منحة معهد NIH-بالحركة UTMB العلوم 1UL1RR029876-01 وبراثير اليشا لمساعدتها مع تحرير الفيديو لهذه المخطوطة.

1. إعداد الحيوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصول الحيوان: ولدى وصوله إلى مستوى السلامة الأحيائية الحيوانية 2 (ABSL2) المرافق، والسماح الحيوانات ما لا يقل عن 2 يوما ليتأقلم مع بيئته الجديدة. بعد هذه الفترة بقية، وفحص الحيوانات لتقييم صحتهم والمظهر الخارجي بشكل عام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استخدام صحفيين الفلورسنت من المهم أن تضع جميع المواد الحيوانية على نظام غذائي البرسيم مجانا للحد من كمية من تألق ذاتي وGI إشارة الخلفية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلاقة الحيوانات: تحسين الكشف عن إشارة bioluminescent من منطقة الجمجمة أثناء التصوير؛ يحلق رؤوس جميع الحيوانات. تخدير الحيوانات مع خليط من غاز الأكسجين وتبخيرها isoflurane. مرة واحدة في تخدير الحيوانات بشكل كامل، استخدم كليبرز الكهربائية لحلاقة رؤوسهم. بعد الانتهاء من الحلاقة مع، والعودة إلى أقفاص الحيوانات ومراقبة للشفاء التام من آثار التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيانات الطبيب الحيوينظم الإدراج باقة (BMDS) (بحيث تنعقد بعد الحلاقة من الفئران في حين أن الحيوانات هي تخدير كامل): للحصول على وسيلة أقل الغازية لتتبع زرع درجة حرارة مبرمج مسبقا باقة اللاسلكية BMDS تحت الجلد في المنطقة الظهرية من كل الماوس. هذه المجاوبة تسمح لتحديد اللاسلكية وتسجيل درجات الحرارة. بعد زرع باقة، وتطبيق لاصقة الأنسجة البيطرية الصف على الجرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المعطيات الأساسية: قبل الإصابة، تسجيل درجة حرارة خط الأساس والوزن لجميع الحيوانات. جمع الدم للتحليل البلاك تحييد التخفيض (PRNT) من خلال اختبار تنزف (RO) خلف الحجاج في حين أن الفئران هي تحت التخدير. بعد جمع الدم، وتطبيق مرهم العين المضادات الحيوية البيطرية للحد من إمكانية العدوى البكتيرية الثانوية. وينبغي استكمال هذه المجموعة خط الأساس مع مراعاة عدد المرات يتم وضع الحيوانات تحت التخدير بسبب الضغط على الفئران. المستقبل مجموعات RO قhould معها يكتمل بعد التصوير، في حين لا يزال الماوس تحت تأثير مخدر. ينبغي أن الدم التي تم جمعها من أقصى RO يكون حوالي 200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العدوى: الفئران مكان تحت التخدير كما هو موضح سابقا. التخزين المؤقت من خلال تطعيم الطريق داخل الأنف باستخدام جرعة من PFU 6 إلى 7 5x10 5x10-TC83 وسيفيراز في حجم ما مجموعه 40 ميكرولتر من الفوسفات المالحة المخفف (PBS) من خلال العدوى داخل الأنف. بعد العدوى، ضع داخل قفص الفئران السكن ومراقبة الانتعاش. </li></ol> 2. الحيوان التصوير تنويه: حافظ على الفئران داخل الوحدة السكنية الخاصة بهم، ومجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (BSC)، أو مربع الاحتواء XIC في جميع الأوقات. وBSCS المعتمدة لهذا البروتوكول هي نوع II B1 B2 أو فئة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن جميع الحيوانات مع 10 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم من وسيفيرين (IP) داخل الصفاق بتركيز 15 ملغ / مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران تلقي Ampligen أن تكون injecteد IP بجرعة قدرها 12.5 وزن الجسم ملغ / كغ في -4 ساعة عدوى أو آخر العدوى +48 آخر ساعة بناء على جماعتهم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحقن مع وسيفيرين، فصل الفئران إلى مجموعات من ثلاثة لضمان تناسب المناسبة ضمن مربع الاحتواء XIC-3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجميع والتصوير، واستخدام مرهم العين / زيوت التشحيم لمنع جفاف القرنية في جميع أنحاء الداخلي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج واضغط على LivingImage تهيئة لإعداد مربع التصوير؛ مجموعة إنقاذ السيارات، والتعرض لوقت السيارات (زمن التعرض على السيارات هي ميزة جديدة للبرنامج LivingImage 3.2 و أحدث)، عرض الحقل لC، ومرشح لفتح؛ الميدانية ويستند نظر على عدد من الفئران كنت التصوير، ويمكن أن يكون الأمثل تصفية حسب الحاجة لمشاريع التصوير الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الهواء مرشحات الفحم لم منتهية الصلاحية، خزان الأوكسجين ممتلئة، ويتم تعبئة الخزان isoflurane. وضع شرائط صغيرة من الشريط الكهربائي في الاول XIC-3 للمربع تحلول