Instituto de Ciências Translacional UTMB-NIH concessão 1UL1RR029876-01 e Prather Alisha por sua assistência com edição de vídeo para este manuscrito.

1. Preparação animal <ol><li> Chegada Animal: Na chegada ao nível de biossegurança animal 2 (ABSL2) instalações, permitir que os animais de um mínimo de dois dias para se aclimatar ao seu novo ambiente. Após este período de repouso, o controlo dos animais para avaliar sua saúde e aparência física geral. <ol><li> Quando se utiliza repórteres fluorescentes, é importante colocar todos os sujeitos animais com uma dieta livre de alfafa para limitar a quantidade de GI autofluorescência e sinal de fundo. </li></ol></li><li> Shave animais: Para melhorar o sinal bioluminescente detectado da região craniana durante o exame; raspar as cabeças de todos os animais. Anestesiar os animais com uma mistura de gás de oxigénio e vaporizado isoflurano. Uma vez que os animais são totalmente anestesiado, use cortadores elétricos para raspar a cabeça. Terminado o barbear, os animais regressar às suas gaiolas e observar a recuperação completa dos efeitos da anestesia. </li><li> Bio Medic DadosSistemas de inserção de transponder (BMDs) (a realizar na sequência de corte dos ratinhos enquanto que os animais são completamente anestesiados): Para um meio menos invasivos para controlar a temperatura de um implante pré-programado BMDs transponder sem fios via subcutânea na região dorsal de cada rato. Estes transponders permitir a identificação sem fio e gravação de temperatura. A seguir à implantação do transponder, aplicar um adesivo de tecido de grau veterinária para a ferida. </li><li> Coleta basal: Antes de infecção, gravar uma temperatura basal e peso para todos os animais. Coleta de sangue para análise de teste de placa de neutralização de redução (PRNT) através de retro-orbitais (RO) sangrar enquanto os ratos estão sob anestesia. Após a coleta de sangue, aplique pomada veterinária antibiótico para reduzir infecção secundária potencial bacteriana. Esta colecção de base deverá ser completado com consideração para o número de vezes que os animais são colocados sob anestesia devido ao stress em ratos. Futuras coleções ro should ser concluída após imagem, enquanto o mouse ainda está sob anestesia. O sangue coletado de um máximo de RO deve ser em torno de 200 ul. </li><li> Infecção: ratinhos lugar sob anestesia, como descrito anteriormente. Inocular por via intranasal com uma dose de 5x10 6 a 5x10 7 pfu TC83-Luciferase em um volume total de 40 ul de diluição de fosfato salino tamponado (PBS) por meio de infecção intranasal. Após a infecção, coloque os ratos dentro de sua gaiola habitação e observar a recuperação. </li></ol> 2. Imagens de animais Disclaimer: Mantenha ratos dentro de sua unidade habitacional, o gabinete de segurança biológica (CSB), ou a caixa de contenção XIC em todos os momentos. Os BSCs aprovados para este protocolo são uma classe B1 ou B2 Tipo II. <ol><li> Injectar todos os animais com 10 ul por grama de peso do corpo do intraperitoneal (IP), a luciferina, a uma concentração de 15 mg / ml. <ol><li> Os ratinhos que receberam Ampligen são para ser injected IP a uma dose de 12,5 mg de peso corporal / kg a infecção -4 hr pós ou 48 hr após a infecção com base no seu grupo. </li></ol></li><li> Antes da injecção com a luciferina, separar os ratos em grupos de três para garantir um bom ajuste dentro da caixa de contenção XIC-3. <ol><li> Para todas as imagens, a utilizar uma pomada ocular / lubrificante para evitar a secagem da córnea durante todo o procedimento. </li></ol></li><li> Abra o software LivingImage e pressione Inicializar para preparar a caixa de imagem; economia auto set, tempo de exposição ao automóvel (tempo de exposição em auto é um novo recurso do software LivingImage 3.2 e mais recente), ver campo para C, e filtro para abrir; campo de vista é baseada no número de murganhos que você está imagiologia e de filtro pode ser optimizada, conforme necessário para outros projectos de imagiologia. </li><li> Confirmar que os filtros de carvão de ar não expiraram, o tanque de oxigênio está cheio, o reservatório e isoflurano é preenchido. Coloque pequenas tiras de fita isolante no XIC-3 