המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Cliona מ מקהייל עבור אנושות קריאה ועריכה של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, המכון הלאומי לבריאות מענק R01ES017452 ל L &#39;אנג.

1. שקופיות מדגם הכנה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים OctoChrome נועד לבחון שינויים כרומוזומלית מתפשט metaphase של תאים אנושיים, כולל אך לא רק תאים בתרבית דם היקפיים, גזע / אבי תאים, שורות תאים. דוגמאות יש להכין בעקבות הליך סטנדרטי עבור קצירת metaphases 3,11-13: על ידי העסקת טיפול colcemid לעצור תאים metaphase, טיפול hypotonic להתנפח תאים, Carnoy של מקבע לתקן תאים ההשעיה על כ 0.5-1 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את השקופית 8 מרובע (בתנאי בערכה OctoChrome, קטלוג #: PMP 803, Cytocell בע&quot;מ, קיימברידג&#39;, בריטניה, איור 2) על ידי טובל אתנול טהור דקות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע שקופיות מדגם, ולשחרר כמות קטנה של תאים לשקופית כדי לבדוק את צפיפות התאים. אם צפיפות התאים גבוהה מדי (התאים חופפים יותר מדי), לדלל את ההשעיה עם מקבע טרי. אם צפיפות התאים נמוך מדי (תא מעטים מדיזה בשקופית), לסובב את התאים מחדש להשעות בהיקף קטן יותר של מיצב טרי. פיפטה μl 5-10 של השעיה על כל תא של 8 אזורים של שקופיות תבנית ברצף של ריבועים לסירוגין 1/7 - 2/8 - 3 / 5-4 / 6. ברגע הראשון שני ריבועים יש אוויר יבש, לזהות את הריבועים הנותרים באותה צורה. זה ימנע את המרווחים סלולריים מלהתערב אחד עם השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית יבשים ניתן לאחסן ב -20 ° C באווירה של חנקן גדול יותר מ -5 שנים לפני ההכלאה. </li></ul> 2. לוקליזציה של metaphases באמצעות מערכת אוטומטית <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 20 μl של 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) למרכז של כל מחצית של השקופית ולאחר מכן מכסים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקה אוטומטית של שקופיות מדגם למקם את התאים באמצעות metaphase Metafer תוכנה (MetaSystems, Altlussheim, גרמניה). זה מאפשר מיקום של כל metaphases ועתיד הערכה מחדש של כל התמונות סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את תוצאות הסריקה באופן ידני ולמחוק ללא metaphase חפצים. </li></ul> 3. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שקופיות מדגם מכשיר OctoChrome </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופית מדגם במאגר SSC 2x בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לשטוף DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את השקופית מדגם באמצעות סדרה של שוטף אתנול (2 דקות כל אחד ב 70%, 85% ו 100% אתנול), לאפשר לו להתייבש ומניחים על 37 מעלות צלזיוס פלטה חשמלית במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Multiprobe Chromoprobe הכלאה הקאמרית (בתנאי בערכה OctoChrome) על אמבט מים 37 ° C כדי לאזן ולאפשר ל 37 ° C (+ / - 1 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון ההכלאה (בתנאי בערכה OctoChrome) על ידי pipetting חזר מראש חם aliquot 25 μl לכל מכשיר OctoChrome ל 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם כל התקן OctoChrome (בתנאי בערכה OctoChrome, ראה איור 2) על 37 מעלות צלזיוס על ידי הנחת הצד תווית המכשיר על פלטה חשמלית. לא לגעת לאהוא משטחים בולטות של המכשיר OctoChrome כפי שהם מכילים את הבדיקות. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקום של השקופית על מכשיר מדגם OctoChrome (איור 2) </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של פתרון מחומם מראש ההכלאה לכל אחד משמונה אזורים על מכשיר מחומם מראש OctoChrome בזמן שהוא נשאר ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך בזהירות את השקף בתבנית על המכשיר OctoChrome כך מספר 1, הנמצא כעת הפוך, ממוקם על שטח היד הימנית העליונה של המכשיר OctoChrome. כדי לסייע באיתור ריבוע 1, את מיקומו על גבי המכשיר סומן בכתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי את השקופית תבנית מיושר היטב עם האזורים תואמים במכשיר OctoChrome. להוריד בזהירות את השקף על המכשיר OctoChrome כך טיפות של תמיסת הכלאה ליצור קשר עם שקופיות. החל עדין, אפילו ללחוץ על מנת להבטיח כי הפתרון ההכלאה היא להפיץ את הקצוות של כל אחד מהאזורים שהועלו על המכשיר OctoChrome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להריםאת השקופית / OctoChrome, מחזיק בזהירות את קצה קפוא של שקופיות זכוכית, להפוך כך השקופית הוא מתחת למכשיר OctoChrome. יש לוודא שהמכשיר לא למרוח על פני השקופית תבנית כמו זו עלול לגרום בין זיהום של הבדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על 37 ° C (+ / - 1 ° C) פלטה חשמלית במשך 10 דקות. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Denaturation </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המכשיר שקופיות / OctoChrome מדגם פלטה חשמלית בטיפול בפרט להחזיק אותו ברמה. ודא שקופיות מדגם בצורה שווה הקשר פלטה חשמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל על ​​פלטה חשמלית ב 75 ° C (+ / - 1 ° C) במשך 5 דקות. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום מדגם שקופיות / מכשיר OctoChrome ב הקאמרית Multiprobe Chromoprobe הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המכסה לצוף קאמרית 37 ° C (+ / - 1 ° C) אמבט מים (אי - ערבוב) בין לילה. שימו לב: לא לסגור את מכסה תא ההכלאה, אל לאטום את המכסה על אמבט מים, אל להכליא בחממה. צעדים אלה הם קריטיים שליטה לחות. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכלאה שוטף </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות לשטוף פתרון 1: הכן את הצנצנת Coplin / Hellendahl המכיל 0.4x SSC. לאזן עד 72 ° C (+ / - 1 ° C) באמבט מים להתאים את pH עד 7.0. פתרון 2: הכן את הצנצנת Coplin / Hellendahl המכיל 2x SSC ו 0.05% Tween 20. אפשר לעמוד בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ההתקן OctoChrome בזהירות משקופית ומניחים שקופית פתרון 1 ל -2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית לתוך פתרון 2 במשך 30 שניות. </li></ul></ol> 4. הרכבה ויזואליזציה של תוצאות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 20 μl של DAPI למרכז כל מחצית של השקופית וליישם coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הצפייה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ul> 5. נציג תוצאות FiguRe 3A מראה תא metaphase רגיל בכיכר 2. (1) - (3): כרומוזומים 8, 21 ו -12 היו צבועים אדום, ירוק וכחול, הם דמיינו את האדום טקסס, FITC, ו DEAC מסנן, בהתאמה; (4): ויזואליזציה דרך DAPI / FITC / טקסס אדום טריפל מסנן. באופן כללי, הכרומוזומים צבועים בכחול אינם ברורים דרך פילטר משולשת צריך לראות תחת מסנן DEAC ספציפי. איור 3 ב מציג תאים חריגים עם נציג טרנסלוקציה לוקמיה ספציפי aneuploidy כרומוזומלית ו. (1): t (8; 21), טרנסלוקציה כרומוזומלית שכיח לוקמיה מיאלואידית חריפה, (2): טריזומיה 21, שלושה עותקים של כרומוזום 21, aneuploidy נפוץ לוקמיה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig1.jpg" /> באיור 1. הסדר של צירופי הכרומוזומים במכשיר OctoChrome וציפו לתוצאות ציור כרומוזומליות. <img alt="איור 2" src= &quot;/ Files/ftp_upload/3619/3619fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. מיקום של שקופית על מכשיר מדגם OctoChrome. איור 3. תוצאות נציגלהשיג דגים OctoChrome (ריבוע 2). <img alt="איור 3 א" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3A.jpg" /> איור 3 א. תא נורמלי עם 8 כרומוזומים, 12, 21 צבועים בכיכר 2. <img alt="איור 3 ב" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3B.jpg" /> איור 3 ב. תאים חריגים עם נציג טרנסלוקציה לוקמיה ספציפי aneuploidy כרומוזומלית ו בכיכר 2.

<ol>
	<li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+chromosomal+aberrations+detected+in+humans+exposed+to+benzene.">The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene.</a> Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrations+in+chromosomes+associated+with+lymphoma+and+therapy-related+leukemia+in+benzene-exposed+workers.">Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers.</a> Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+increases+aneuploidy+in+the+lymphocytes+of+exposed+workers:+a+comparison+of+data+obtained+by+fluorescence+in+situ+hybridization+in+interphase+and+metaphase.">Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+aneusomy+and+long+arm+deletion+of+chromosomes+5+and+7+in+the+lymphocytes+of+Chinese+workers+exposed+to+benzene.">Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene.</a> Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).</li><li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+translocations+and+aneusomy+in+chromosomes+8+and+21+among+workers+exposed+to+benzene.">Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene.</a> Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).</li><li>Bayani, J., Squire, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+detection+of+chromosomal+aberrations+using+spectral+karyotyping.">Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping.</a> Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome-wide+aneuploidy+study+(CWAS)+in+workers+exposed+to+an+established+leukemogen,+benzene.">Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene.</a> Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).</li><li>Rowley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chromosome+translocations+in+leukemogenesis.">The role of chromosome translocations in leukemogenesis.</a> Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+OctoChrome+fluorescence+in+situ+hybridization+to+detect+specific+aneuploidy+among+all+24+chromosomes+in+benzene-exposed+workers.">Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers.</a> Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).</li><li>Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S., Barch, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In The ACT cytogenetics laboratory. , 17-30 (1991).</li><li>Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+aneuploidy+of+chromosomes+1,+5,+6,+7,+8,+9,+11,+12,+and+21+induced+by+the+benzene+metabolites+hydroquinone+and+benzenetriol.">Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol.</a> Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).</li><li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroquinone,+a+benzene+metabolite,+increases+the+level+of+aneusomy+of+chromosomes+7+and+8+in+human+CD34-positive+blood+progenitor+cells.">Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells.</a> Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).</li><li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+benzene+health+effects+and+susceptibility.">Advances in understanding benzene health effects and susceptibility.</a> Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