الذي يساعد في تقليل حركة الحيوانات خلال التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الفئران مع وسيفيرين IP كما هو موضح في القسم 2.1 ومكان داخل غرفة تحريض Isoflurane (مع غطاء فتح) لمدة 3-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5 دقائق، أغلق غطاء للغرفة تحريض وبدء تدفق isoflurane. التي يتم فيها تشغيل مخدر في حوالي 3-5٪ مع معدل تدفق الأوكسجين مجموعة في حوالي 2.0 L / دقيقة. مرة واحدة بشكل كامل وعيه الانتظار 30 ثانية إضافية ونقل الفئران إلى مربع العزلة XIC-3. ضمان سلامة الأحيائية مجلس الوزراء يجري استخدامها يسمح لمسح آمنة من isoflurane كما سيشمل هذا الإجراء فقدان isoflurane من غرفة التحريض (وحدة IVIS يحتوي على قنابل خاصة بها العادلة سلبية واحتواء مربع XIC-3 يربط مباشرة إلى داخل / خارج مآخذ لضمان تدفق الواردة مخدر). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الفئران على أساس رقاقة / المجموعة رقم في خانة العزلة XIC-3 مع موصل إرفاق isofluraneد فتح. وضع الفئران بحيث يتم وضع هذه الطائرات في الاستلقاء القصية مع رؤساء يستريح بلطف على شرائط الشريط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح أسفل مربع الاحتواء XIC بأيد الإيثانول رذاذ، والجزء السفلي من 3-XIC مع cavicide، ونقل إلى غرفة التصوير IVIS. أعد توصيل التخدير إلى مربع الاحتواء مرة واحدة داخل وحدة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة بعد حقن وسيفيرين، صورة الفئران من خلال البرنامج الصورة الحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير الأولي مع مرشح فتح، بدء DLIT الأبعاد 3-التصوير باستخدام تحليل تسلسل وصورة لمعالج إعداد وسيفيراز اليراع bioluminescent. هذه العملية سوف تأخذ دقيقة التصوير 4-5 وينبغي أن تستكمل في مجال الرؤية ذات الصلة لعدد من الفئران المطلوب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيفو السابقين التحليل التشريح الممكنة التالية وجمع من الدماغ. وضع الدماغ على طبق بتري معقمة، بالتنقيط 50-100 ميكرولتر من وسيفيرين الأسهم على أعلى، ويتم في معهد العالم العربيجينج مربع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اللمسات الأخيرة في الثانية صورة مرشح مفتوحة في 15-17 دقيقة الإصابة آخر عند الانتهاء من التصوير DLIT. ضمان تحليل تسلسل إيقاف ويتم إرجاع مجال الرؤية وضبط مرشح لالإعدادات السابقة. </li></ol> 3. الفئران العودة وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف المرذاذ isoflurane ونقل مربع الاحتواء XIC العودة الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران مرة أخرى داخل الوحدة السكنية الخاصة بهم، أغلق الأعلى، رش السطح الخارجي مع مطهر والمكان المناسبين مرة أخرى على الرف الإسكان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وانتعشت ضمان الفئران تماما من التخدير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء أعلاه والتجربة يتطلب التصوير حتى اكتمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير BSC، إيقاف تشغيل المعدات، ونقل جميع البيانات إلى موقع مختبر خارج لمزيد من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات وتوليد الأبعاد 3-الصور استنادا إلى نتائج IVIS التهاب المسالك البوليةlizing البرنامج LivingImage. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة ضمان موجه بشكل صحيح والإضاءة / تم تعيين لون التوازن. داخل لوحة الأداة الخيارات ادراج صورة ضبط والإصلاحيات ومعلومات الصورة، وأدوات ROI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأشكال ROI لتحديد نقاط القوة إشارة محددة على أساس الموقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة بناء تضاريس سطح الجسم لتسليط الضوء على الماوس، 3D تهيئة DLIT إعادة الإعمار، واستخدام مناسبا خطية لضبط الجهاز الخريطة الطبوغرافية لإعادة إعمار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن تكتمل بمزيد من التحليل، من خلال المعايرة الفيروسية جمع الدم والأعضاء. تم الانتهاء المعايرة في هذه الدراسة من خلال تجانس أنسجة المخ في تعديل النسور المتوسطة (MEM). تم تخفيفه بشكل متسلسل في جناسة ونحن المصابة لوحة 6 جيدا من الخلايا فيرو لمدة 1 ساعة. تمت تغطية الخلايا مع تراكب agarose/2xMEM 1.5٪ وحضنت لمدة 2 أيام في 37 درجة. تم إصلاح الخلايا مع الفورمالين 10٪ لمدة 30 دقيقة وملطخةالكريستال البنفسجي. </li></ol>