icaixa solation que ajuda com a redução da circulação de animais durante o exame. </li><li> Injectar os ratos com IP luciferina, como descrito na seção 2.1 e lugar dentro da câmara de indução isoflurano (com a tampa aberta) por 3-5 min. </li><li> Após 5 min, fechar a tampa da câmara de indução e iniciar o fluxo de isoflurano. O anestésico é operado a cerca de 3-5% com o conjunto de taxa de fluxo de oxigénio em cerca de 2,0 L / min. Depois de completamente inconsciente esperar um adicional de 30 seg e transferir os animais para a caixa de isolamento XIC-3. Verifique se o gabinete de biossegurança a ser utilizada permite a segura eliminação de isoflurano como esse procedimento irá envolver perda de isoflurano da câmara de indução (a unidade IVIS contém suas próprias passivos latas Fair e da caixa de contenção XIC-3 conecta diretamente à entrada / saída soquetes para garantir o fluxo contido anestésico). <ol><li> Transfira os ratos com base em chip / número de grupo na caixa de isolamento XIC-3 com o conector de isoflurano em anexo umd abrir. Posicione os ratos para que eles são dispostos em decúbito esternal com a cabeça suavemente descansando sobre as tiras de fita. </li></ol></li><li> Limpe a caixa de contenção XIC com as mãos de etanol, spray e fundo da XIC-3 com cavicide, e transferir para a câmara de imagem IVIS. Reconectar a anestesia para a caixa de contenção, uma vez dentro da unidade de imagem. </li><li> Depois de 10 min após a injecção de luciferina, a imagem dos ratinhos através do software de imagem viva. </li><li> Seguindo imagem inicial com um filtro aberto, iniciar uma imagem 3-Dimensional DLIT utilizando a análise de seqüência e configuração Assistente de imagem para bioluminescente da luciferase firefly. Este processo de imagem terá 4-5 minutos e deve ser completada em um campo de visão relevante para o número de ratinhos desejados. <ol><li> Ex vivo-análise é possível após necropsia e coleta do cérebro. Coloque o cérebro em uma placa de Petri estéril, escorrer 50-100 ul de estoque luciferina em cima, e lugar dentro da imaging caixa. </li></ol></li><li> Finalize uma imagem aberta de segunda filtro em 15-17 de infecção pós min após a conclusão da imagem DLIT. Assegurar a análise de sequência é desligado eo campo de visão e configurações de filtro são retornados às configurações anteriores. </li></ol> 3. Ratos de retorno e análise de dados <ol><li> Desligue o vaporizador isoflurano e transferir a caixa de contenção XIC de volta para o armário de biossegurança. </li><li> Coloque os ratos de volta dentro de sua unidade habitacional, perto do topo, borrife o exterior com desinfetante apropriada e lugar de volta na prateleira habitação. <ol><li> Garantir ratos se recuperaram totalmente da anestesia. </li></ol></li><li> Repetir o procedimento acima, como a experiência requer até imagiologia foi concluída. </li><li> Desinfectar o BSC, desligue o equipamento, e transferir todos os dados para um local fora do laboratório para análise posterior. </li><li> Analisar os dados e gerar três imagens tridimensionais baseadas em resultados IVIS UTIlisador o software LivingImage. <ol><li> Garantir que a imagem é devidamente orientada e iluminação / cor equilíbrio está definido. Dentro da paleta de ferramentas as opções incluem Ajuste de imagem, Correções, Informação, Imagem e Ferramentas de ROI. </li><li> Utilize formas de ROI para identificar os pontos fortes de sinal específicos baseados em localização. </li><li> Reconstruir a topografia da superfície para realçar o corpo do mouse, inicializar reconstrução DLIT 3D, e usar ajuste linear para definir o mapa de órgãos, para a recomposição topográfica. </li></ol></li><li> Análise de titulação mais viral pode ser concluído através de coleta de sangue e de órgãos. Titulação neste estudo foi concluído através de homogeneização do tecido cerebral em modificado águias médio (MEM). O homogenato foi diluído em série e que infectou uma placa de 6 poços de células Vero para 1 hr. As células foram cobertas com uma camada agarose/2xMEM 1,5% e incubadas durante 2 dias a 37 graus. As células foram fixadas com formalina a 10% durante 30 minutos e coradas comvioleta de cristal. </li></ol>

