מכון לTranslational UTMB-NIH מענק מדעי 1UL1RR029876-01 ואלישה פריית&#39;ר על סיועה בעריכת וידאו לכתב היד הזה.

1. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעת בעלי חיים: עם ההגעה לרמת הבטיחות הביולוגית חית 2 (ABSL2) מתקנים, לאפשר חי מינימום של 2 ימים להסתגל לסביבתם החדשה. לאחר תקופת המנוחה הזו, לבדוק את בעלי החיים כדי להעריך את בריאותם ומראה החיצוני באופן כללי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ניצול כתבי ניאון חשוב למקם את כל נושאי חיות על תזונה ללא אספסת כדי להגביל את כמות autofluorescence עיכול ואות רקע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבי חיות: כדי לשפר את אות bioluminescent זוהתה מאזור הגולגולת במהלך ההדמיה; לגלח את ראשיהם של כל בעלי החיים. הרדם את החיות בתערובת של גז חמצן ומתאדה isoflurane. לאחר שבעלי החיים הם מורדמים לגמרי, השתמש קוצץ חשמלי לגלח את ראשם. ברגע שסיים עם גילוח, להחזיר את החיות לכלובים שלהם ולבחון להתאוששות מלאה מההשפעות של ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביו מדיק נתונים(BMDS) הכנסת מערכות משדר (לחול בעקבות גילוח של העכברים בעוד בעלי החיים הם מורדמים מלא): לאמצעי פחות פולשניים כדי לעקוב אחר טמפרטורת שתל משדר preprogrammed BMDS אלחוטי תת עורי באזור הגבי של כל עכבר. משיבים אלו ייאפשרו זיהוי אלחוטי והקלטת טמפרטורה. לאחר ההשתלה של המשדר, להחיל דבק רקמות וטרינרי כיתה לפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף בסיסי: לפני הזיהום, להקליט טמפרטורה בסיסית ומשקל לכל בעלי החיים. איסוף דם לבדיקת ניתוח הפחתת פלאק נטרול (PRNT) דרך לדמם רטרו במסלול (RO) בעוד שהעכברים הם תחת הרדמה. לאחר איסוף דם, להחיל משחת עיניים אנטיביוטית וטרינרית להפחתת זיהום חיידקים משתי פוטנציאלי. אוסף בסיסי זה אמור להסתיים תוך התחשבות במספר הפעמים שהחיות ממוקמות בהרדמה בשל לחץ על העכברים. s אוספי RO עתידייםhould יושלם לאחר הדמיה, בעוד העכבר הוא עדיין תחת הרדמה. הדם המרבי שנאסף מRO צריך להיות סביב 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום: עכברי מקום תחת הרדמה כפי שתואר קודם לכן. לחסן דרך הציר אפי שימוש במינון של 5x10 6 עד 7 5x10 pfu TC83 לוציפראז-בהיקף כולל של 40 μl מדולל על ידי נאגר מלוח פוספט (PBS) באמצעות זיהום אפי. בעקבות זיהום, למקם את העכברים בתוך כלוב הדיור שלהם ולבחון את ההתאוששות. </li></ol> 2. בעלי החיים דימות הצהרה: שמור עכברים בתוך יחידת הדיור שלהם, הבטיחות הביולוגית הקבינט (BSC), או תיבת הכלת XIC בכל העת. את BSCs אושר עבור פרוטוקול זה הוא B1 סוג II או סוג B2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק כל בעלי החיים עם 10 μl לגרם של משקל גוף של (IP) luciferin intraperitoneal בריכוז של 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים שקבלו Ampligen הם להיות injecteIP ד במינון של משקל 12.5 מ&quot;ג / קילו גוף בזיהום -4 שעתי הודעה או זיהום 48 שעתי הודעה המבוססת על הקבוצה שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקה עם luciferin, להפריד את העכברים לקבוצות של שלוש, כדי להבטיח התאמה נכונה בתוך תיבת הכלת XIC-3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל ההדמיה, לנצל משחה עינית / סיכה כדי למנוע הייבוש של הקרנית לאורך ההליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה ולחץ LivingImage האתחול להכין תיבת ההדמיה; שמירה אוטומטית סט, זמן חשיפה לאוטומטית (זמן חשיפה באופן אוטומטי הוא תכונה חדשה של תוכנת LivingImage 3.2 ומעלה), להציג שדה ל-C, ומסנן כדי לפתוח; תחום של ראות זו מבוססת על מספר העכברים אתה הדמיה; ויכול להיות מותאם לפי צורך מסנן לפרויקטי הדמיה אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שמסנני פחם האוויר לא פגו, מכל החמצן הוא מלא, ומאגר isoflurane מלא. הנח רצועות קטנות של סרט החשמל בXIC-3תיבת solation המסייעת בהפחתת תנועת בעלי חיים במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק לעכברים עם IP luciferin כמתואר בסעיף 2.1 ומקום בתוך תא אינדוקצית isoflurane (עם המכסה נפתח) במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות, לסגור את המכסה של תא האינדוקציה ולהתחיל את זרימת isoflurane. ההרדמה מופעלת על כ 3-5% בקבוצת קצב זרימת החמצן בכ 2.0 ליטר / דקה. ברגע באופן מלא יחכה מחוסר הכרה נוספת 30 שניות ולהעביר את העכברים לתיבת בידוד XIC-3. ודא ארון הבטיחות הביולוגית מנוצל מאפשר להדחה הבטוחה של isoflurane כנוהל זה יהיה כרוך בהפסד של isoflurane מתא האינדוקציה (יחידת IVIS מכילה המכל שלו הפסיבי הוגן ותיבת הכלת XIC-3 מתחברת ישירות לכניסה / יציאת ארובות כדי להבטיח זרימת הרדמה כלולה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכברים המבוססים על מספר שבב / קבוצה לתיבת בידוד XIC-3 עם מחבר isoflurane המצורפתד לפתוח. מקם את העכברים ולכן הם ערוכים בעינת חזה עם ראשים בעדינות מונחים על רצועות הקלטת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את תיבת הכלת XIC עם אתנול, ידי ריסוס ותחתון של XIC-3 עם cavicide, ולהעביר לחדר הדמית IVIS. חבר מחדש את ההרדמה לתיבת ההכלה פעם אחת בתוך יחידת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 10 דקות לאחר ההזרקה של luciferin, תמונת העכברים באמצעות תוכנת דמות החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הדמיה ראשונית עם מסנן פתוח, ליזום הדמית 3-Dimensional DLIT באמצעות הניתוח של הרצף ואשף התקנת תמונה לבלוציפראז גחלילית bioluminescent. תהליך הדמיה זה ייקח 4-5 דקות ואמור להסתיים בשדה ראיה רלוונטי למספר העכברים הרצויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח Ex-vivo הוא נתיחה לאחר מוות אפשרית הבאה ואוסף של המוח. מניח את המוח בצלחת פטרי סטרילית, לטפטף 50-100 μl מניות luciferin למעלה, ומקום בתוך imaגינג תיבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים תמונת מסנן פתוחה שנייה בזיהום שלאחר 15-17 דקות עם השלמת הדמית DLIT. ודא ניתוח רצף כבוי ואת שדה הראיה וגדרות מסננות מוחזרים להגדרות קודמות. </li></ol> 3. עכברי החזרה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מכשיר אדי isoflurane ולהעביר את תיבת הכלת XIC בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכברים בחזרה בתוך יחידת הדיור שלהם, לסגור אותו, לרסס חיצוני עם חומר חיטוי מתאים ומקום בחזרה על מדף הדיור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים יבטיחו שהתאוששו לגמרי מהרדמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך הזה כניסוי דורש עד ההדמיה השלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא BSC, כבה את הציוד, ולהעביר את כל הנתונים למיקום מעבדה מחוץ לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים ולהפיק תמונות 3-ממדיות המבוססות על תוצאות IVIS utilizing תוכנת LivingImage. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהתמונה כראוי אורינטציה והאיזון מוגדר תאורה / צבע. בתוך פלטת כלי האפשרויות כוללות תמונה התאימי, תיקונים, מידע תמונה, והגדרות החזר על השקעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנצל צורות החזר השקעה כדי לזהות את נקודתי חוזק אות ספציפית המבוסס על מיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את טופוגרפית המשטח כדי להדגיש את גוף העכבר, לאתחל מחדש DLIT 3D, ולהשתמש בהתאמה ליניארי כדי להגדיר את מפת האיברים לשיקום הטופוגרפי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח טיטרציה ויראלי נוסף ניתן להשלים באמצעות אוסף של דם ואיברים. טיטרציה במחקר זה הושלמה באמצעות הומוגניזציה של רקמת המוח בmodified הבינוני נשרים (MEM). Homogenate היה מדולל באופן סדרתי ואנו נגועים צלחת גם 6 תאי Vero לשעה 1. התאים היו מכוסים בשכבת agarose/2xMEM 1.5% ודגרו על 2 ימים ב37 מעלות. תאים היו קבועים עם 10% פורמלין למשך 30 דקות ומוכתמיםסגול גביש. </li></ol>

<ol>
	<li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H/HeN+and+BALB/c+Mice.">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li><li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice.">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li><li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse.">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li><li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis.">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li><li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection:+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals.">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li><li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals.">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li><li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging.">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592 (2009).</li><li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors.">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds:+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus.">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li><li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection.">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בעוד פרוטוקול זה מכסה את היבטי ההדמיה לניתוח בvivo, חשוב להכיר את וקטור bioluminescent כגורם מרכזי למחקרים עתידיים. הניצול שלנו של TC83, של חיסון מוחלש של VEEV, כוקטור לביטוי של לוציפראז מבטיח שכמויות גדולות של האנזים שתופקנה, בשל השיעור הגבוה של שכפול הנגיף במערכת עצבים מרכז...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> D-luciferin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS מערכת (ספקטרום) </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מערכת ההרדמה XGI-8-גז </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תיבת הבלימה XIC-3 </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4.0 תוכנה </td><td> Caliper מדעי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שבבי טלמטריה / זיהוי </td><td> ביו מדיק מערכות מידע </td><td> IPTT-300 </td><td> זיהוי בעלי חיים ומזגשבמקום </td></tr><tr><td> מזרק BD Integra 1ml TB עם GX מחט 26 3/8 &quot; </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> דבק רקמות ונד וטרינר </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> משחה לרפואת עיני Vetropolycin </td><td> מוצרי וובסטר הווטרינריים </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט של Dulbecco נאגר מלוח 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS צ&#39;יפ קורא </td><td> ביו מדיק מערכות מידע </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת DAS-HOST </td><td> ביו מדיק מערכות מידע </td><td></td><td> משמש להורדת מידע חללית </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) detection of a neuro-invasive encephalitic virus