<ol>
	<li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H/HeN+and+BALB/c+Mice.">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li><li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice.">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li><li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse.">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li><li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis.">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li><li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection:+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals.">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li><li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals.">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li><li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+indicators+in+living+mammals.">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li><li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging.">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592 (2009).</li><li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors.">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds:+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus.">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li><li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection.">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في حين أن هذا البروتوكول يغطي جوانب التصوير لفي تحليل الجسم الحي، فمن المهم التعرف على ناقلات bioluminescent كعامل أساسي للدراسات المستقبلية. استخدام لدينا من TC83، وهي سلالة اللقاح الموهن من VEEV، كناقل للتعبير عن وسيفيراز يضمن أن يجري انتاج كميات كبيرة من انزيم بسب...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> D-وسيفيرين </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS نظام (الطيف) </td><td> الفرجار العلوم الحياتية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XGI-8-الغاز تخدير النظام </td><td> الفرجار العلوم الحياتية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XIC-3 الاحتواء صندوق </td><td> الفرجار العلوم الحياتية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4،0 البرمجيات </td><td> الفرجار العلوم الحياتية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> القياس عن بعد / تحديد رقائق </td><td> الطبيب الحيوية لنظم البيانات </td><td> IPTT-300 </td><td> ID الحيوانية والمزاجature </td></tr><tr><td> BD انتيغرا حقنة TB 1ML مع 26 GX إبرة 3/8 &quot; </td><td> فيشر العلمية </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> التعليم والتدريب المهني لاصقة بوند الأنسجة </td><td> فيشر العلمية </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Vetropolycin العيون مرهم </td><td> ويبستر منتجات البيطرية </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة 1X </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS المعالج قارئ </td><td> الطبيب الحيوية لنظم البيانات </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-HOST البرمجيات </td><td> الطبيب الحيوية لنظم البيانات </td><td></td><td> تستخدم لتنزيل معلومات التحقيق </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) detection of a neuro-invasive encephalitic virus

التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير تشجيع مواصلة تطوير وصقل في الطريق ويتم إنجاز البحوث الفيروسية. اقترح في البداية من قبل رسل وبورش في 3Rs هيوم (استبدال، والحد، والصقل)، واستخدام نماذج حيوانية في البحث العلمي تحت ضغط مستمر لتحديد منهجيات جديدة للحد من استخدام الحيوان مع تحسين الدقة العلمية والسرعة. ومن التحديات الرئيسية لمديري هيوم ومع ذلك، هو كيفية ضمان دراسات إحصائية دقيقة مع تقليل المراضة الحيوانية من الأمراض والعدد الإجمالي. الدراسات نجاعة اللقاح تتطلب حاليا عدد كبير من الحيوانات من أجل أن تعتبر ذات دلالة إحصائية وغالبا ما تؤدي إلى ارتفاع معدلات المراضة والوفيات النهاية لتحديد الحماية المناعية. نحن تستخدم في الجسم الحي التصوير أنظمة (IVIS) بالتزامن مع انزيم bioluminescent اليراع لتتبع تدريجيا غزو الجهاز العصبي المركزي (CNS) من قبل سينعقدphalitic الفيروس في نموذج الفئران. عادة، يتطور المرض ببطء نسبيا، ولكن تكاثر الفيروس سريعا، وخاصة داخل الجهاز العصبي المركزي، ويمكن أن يؤدي إلى نتيجة، وغالبا مميتة. بعد العدوى داخل الأنف من الفئران مع TC83 لوك، وهو الموهن الفنزويلي فيروس التهاب الدماغ الخيلي سلالة معدلة ليعبر عن الجين وسيفيراز، ونحن قادرون على تصور تكاثر الفيروس داخل الدماغ على الأقل قبل ثلاثة أيام من ظهور أعراض المرض السريري. استخدام CNS الغزو كمفتاح بالتهاب الدماغ مرض نقطة النهاية التنمية ونحن قادرون على التعرف بسرعة العلاجية وحماية قاح ضد TC83 لوك العدوى قبل ظهور الأعراض السريرية تطوير. مع التكنولوجيا IVIS ونحن قادرون على إظهار اختبار سريع ودقيق من العلاجات واللقاحات المخدرات مع تقليل أعداد الحيوانات والاعتلال.

مع فيروس معدل وراثيا، TC83-وسيفيراز، رأينا زيادة في قوة الإشارة bioluminescent كما تكاثر الفيروس ينتقل من منطقة الأنف في CNS المركزية (الشكل 1). نظرا لمعدل تكاثر الفيروس عالية، ونحن نتوقع أن نرى مستويات عالية من إشارة bioluminescent (الشكل 2A) تعتمد على ناقلات الأمراض ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus at JoVE.com

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

استخدام وسيفيراز ونظم التصوير في الجسم الحي (IVIS) كوسيلة جديدة لتحديد النقاط النهائية السريرية التطورات المرض قبل أن يحدث. وقد سمح لنا IVIS لتصور في الوقت الحقيقي غزو الفيروسات بالتهاب الدماغ خلال الأيام متعددة، وتوفير نموذج المرض أكثر دقة للدراسة في المستقبل. وقد سمح ذلك لنا أيضا لتحديد ملامح المحتملة واقية من الأدوية المضادة للفيروسات واللقاحات أسرع من النماذج الحيوانية المستخدمة حاليا. القدرة على الاستفادة من الحيوانات الفردية على نقطة زمنية متعددة يضمن متطلبات الحيوانات خفضت، والتكاليف، والاعتلال الكلي للحيوانات تستخدم وسيلة ضمان أكثر إنسانية وأكثر من دراسة علمية المرض.

في الجسم الحي التصوير كشفها (IVIS) نظم لفيروس العصبية الغازية ملتهب الدماغ

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

20.5K Views.  University of Texas Medical Branch. استخدام وسيفيراز ونظم التصوير في الجسم الحي (IVIS) كوسيلة جديدة لتحديد النقاط النهائية السريرية التطورات المرض قبل أن يحدث. وقد سمح لنا IVIS لتصور في الوقت الحقيقي غزو الفيروسات بالتهاب الدماغ خلال الأيام متعددة، وتوفير نموذج المرض أكثر دقة للدراسة في المستقبل. وقد...

Video: In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

غير الغازية تصوير الزاجل كريات بيضاء والهجرة في الجسم الحي</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

تقدير معدلات الإنتاج الفيروسات في النظم المائية

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

البكتيرية التصوير Bioluminescent<em&gt; في الجسم الحي</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...