<ol>
	<li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H/HeN+and+BALB/c+Mice.">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li><li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice.">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li><li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse.">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li><li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis.">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li><li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection:+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals.">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li><li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals.">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li><li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging.">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592 (2009).</li><li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors.">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds:+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus.">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li><li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection.">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Embora este protocolo abrange os aspectos de imagem para análise in vivo, é importante reconhecer o vector bioluminescente como factor-chave para estudos futuros. Nossa utilização de TC83, uma estirpe de vacina atenuada de VEEV, como um vector para a expressão de luciferase assegura que grandes quantidades da enzima estão a ser produzidos, devido à elevada taxa de replicação do vírus no SNC como previamente descritos 1-4. Enquanto a adição de um segundo promotor subgenómico e os...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> D-luciferina </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS Sistema (Spectrum) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XGI-8-gás Sistema de Anestesia </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XIC-3 caixa de contenção </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4,0 Software </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Telemetria / identificação fichas </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> IPTT-300 </td><td> Identificação animal e TemperATUREZA </td></tr><tr><td> BD seringa TB Integra 1ml com 26 gx 3/8 agulha &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> Vet adesivo de tecido de Bond </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Vetropolycin Pomada oftálmica </td><td> Produtos Veterinários Webster </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco Buffered Saline 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDs Chip Leitor </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-HOST Software </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td></td><td> Usado para fazer download de informações da sonda </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) detection of a neuro-invasive encephalitic virus

Os avanços modernos em tecnologia de imagem estimular o desenvolvimento eo aperfeiçoamento da forma de pesquisa viral é realizado. Inicialmente proposto por Russel e Burch em 3Rs Hume (substituição, redução, refinamento), a utilização de modelos animais na pesquisa científica está sob constante pressão para identificar novas metodologias para reduzir o uso de animais, melhorando a precisão científica ea velocidade. Um grande desafio para diretores de Hume no entanto, é a forma de garantir os estudos são estatisticamente preciso, reduzindo a morbidade das doenças animais e números totais. Estudos de eficácia de vacinas actualmente requerem um grande número de animais, a fim de ser considerado estatisticamente significativo e muitas vezes resultam em morbidade e mortalidade terminais para a identificação de protecção imunitária. Utilizamos sistemas de imagem in vivo (IVIS) em conjunto com uma enzima bioluminescente pirilampo para controlar progressivamente a invasão do sistema nervoso central (SNC) através de uma ciaphalitic vírus em um modelo murino. Tipicamente, a doença progride de forma relativamente lenta, no entanto a replicação do vírus é rápida, especialmente dentro do sistema nervoso central, e pode levar a um resultado, muitas vezes, fatal. Após a infecção intranasal de murganhos com TC83-Luc, uma estirpe de vírus atenuado da encefalite equina venezuelana modificado para expressão de um gene da luciferase, somos capazes de visualizar a replicação do vírus no cérebro, pelo menos, três dias antes do desenvolvimento de sintomas clínicos de doença. Utilizando invasão do SNC como objectivo o desenvolvimento de doença encefálica chave que são capazes de identificar rapidamente terapêutico e proteção da vacina contra TC83-Luc infecção antes de desenvolver os sintomas clínicos. Com a tecnologia IVIS somos capazes de demonstrar o teste rápido e preciso de drogas e vacinas terapêuticas, reduzindo o número de animais e da morbilidade.

Com um vírus geneticamente modificado, TC83-Luciferase, vimos um aumento na intensidade do sinal bioluminescente como a replicação do vírus se move da região nasal para o SNC central (Figura 1). Devido à elevada taxa de replicação viral, esperamos ver altos níveis de sinal de bioluminescência (Figura 2A) que dependem do vector e a resposta dos animais imunes ao vector. Esperamos que este aumento de sinal para prosseguir até atingir um pico, entre 5-7 dias após a infecção, ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus at JoVE.com

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualmente utilizados. A capacidade de utilizar animais individuais sobre múltiplos pontos temporais garante condições de polícia reduzidos, custos e morbidade global para os animais utilizados garantir um meio mais humanas e mais científica do estudo da doença.

In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

20.5K visualizações.  University of Texas Medical Branch. Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualm...