרחונית 01:03: מתנול) של Carnoy מקבעת; לערבב ידי pipetting בעדינות עם פסטר pipettדואר. הוסף מקבע ותמהיל מ&quot;ל 0.5 על ידי pipetting בעדינות עם פסטר פיפטה. הבא נפח מקבע ל5 מ&quot;ל ולערבב שוב על ידי pipetting בעדינות עם פסטר פיפטה. תאים קבועים ניתן לאחסן בחושך ב -20 ° C למשך מספר חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ולשאוב כמו בשלב 2.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלול ב מקבע טרי; לאמוד את ההיקף של הגלולה ותוספת ~ 10x הנפח מקבע של Carnoy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעית התא נפתח החכמה על שקופיות מיקרוסקופ רטובות, קרות כקרח, להחזיק את השקופית ב~ זווית 45 מעלות ומאפשר השעית התא לזרום על פני השטח של השקופית. הנח את השקף והמבול השטוח על מגבות נייר השקופית עם מקבע ומאפשר לייבוש באוויר. בדקו שקופיות לנוכחות של ממרחי mitotic באמצעות מיקרוסקופ הפוך. </li></ol> 3. טיפול RNase והתייבשות אתנול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl המקום של 10 מיקרוגרם / מיליליטר RNase (סיגמא) ב2x SSC לכל שקופית; לדגור על 37 ודהז; צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפים מחליקים 3 פעמים עם 2x SSC, 7.0 pH בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש שקופיות באמצעות סדרת EtOH (סיגמא) (70%, 90% ו 100%) בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש את השקופיות בטמפרטורת חדר. </li></ol> 4. הכנת קוקטיילים לבדיקת BAC פלוס הפקידה Probe centromere כרומוזום ספציפי (CEP) או לצבעי כרומוזום שלמים כלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכלאת סימולטני BAC / CEP, להכין שני קוקטיילי בדיקה נפרדים עבור מראש הכלאה. אנחנו גילינו שטרום הכלאה-בדיקות BAC וCEP בנפרד במסגרת תוצאות חומרות שונות ברקע פחות ועוצמת אות גדולה יותר. גם אנחנו גילינו שFosmids הבודד יכולה לשמש גם במקום של שיבוטי BAC. ניסוח הקוקטייל יתואר להלן מייצג את הכרכים עבור שקופית אחת. אם עיבוד שקופיות מרובות המשתמשות באותן בדיקות פשוט להגדיל appropr הכרכים<html> iately. * קוקטייל בדיקת DNA BAC: חיץ ההכלאה μl 11.5 (פוראמיד 50% (סיגמא) / סולפט 2x SSC / dextran (סיגמא)) 2 μl DH 2 O 2.5 BAC/Cot1 DNA μl בDH 2 O (ראה בהמשך לתיוג פרוטוקול) 15 נפח כולל μl * קוקטייל CEP בדיקה: חיץ 7 μl CEP הכלאה (65% סולפט Formamide/2x SSC / dextran) 2 μl DH 2 O דנ&quot;א 1 μl CEP/Cot1 (נרכש prelabeled עם ספקטרום Orange/Cy3/Texas אדום) 10 נפח כולל μl * לאחר denaturing והכלאה מראש (צעד 5.1) תמהיל BAC חללית עם CEP חללית במהירות של 25 קוקטיילי יחס 03:02 μl / שקופיות ותמהיל בדיקה. או </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20 μl / שקופית של חללית צביעת כרומוזום שלמה (Cy3/Texas האדום) לתוך צינור. המשך אל denaturation וצעד מראש הכלאה. </li></ol><html> &quot;&gt; 5. שקופיות וdenaturation Probe וכלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל חללית קוקטייל (הים) ב 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. טרום להכליא על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר Cot1 DNA כדי להכליא לרצפים חוזרים ולמנוע הכלאה לאחר metaphase כרומוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לפגל בצנצנות Coplin ב70% Formamide/2x