פיתוחים מודרניים בטכנולוגיית הדמיה לעודד פיתוח וחידוד נוסף בדרך המחקר נגיפי נעשה. הוצע בתחילה על ידי ראסל ורץ&#39; ב3Rs של יום (החלפה, הפחתה, עידון), ניצול מודלים של בעלי החיים במחקר מדעי הוא תחת לחץ מתמיד לזהות מתודולוגיות חדשות כדי לצמצם את שימוש בעלי חיים תוך שיפור דיוק ומהירות מדעי. אתגר גדול למנהלים של יום לעומת זאת, הוא כיצד להבטיח את המחקרים סטטיסטיים מדויקים תוך הפחתת תחלואת מחלות בעלי חיים ומספרים באופן כללי. מחקרי יעילות חיסון כעת דורשים מספר רב של בעלי חיים כדי להיחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית, ולעתים קרובות לגרום לתחלואה גבוהה ותמותת נקודתי קצה עבור זיהוי של הגנה חיסונית. אנו מנוצלים in vivo מערכות הדמיה (IVIS) בשיתוף עם אנזים bioluminescent גחלילית בהדרגה כדי לעקוב אחר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי enceוירוס phalitic במודל עכברי. בדרך כלל, המחלה מתקדמת לאט יחסית, עם זאת שכפול נגיף הוא מהיר, במיוחד בתוך מערכת העצבים מרכזיים, והוא יכול להוביל לעתים קרובות תוצאה, קטלנית. בעקבות זיהום אפי של העכברים עם TC83 לוק, זן נחלש ונצואלה סוסי דלקת מוח וירוס שונה למבטא גן לוציפראז; אנו מסוגלים לדמיין שכפול נגיף בתוך המוח לפחות שלושה ימים לפני התפתחות תסמיני מחלה קליניות. ניצול פלישת CNS כנקודת סיום מפתח אנצפליטי מחלת פיתוח אנו מסוגלים לזהות הגנת חיסון הטיפולי ובמהירות נגד זיהום TC83 לוק לפני שתסמינים קליניים להתפתח. בעזרת טכנולוגית IVIS אנו מסוגלים להדגים את הבדיקה המהירה ומדויקת של סמים ותרופות וחיסונים, תוך צמצום מספר בעלי חיים ותחלואה.

בוירוס מהונדס גנטי, TC83-לוציפראז, ראה עלייה בעוצמת אות bioluminescent כשכפול הנגיף עובר מאזור האף אל מערכת העצבים מרכזיים המרכזי (איור 1). עקב קצב השכפול הנגיפי הגבוה, אנו מצפים לראות רמות גבוהות של אות bioluminescent (איור 2 א) תלויות על הווקטור ואת התגובה החיסונית ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus at JoVE.com

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

שימוש בלוציפראז ובמערכות הדמית vivo (IVIS) כרומן האמצעי לזיהוי נקודתי קצה מחלה לפני התפתחויות קליניות להתרחש. IVIS אפשר לנו לחזות בזמן אמתו את הפלישה של וירוסי אנצפליטיים מעל ימים מרובים, מתן מודל מחלה מדויקת יותר למחקר עתידי. זה גם אפשר לנו לזהות את התכונות המגנות הפוטנציאליות של תרופות אנטי וחיסונים מהר יותר ממודלים של בעלי חיים מנוצלים כיום. היכולת לנצל חיות בודדות מעל נקודתי זמן מרובות מבטיחה דרישות מופחתות בבעלי חיים, עלויות ותחלואה הכוללת לבעלי החיים מנוצלים להבטיח אמצעי הומני יותר ויותר מדעי של מחקר מחלה.

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

20.5K Views.  University of Texas Medical Branch. שימוש בלוציפראז ובמערכות הדמית vivo (IVIS) כרומן האמצעי לזיהוי נקודתי קצה מחלה לפני התפתחויות קליניות להתרחש. IVIS אפשר לנו לחזות בזמן אמתו את הפלישה של וירוסי אנצפליטיים מעל ימים מרובים, מתן מודל מחלה מדויקת יותר למחקר עתידי. זה גם אפשר לנו לזהות את התכונות המגנות הפו...

Video: In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...