זה assay הרומן דגים OctoChrome, מאפשר בו זמנית לבדוק את כל 24 הכרומוזומים האדם הכלאה אחת בשקופית 1. ההסדר של שילובים כרומוזום על 8 ריבועים תוכנן כדי להקל על זיהוי לא אקראיים rearrangements כרומוזום את לוקמיה לימפומה ו הנפוצים ביותר. לכן, assay יכול לזהות מספרי (aneuploidy), כמו גם מבנה (טרנסלוק...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td><tr><tr><td> OctoChrome Kit </td><td> Cytocell בע&quot;מ, קיימברידג&#39;, בריטניה </td><td> PMP 803 </td><td></td></tr><tr><td> phytohaemagglutinin (PHA) </td><td> Invitrogen תאגיד </td><td> 10576-015 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Invitrogen תאגיד </td><td> 15212-012 </td><td></td></tr><tr><td> Carnoy של מקבע </td><td></td><td></td><td> מתנול: חומצה אצטית קרחונית = 3: 1 </td></tr><tr><td> הקרינה מיילcroscope </td><td></td><td></td><td> מצויד מסננים כדי להציג DAPI, טקסס רד, FITC, ואת ספקטרום קומארין בנפרד DAPI / FITC / טקסס האדום טריפל מסנן כדי להציג צבעים שונים בו זמנית </td></tr><tr><td> Metafer תוכנה </td><td> MetaSystems, Altlussheim, גרמניה </td><td></td><td> לאפשר לאתר את כל metaphases כדי להעריך מחדש את הפרעות </td></tr></tbody></table>

chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel octochrome fish assay

הקרינה ב ההכלאה באתרם (דגים) היא טכניקה המאפשרת רצפי DNA ספציפיים כדי להתגלות על הכרומוזומים metaphase או שלבי הביניים בגרעין התא 1. הטכניקה משתמשת בדיקות DNA עם רצפים ייחודיים כדי להכליא כרומוזומים שלמים או אזורי כרומוזומים מסוימים, ומשמש כתוספת חזקה cytogenetics קלאסיים. למשל, מחקרים קודמים רבים דיווחו על גילוי תכופה של סטיות כרומוזום מוגברת בחולים לוקמיה הקשורים עם חשיפה בנזן, בנזין, הרעלת חולים, עובדים בריאים שנחשפו בנזן, באמצעות ניתוח קלאסי cytogenetic 2. באמצעות דגים, לוקמיה ספציפיים שינויים כרומוזומליים נצפו להיות גבוהות עובדים בריאים לכאורה שנחשפו בנזן 3-6, המציין את התפקידים הקריטיים של שינויים cytogentic ב leukemogenesis בנזן המושרה. באופן כללי, assay דג בוחן אחד בלבד או כמה כרומוזומים שלמיםאו לוקוסים ספציפיות לכל שקופית, כך הכלאות מרובות צריך להתנהל על שקופיות מרובות כדי לכסות את כל הכרומוזומים האנושיים. Karyotyping ספקטרלי (SKY) המאפשר הדמיה של הגנום כולו בו זמנית, אבל את הדרישה תוכנה מיוחדת לתחום ציוד היישום שלה 7. כאן אנו מתארים assay דגים רומן, OctoChrome-FISH, אשר יכול להיות מיושם על Chromosomics, שאנו מגדירים כאן ניתוח סימולטני של כל 24 הכרומוזומים האנושיים בשקופית אחת מחקרים בבני אדם, כגון מחקר כרומוזום רחב aneuploidy (CWAS) 8. הבסיס של השיטה, המשווקים על ידי Cytocell כמערכת Multiprobe Chromoprobe, הוא מכשיר OctoChrome אשר מחולק 8 ריבועים, שכל אחת מהן נושאת שלוש שונים שלמים ציור בדיקות כרומוזומים (איור 1). כל אחת משלוש הבדיקות מסומן ישירות עם fluorophore בצבע אחר, ירוק (FITC), אדום (Red טקסס), וכחול (קומארין). סידור הכרומוזומים על שילובים OctoChromמכשיר ה תוכנן כדי להקל על זיהוי שאינו כרומוזום אקראיים שינויים מבניים (טרנסלוקציות) שנמצאו לוקמיה לימפומה ו הנפוצים ביותר, עבור T למשל (9, 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14, 18) 9. יתר על כן, שינויים מספריים (aneuploidy) בכרומוזומים ניתן לאתר בו זמנית. השקופית תבנית המקביל מחולק גם ל -8 ריבועים על המשתרע metaphase המאוגדים (איור 2), והוא ממוקם מעל המכשיר OctoChrome. בדיקות ו-DNA היעד הם מפוגל על ​​בטמפרטורה גבוהה ו הכלאה בתא לח ולאחר מכן כל 24 הכרומוזומים האנושיים ניתן דמיינו בו זמנית. דגים OctoChrome היא טכניקה מבטיחה אבחנה קלינית של לוקמיה ולימפומה וכן זיהוי של aneuploidies בכרומוזומים כל. יש לנו ליישם את הגישה הזאת Chromosomic חדש במחקר CWAS של בנזן שנחשפו פועלים סינים 8,10.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay at JoVE.com

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

הקרינה רומן<em&gt; באתרו</em&gt; ההכלאה (דגים) שיטה כי במקביל בוחנת שינויים כרומוזום הן מספריים ומבניים, בעיקר טרנסלוקציות כרומוזומליות ספציפיות הקשורות לוקמיה ולימפומה, של כל 24 הכרומוזומים האנושיים במכשיר אחד הכלאה 1, מתואר.

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

chromosomics-detection-numerical-structural-alterations-all-24-human

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  University of California, Berkeley. הקרינה רומן באתרו ההכלאה (דגים) שיטה כי במקביל בוחנת שינויים כרומוזום הן מספריים ומבניים, בעיקר טרנסלוקציות כרומוזומליות ספציפיות הקשורות לוקמיה ולימפומה, של כל 24 הכרומוזומים האנושיים במכשיר אחד הכלאה 1, מתואר.

Video: Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, form a complex with Smad4 and translocate to the nucleus where they function as transcription factors to initiate BMP specific downstream effects 1. Traditional immuno-fluorescence techniques with antibodies against phospho-Smad peptides exhibit low sensitivity, high background and offer gross quantification as they rely on intensity of the antibody signal particularly if this is photosensitive fluorescent. In addition, phospho-Smads may not all be in complex with Smad4 and engaged in active transcription.
In situ PLA is a technology capable of detecting protein interactions with high specificity and sensitivity 2-4. This new technology couples antibody recognition with the amplification of DNA surrogate of the protein. It generates a localized, discrete signal in a form of spots revealing the exact position of the recognition event. The number of signals can be counted and compared providing a measurement. We applied in situ PLA, using the Duolink kit, with a combination of antibodies that allows the detection of the BMP signaling effectors phospho-Smad1/5/8 and Smad4 only when these are in proximity i.e. in a complex, which occurs only with signaling activation. This allowed for the first time, the visualization and measurement of endogenous BMP signaling with high specificity and sensitivity in a time course experiment under BMP4 stimulation.

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Here we show how to use Proximity Ligation Assay (PLA), with a combination of antibodies to visualize Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in fixed cells. This technique allowed us to follow the nuclear accumulation of endogenous BMP activated effector-complexes and quantify their levels over time under BMP4 stimulation.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...