SSC, 7.0 pH ב 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מייבש שקופיות באמצעות EtOH סדרה (70%, 90% ו 100%) בצנצנות Coplin ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את השקופיות לייבוש באוויר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות טרום חמות עד 45 מעלות צלזיוס בשקופית חמה עבור 10 הדקות האחרונות של טרום hybridzation (שלב 5.1) הבדיקה. לערבב קוקטיילי בדיקה מראש הכלאה במידת הצורך ולהוסיף 25 ul לכל שקופית, מניח בעדינות coverslip בכל שקופית וחותם לאורך כל הקצוות עם מלט גומי. דגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified כדי למנוע אידוי. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. הכלאת הודעת שוטף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות בצנצנות Coplin 3 פעמים ב50% formamide/2x SSC, 7.0 pH ב 38-40 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כל אחד. הטמפרטורה של הכביסות שעשויה להשתנות בין בדיקות. אם יש הכלאת רקע גבוהה אתה יכול להעלות את הטמפרטורה של הכביסות. לעומת זאת, אם האות היא קלושה ואין רקע אז אתה יכול להקטין את הטמפרטורה של שטיפות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפים מחליקים פעם 1 בחיץ PN בטמפרטורת חדר עבור 3 דקות, ולהמשיך לשלב איתור BrdU. </li></ol> 7. BrdU איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות בלוק עם חיץ PNM למשך 10 דקות (200 μl / שקופיות) בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן שקופיות על ידי הפעלת יתרון על מגבת נייר. הוסף 100 μl של אנטי-BrdU FITC (50 מיקרוגרם / מיליליטר רוש או Millipore) בחיץ PNM למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 3 פעמים בחיץ PN בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקזחיץ PN עודף על שקופיות אחד בכל פעם על ידי הפעלת יתרון על מגבת נייר. הוסף 20 DAPI μl / הרכבת פתרון antifade (Invitrogen). כסה את השקופית עם מגבת נייר ולחץ כלפי מטה על coverslip כדי לאלץ את בועות אוויר ופתרון הרכבה עודף. המשך לניתוח תמונה. </li></ol> 8. לכידת תמונות וכימותי התאגדות BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שנתפסו עם מיקרוסקופ אולימפוס BX61 פלורסנט ואולימפוס מצלמת CCD, גלגל לסנן-100x אובייקטיבי, אוטומטי ותוכנת Cytovision (יישומי הדמיה). BrdU הוא נתפס באמצעות מסנן FITC; צבעי כרומוזום (טקסס אדומה, Metasystems או Cytocell), בדיקות CEP (Vysis הספקטרום אורנג&#39;) BAC של (Cy3) ונתפסו באמצעות טקסס אדומה או Cy3 מסנן; DAPI הוא נתפס עם DAPI מסנן (ראה איורים 2 ו 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומוזומים בודדים של עניין מזוהים עם BAC / CEP או בדיקות ספציפיות לכרומוזום צבע (איורים ו2B 3B). ניצולתוכנת Cytovision, כל כרומוזום של ריבית היא &quot;לחתוך החוצה&quot; מהתפשטות metaphase כמכלול, קו נמשכת דרך לאורכו של כרומוזום מזרוע קצרה לזרועו ארוכה (תרשימים ו2C 3C). תוכנת Cytovision משמשת לכימות פרופיל עוצמת פיקסל לאורכו של כל כרומוזום. תוכנת Cytovision מחשבת את השטח שעליו את הפיקסלים ומכמתת את עוצמת פיקסלים המיוצגים על ידי אותות BrdU או DAPI על כרומוזום אחד מבודד. עוצמת פיקסל הממוצעת המיוצגת על ידי כל כרומוזום אז מוכפל בשטח שנכבש על ידי אלה פיקסלים להשיג את המספר הכולל של פיקסלים (טבלה 1 ואיור 4). בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר להדמיה של האזורים משכפלים האחרונים של כרומוזומים. בהתאם לכך, הדפוס התאגד התאגדות BrdU מאפשר זיהוי של אזורים פעילים משכפלים של כרומוזומים, והבדלים בעיתוי שכפול בין chromosזוגות Ome נתפסים כהבדלים בדפוס פסים זה (איורים 2 ו 3). לבסוף, הבדלים אלו בדפוסים מחייבים ניתן להשוות את מפות עיתוי שכפול ידוע לכל כרומוזום 6,7, המאפשר לאומדן פרש העיתוי שהכפול בין כרומוזומים הומולוגיים או זרועות כרומוזום 4. לדוגמה, 2 של כרומוזום 6 באיור 3 א מציגים את הבדל בדפוס פסים&gt; 2 שעות בהשוואה לעיתוי השכפול הנורמלי של כרומוזום 6 4. בנוסף, הליך דומה לזה שתואר כאן כבר השתמש בהצלחה ללימודי עיתוי השכפול אסינכרוני בין כרומוזומי X הפעיל ואקטיבי 8,9. את כרומוזומי X הפעיל ולא הפעיל זוהה באמצעות צבעי כרומוזום X. תמונות נרכשו באמצעות שנינויות mFISH תוכנה (Vysis) ומספר הפיקסלים שנכבשו על ידי כרומוזומי X ואת מספר הפיקסלים שנכבשו על ידי fluorescently labeled BrdU היה אז מחושב באמצעות NIH תמונה <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html).</a> </li></ol> 9. ניק תרגום של BAC DNA לניאון תיוג (Vysis) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תערובת החללית הבאה לצננתי צינור microfuge: 70 μl (4-DNA מיקרוגרם) בDH 2 O 10 μl .2 mM dUTP-כתום או ירוק 20 μl .1 mM dTTP הצפת 20 μl 10x ניק תרגום 40 NT dNTP של μl (מינוס dTTP) אנזים תרגום הכינוי μl 40 200 נפח כולל μl דגירה @ 16 ° CO / נ עצור תגובה על ידי חימום על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צ&#39;יל על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרז את ה-DNA עם אתנול על ידי הוספה הבאה לתמהיל הבדיקה: פתרון חללי 200 μl 48 μl M 3 NaOAc 160 Cot1DNA μl (0.25 מיקרוגרם / ul) 1200 100% EtOH μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספיןn קר ב12000 XG במשך 20 דקות. למזוג את EtOH. שטוף זמן 1 עם EtOH 70%. ספין כמו קודם. למזוג את EtOH. אוויר יבש רק עד מתאדה EtOH. Resuspend ב 40 μl DH 2 O לריכוז סופי של 100 ng / μl של BAC-DNA. </li></ol>

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכנת ממרחי כרומוזום היא שלב קריטי להצלחת בדיקת שכפול עיתוי שתואר כאן. הכללתו של צעד מקדים colcemid לפני טיפול hypotonic עשויה לסייע בתדירות ובהפצה של תאי mitotic. אנחנו בדרך כלל לחשוף תאים לcolcemdi עבור 1-3 שעות לפני הקציר, ולהשתמש colcemid בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. עם זאת, הכללתו של צעד מקדים colcemid רשאי לשנות את אורכו של G2 וכתוצאה מכך עשוי לשנות את התזמון לכאורה שכפול והמצב של עיבוי הכרומוזומים 3. הליך זה יכול להיות מיושם על סוגים רבים ושונים של תאים ומינים על ידי שינוי האורך של דגירת BrdU, אשר תלוי משך מחזור התא. לשורות תאי אדם ועכבר ביותר, שלב G2 הוא בדרך כלל 3-6 שעות, ולכן טיפולי BrdU הם בדרך כלל בטווח זה. חלופה לBrdU היא 5-ethynyl-2&#39;deoxyuridine (edu) וגילויה לאחר מכן באמצעותיזיד ניאון &quot;, ותגובת לחץ כימיה&quot; 10. ערכת זיהוי החינוכית יש מספר יתרונות על פני ערכת זיהוי BrdU. לדוגמה, זיהוי של edu אינו דורש קיבוע מדגם או denaturation-DNA. לפיכך, השימוש בedu לעיתוי שכפול תחת יכול להיות בשילוב עם טכניקות פשוטות G-התקבצו במקומם של דגים כדי לזהות את הכרומוזומים של עניין. פרוטוקול עיתוי השכפול המתואר כאן תוכנן במיוחד לשלב assay S מאוחר בתוספת כל סינתזת דנ&quot;א פולשת לתוך G2. בנוסף, שכפול הדנ&quot;א ניתן לפקח בכל שלב S באמצעות הליך זה על ידי שימוש (15-30 דקות) פולסים קצרים של BrdU אחריו מרדף תקופות ארוכות יחסי של 6-10 שעות. זה מאפשר להדמיה של התאגדות BrdU בשניהם מוקדם ו-S-שלב ביניים. לדוגמה, שחלופי כרומוזום מסוימים גידול נגזרו מעוכבים הוא בייזום והביצוע של סינתזת דנ&quot;א לאורך כל אורכו של הכרומוזומים 3 </sup&gt;. אחד יתרונות של הליך עיתוי השכפול הזה הוא שעיתוי שכפול זה מבחנים בתאים בודדים. לכן, יש לו את היכולת לזהות הבדלים בעיתוי שכפול בין כרומוזומים הומולוגיים כלולים בתוך אותו התא. אמנם יש הליכים אחרים, למשל. עיתוי שכפול כלאה באתר (ReTiSH; 11), שיש לו את היכולת לזהות הבדלים בעיתוי שכפול בין אללים בלוקוסים ספציפיים על כרומוזומים הומולוגיים, התהליך המתואר כאן יכול לזהות הבדלים בעיתוי השכפול לאורך כל אורכו של כרומוזומים. בנוסף, הליך זה יכול assay הבדלים בעיתוי השכפול של כרומוזומים שנמצאים רק בחלק מתאים של אוכלוסייה 3. לדוגמה רבות שורות תאי סרטן ודגימות גידול ראשוניות מכילים שחלופי כרומוזום שנמצאים בפחות מ 50% מתאים. אנחנו משתמשים כרגע בהליך זה כדי כרומוזומים assayבדגימות גידול ראשוניות, והיה מסוגל לזהות שכפול אסינכרוני בין הכרומוזומים בדוגמאות רבות. עם זאת, בהתחשב בכך שדגימות גידול ראשוניות יש מספר מצומצם של דמויות mitotic, כשליש מהתרבויות העיקריות לא הצליח לתת מספרים מספיקים של ממרחי mitotic. יתרון נוסף שהליך זה יש מעל microarray או רצף מבחנים מבוססים הוא שכרומוזומים בודדים assayed לא דנ&quot;א immunoprecipitated מברכות של תאים. במבחני immunoprecipitation מבוססי פולימורפיזמים חייבים להיות מזוהים וקשור לאללים ספציפיים כדי להבדיל בין עיתוי שכפול אללים. יתר על כן, עם ההכרה כי רבים תאים סרטניים מכילים שחלופים רבים כרומוזום 12, והתצפית שמתח שכפול הדנ&quot;א קשור לחוסר יציבות גנומית בתאים סרטניים 13, אנו מאמינים כי פרוטוקול זה הוא f כלי שימושית ופשוטהאו הניתוח השגרתי של עיתוי השכפול של הכרומוזומים בתאים סרטניים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> הרוש Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 מיקרוגרם / μl </td></tr><tr><td> ניק תרגום קיט </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרום אורנג&#39; dUTP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> משתנה </td><td></td></tr><tr><td> חיץ הכלאת LSI / WCP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ הכלאת CEP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> כרומוזום פאיNTS </td><td> MetaSystems הקבוצה </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> אולימפוס BX61 מיקרוסקופ פלורסנט </td><td> אולימפוס </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת תוכנת הדמית מיקרוסקופ </td><td> יישומי הדמיה </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> אולימפוס </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> במתכוני כלאה באתר פתרוני פוראמיד 70% Formamide/2x SSC 35 מ&quot;ל פוראמיד * (סיגמא) 10 המ&quot;ל SSC 10x 5 המ&quot;ל ד 2 H 2 0 pH ל -7.0 עם HCl (סיגמא) * חשוב להשתמש פוראמיד כי אוחסן ב -20 ° C. אחסון בטמפרטורת חדר ממושך יפיק חומצה פורמית והחומציות wחולה להיות נמוך מדי. 50% Formamide/2x SSC 25 פוראמיד מ&quot;ל (סיגמה) 10 המ&quot;ל SSC 10x 15 המ&quot;ל DH 2 O pH ל -7.0 עם HCl (סיגמא) 20x SSC, 4 L 702 גרם NaCl (סיגמא) 358 גרם Na ציטראט (סיגמא) DH 2 O לנפח PN מאגר [0.1 מ &#39;NaP0 4 0.1% NP_40 (סיגמא)] הפוך פתרון 0.1 מ &#39;כל אחד פוספט נתרן (המסנן לעקר ולאחסן ב500 aliquots מ&quot;ל). 0.1 מ &#39;Nah 2 P0 4, 1 ליטר 13.8 גרם לאא 2 P0 4 (סיגמא): DH 2 O לנפח 0.1 מ &#39;Nah 2 P0 4 1 ליטר </strאונג&gt; 14.2 גרם לאא 2 P0 4 (סיגמא) DH 2 O לנפח. PN: התאם את ה-pH של 0.1 מ &#39;Na 2 HP0 4 ל-pH 8.0 עם .1 M nah 2 P0 4. סנן לעקר ולהוסיף 1 מ&quot;ל של NP-40. PNM 50 מ&quot;ל 1.25 גר &#39;אבקת חלב ללא שומן (סיגמא) 25 מ&quot;ל PN חיץ (מתכון לעיל) מערבב לדקות 15-20 עם ערבוב מתמיד. ספין 2 פעמים ב 400 XG למשך 10 דקות. השתמש supernatant, ולוודא שלא להפריע חלבוני חלב זרזו. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

שכפול הדנ&quot;א יונקים יוזם באתרים מרובים לאורך הכרומוזומים בזמנים שונים במהלך שלב S, בעקבות תכנית שכפולה של זמן. המפרט של עיתוי שכפול הוא חשב להיות תהליך דינמי מוסדר על ידי רמזי רקמות ספציפיות והתפתחותית המגיבים לשינויי epigenetic. עם זאת, המנגנונים המסדירים היכן ומתי שכפול הדנ&quot;א יוזם יחד הכרומוזומים נשארו הבינו היטב. הומולוגי כרומוזומים בדרך כלל לשכפל סינכרוני, עם זאת יש יוצאים מן הכלל בולט לכלל זה. לדוגמה, בתאי יונקים ממין נקבה אחד משני כרומוזומי X הופך מאוחר משכפל באמצעות תהליך המכונה איון X 1. יחד עם זה עיכוב בעיתוי שכפול, מוערך 2-3 שעות, הרוב המכריע של גנים הופכים השתיק תעתיק על כרומוזום X אחד. בנוסף, מוקד דיסקרטי cis טווח, ידוע כמרכז איון X, מסדיר תהליך איון X זה, לרבות האינדוקצית דואר של עיתוי שכפול מתעכב על כרומוזום X הפעיל כולו. בנוסף, שחלופי כרומוזום מסוימים הנמצאים בתאים סרטניים ותאים שנחשפו לקרינה מייננת להציג עיכוב משמעותי בעיתוי שכפול של&gt; 3 שעות שמשפיעה על כל כרומוזום 2,3. העבודה אחרונה מהמעבדה שלנו מצביעה על שיבוש זה של דיסקרטי cis-מתנהג תוצאת לוקוסים אוטוזומלית בפנוטיפ משכפל מאוחר מאוד המשפיע על 4 כרומוזום השלמים. מחקרים &#39;הנדסי כרומוזום&#39; נוספת מצביעים על כך ששחלופי כרומוזום מסוימים המשפיעים על תוצאת כרומוזומים שונות רבה בפנוטיפ הנורמלי זה שכפול עיתוי, מצביעים על כך שכל הכרומוזומים היונקים מכילים לוקוסים בדידים cis-הפועלים ששולטים עיתוי שכפול תקין של כרומוזומים בודדים 5. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח כמותי של עיתוי שכפול כרומוזום בשילוב עם ניאון כלאה באתר. זהשיטה מאפשרת השוואה ישירה של עיתוי שכפול בין כרומוזומים הומולוגיים באותו התא, והותאמה מ 6. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי חד המשמעי של שחלופי כרומוזומליות הקשורים לשינויים בעיתוי שכפול המשפיעים על כל כרומוזום. לשיטה זו יש יתרונות על פני מערך מייקרו תפוקה גבוה פתח לאחרונה או רצף פרוטוקולים שלא מבחינים בין האללים הומולוגיים להציג מחדש ובבטלו מחדש-כרומוזומים. בנוסף, בגלל השיטה המתוארת כאן מעריכה תאים בודדים, זה יכול לזהות שינויים בעיתוי שכפול כרומוזום בשחלופים בכרומוזומים שנמצאים רק בחלק מהתאים באוכלוסייה.

דוגמה לניתוח תזמון השכפול לכרומוזום אנושי 6 מוצגת באיור 2. תאים המכילים מחיקה של ASAR6 הגן 4, הממוקם ב6q16.1, נחשפו לBrdU במשך 5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד לדגים עם בדיקת כרומוזום 6 צבע (Vysis) וכן שילוב BrdU. שים לב שיש הבדל משמעותי בדפוס פסי BrdU בין 6 של שניים, שעולה בקנה אחד עם עיכוב בעיתוי שכפול של&gt; 2 שעות לאחד מכרומוזום 6 של [ראו סעיף 4 לעיתוי שכפול banding דפוס של כרומוזום 6 לפני המחיקה]. בנוסף, יש הבדל משמעותי בסכום הכולל של התאגדות BrdU (פיקסלים) בהשוואה לניתוח דומה של כתמי DAPI (האיור 2D). דוגמה נוספת לניתוח תזמון השכפול לכרומוזום אנושי 6 מוצגת באיור 3. תאים המכילים את הסםמחיקת דואר של ASAR6 הגן 4 יוצגו אם האיור 2 נחשפו לBrdU במשך 5 שעות, שנקטף לתאי mitotic ומעובד לדגים עם כרומוזום 6 CEP בדיקת תוספת BAC מכיל ASAR6 הגן וכן שילוב BrdU. שים לב שנמחק כרומוזום 6 (Δ6) מציג שילוב יותר BrdU ודפוס banding מורחב יותר התאגדות BrdU מאשר כרומוזום שאינם נמחק-6. ממרחי mitotic מ7 תאים שונים עובדו כבאיור 3 ואת פרופילי פיקסל עבור שניהם DAPI וBrdU מוצגים בטבלת 1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4400/4400fig1.jpg" /> איור 1. ערכת תווית מסוף BrdU. שלב S אופייני בתאים אחרונים עבור 8 עד 10 שעות, וG2 יונקים הוא בדרך כלל 2-5 שעות. BrdU מתווסף להגדלת פרקי הזמן (חצים ירוקים) כדי לתייג את המנות האחרונות של הכרומוזומים לשכפל. ההכרומוזומים בתאי יונקי דואר לשכפל פי תכנית זמנית, במוקדם ומאוחר שכפול מתרחש בתחילה והסיום של שלב S בהתאמה (קו שחור). כרומוזומי X הפעיל מעוכב בעיתוי שכפול ברוב של סינתזת דנ&quot;א המתרחשת במהלך המחצית השנייה של שלב S (קו כחול). הכרומוזומים עם עיתוי שכפול עיכוב מעוכבים בייזום והן השלמת סינתזת דנ&quot;א, עם השכפול פעיל ממשיך דרך G2 (קו אדום). תרבויות אסינכרוני נקצרות לתאי mitotic והמעובד עבור התאגדות ודגי BrdU. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4400/4400fig2.jpg" /> איור 2. שכפול אסינכרוני של כרומוזום האנושי 6. תאים המכילים מחיקה מהונדסת של גן ASAR6 4 טופלו בBrdU ל5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד עבור התאגדות ודגי BrdU באמצעות כרום<html> 6 הצבע osome כחללית. ה-DNA הייתה מוכתמת בDAPI (כחול). א) התפשטות המיטוטי המכילה דפוס אופייני &quot;פסים&quot; התאגדות BrdU (ירוק) מוצגת. בדיקת צבע כרומוזום 6 הכלאה 2 של כרומוזום 6 (אדום) בתא זה. B) 2 של כרומוזום 6 (ראשון ושני) היה &quot;לגזור&quot; ומוצג בשלוש תוויות הניאון מופרדים לתמונות שונות. ג) 6 של כרומוזום נותח באמצעות תוכנת Cytovision ואת פרופילי עוצמת האות עבור שניהם DAPI (כחול) וBrdU (ירוק) מוצג. הקו האדום מציין את הנתיב המשמש, מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) לכימות של שניהם BrdU וDAPI. המרחק מתייחס לאורכו של כל כרומוזום מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) בפיקסלים. ד) כימות האות הכוללת עבור שניהם DAPI וBrdU פלואורסצנטי. הערכים כלל מייצגים את עוצמת הפיקסל הממוצעת מוכפלת באזור המיוצג על ידי אלה פיקסלים. igure 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4400/4400fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. Delayed שכפול של כרומוזום אנושי המכיל 6 מחיקה של ASAR6. תאים המכילים מחיקה מהונדסת של גן ASAR6 4 טופלו בBrdU ל5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד עבור התאגדות ודגי BrdU באמצעות כרומוזום 6 CEP תוספת BAC מכיל ASAR6 הגן כמו בדיקות. ה-DNA הייתה מוכתמת בDAPI (כחול). א) התפשטות המיטוטי המכילה דפוס אופייני &quot;פסים&quot; התאגדות BrdU (ירוק) מוצגת. כרומוזום 6 CEP חללית הכלאה 2 של כרומוזום 6 (אות centromeric אדום גדולה), וBAC הכלאת כרומוזום יחיד 6 (איתות אדומה קטנה על הזרוע הארוכה) בתא זה. שים הלב להיבדל בדפוס פסי BrdU בין 6 של שניים. B) כרומוזום 6 נמחק מיוצג על ידי Δ6 ולא נמחקו-6 על ידי 6. 6 2 שלהם &quot;לגזור&quot; ומוצגים בשלוש תוויות הניאון מופרדים לתמונות שונות. ג) טהוא 6 של כרומוזום נותח באמצעות תוכנת Cytovision ואת פרופילי עוצמת האות עבור שניהם DAPI (כחול) וBrdU (ירוק) מוצג. הקו האדום מציין את הנתיב המשמש, מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) לכימות של שניהם BrdU וDAPI. המרחק מתייחס לאורכו של כל כרומוזום מזרוע קצרה (p) לזרוע ארוכה (q) בפיקסלים. ד) כימות האות הכוללת עבור שניהם DAPI וBrdU פלואורסצנטי. הערכים כלל מייצגים את עוצמת הפיקסל הממוצעת מוכפלת באזור המיוצג על ידי אלה פיקסלים. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4400/4400fig4.jpg" /> איור 4. כימות הבדלי העיתוי בין השכפול של כרומוזום 6. תאים המכילים מחיקה מהונדסת של גן ASAR6 4 טופלו בBrdU ל5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד עבור התאגדות ודגי BrdU באמצעות כרומוזום 6 CEP חללית בתוספתBAC מכיל ASAR6 הגן כחללית. ממרחי mitotic עובדו כבאיור 3 ואת הערכים של 7 תאים שונים מוצגים (ראה טבלה 1). ) המכתים DAPI כומתה ואת המספר הכולל של פיקסלים מוצג לכל תא. שים לב שיש רק 10-20% ~ הבדל בין כרומוזומים בתוך אותו התא. B) התאגדות BrdU כומתה מאותם הכרומוזומים כB לוח שמעל. שים לב שיש&gt; הבדל פי 2 בין ערכי הפיקסלים הכוללים עבור כרומוזום נמחק ולא נמחק-6 של.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם ניאון<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים) כדי להעריך את עיתוי שכפול של כרומוזומים יונקים. טכניקה זו מאפשרת להשוואה הישירה של הכרומוזומים עצבו מחדש, ובטל מחדש-בתוך אותו התא.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

13.9K Views.  Oregon Health & Science University. שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם ניאון באתר הכלאה (דגים) כדי להעריך את עיתוי שכפול של כרומוזומים יונקים. טכניקה זו מאפשרת להשוואה הישירה של הכרומוזומים עצבו מחדש, ובטל מחדש-בתוך אותו התא.

Video: Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...