עבודה זו נתמכת על ידי קרני אתחול ממעבדת ג&#39;קסון.

1. הכנת תרבות גליה מאוסה למיזוג תרבות עצבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T75 צלוחיות מצופות בפתרון קולגן (01:03 דילול Purecol בDDH 2 O). את הצלוחיות נקבעות זקופות והשאירו לייבוש למשך הלילה בברדס תרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ דיסקציה (aCSF: 119 mM NaCl, 5 המ&quot;מ KCl, 1 המ&quot;מ MgCl 2, 30 המ&quot;מימ דקסטרוז, 25 HEPES מ&quot;מ, 7.4 pH, ללא סידן) ותקשורת גליה (DMEM בתוספת 10% FBS, 10 יחידות / המ&quot;ל פניצילין, 10 מיקרוגרם / המ&quot;ל סטרפטומיצין, וGlutamax) מוכנים ומאוחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של תרבות גליה, תקשורת גליה היא חממה במשך לפחות 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני הנתיחה של מוח עכבר. עכברים עובריים או ילוד מורדמים באמצעות עריפת ראש מהירה. cortexes מוחיה הם נתחו את הנתיחה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מוח גזור מתעכלות בפתרון פפאין (100 המ&quot;ל פפאין וμl% DNase אני 20 1 בחיץ נתיחת מ&quot;ל 2) על 37 מעלות צלזיוס fo20 דקות r. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עיכול פפאין, רקמות מוח נשטפות עם 10 תקשורת גליה מראש חמם מ&quot;ל. תקשורת גליה הטריה (2 מ&quot;ל) נוספה לאחר מכן לרקמות המוח מתעכלת, ואת הרקמות נכתשה עם זכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת גליה הטריה (8 מ&quot;ל) הוא הוסיף לרקמות ניתקו. תא מסננת 70 מיקרומטר משמש לסינון השעית הרקמה ניתקה. תאים אז נזרע לתוך צלוחיות T75 (בדרך כלל 2-3 עוברים 1 T75 בקבוקון זרע יכול) ולהציב לתוך 37 מעלות צלזיוס תא תרבות חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, התקשורת מT75 צלוחיות היא aspirated. את הצלוחיות נשטפות עם 10 המ&quot;ל PBS. תקשורת גליה הטריה (10-15 מ&quot;ל) ואז הוא הוסיף לכל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10-12 ימים, גליה בT75 צלוחיות צריכה להיות confluent. תאי גליה נשטפים עם PBS, ו5 מ&quot;ל של טריפסין 0.05% נוספים לכל T75 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרת טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, תאי גליה הם תאי גלייה וניתקו מכל T75 בקבוק נחלקים לשנייםקולגן מצופים T75 צלוחיות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדיר תרבות (Millipore PICM03050) מוכנים על ידי צבת אותם לצלחות 6 היטב, ציפוים בקולגן, וייבוש באוויר-בן הלילה. תקשורת גליה (2 מ&quot;ל כל אחת) ממוקמת מתחת לכל תותב תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גליה מT75 צלוחיות confluent הם trypsinized וזרע אל מחדיר התרבות (1 T75 בקבוק לצלחת 6 היטב, 2 מ&quot;ל כל הוספה). מחדיר תרבות גליה אלה ישמשו למצב התרבויות העצביות. </li></ol> 2. תרבות עצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את coverslips הזכוכית עבור התרבות העצבית מנוקה על ידי שרייה ב70% 3 HNO לפחות לילה. Coverslips מכן שטף עם 2 לפחות 3 פעמים DDH O, ולייבש בתנור Isotemp (&gt; 200 מעלות) למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips ניקה מונחים בצלחת 6-טובה, אחד לכל coverslip היטב. Coverslips מצופים בפתרון פולי-L-ליזין (2 מ&quot;ל, 0.1% בחומצה בורה 100 מ&quot;מימ, pH = 8.5) בלילה 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">פתרון פולי-L-ליזין הוא להסיר את coverslips וcoverslips נשטפים 3 פעמים עם autoclaved DDH 2 O. Coverslips אז מודגרת ב37 מעלות צלזיוס חממה בלילה בתקשורת ציפוי (Neurobasal להשלים עם סרום 5% חום מומת סוס, 10 יחידות / המ&quot;ל פניצילין, סטרפטומיצין 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל, Glutamax; 2% B27 תוסף מתווסף למדיום הציפוי ביום בו שימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, תקשורת הציפוי מוסרת ו2 מ&quot;ל של מדיה ציפוי טריה עם B-27 נוסף לכל גם שיש coverslip זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברות הרות (E15-18) מורדמות עם CO 2, ועכברים עובריים מורדמים באמצעות עריפת ראש. ההיפוקמפוס או סטריאטום הוא גזור מרקמת המוח ולהציב לתוך צינור חרוטים 15 מ&quot;ל עם חיץ קר כקרח נתיחה, לתרבות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים קוצניים בינוניים striatal, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מוח גזור הן ניתקו עם פפאין כמתואר בשלבי 1.4) ו -1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Following דיסוציאציה, מספר התאים בכל השעיה עצבית נספר עם hemocytometer. הנוירונים מכן נזרעו על כל coverslip בצפיפות של 0.4 x 10 6 תאים לכל היטב של צלחת 6-היטב, ותרבית ב37 מעלות צלזיוס חממת הלילה (הנוירונים DIV 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין מחדיר תרבות גליה למיזוג התרבויות העצביות, תקשורת גליה יוסרה ממחדירה תרבות גליה ובינונית ציפוי טרי מתווספת (2 מ&quot;ל ובהוספת 2 מ&quot;ל מתחת למסגרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (DIV 1), coverslips עם נוירונים ממוקמים מתחת מחדיר תרבות גליה, coverslip אחד בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים ניזונים במחצית הנפח של המדיה טריה חומם מראש האכלה (עם B-27) כל 3-4 ימים עד שהם מוכנים לניסויי transfection והדמיה. </li></ol> 3. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection העצבי מתבצע באמצעות Lipofectamine 2000. לכל תרבות העצבית (תרבות אחת לכל coverslip), 2 μlLipofectamine 2000 ומיקרוגרם 1 של ה-DNA משמשים. בינוני Neurobasal טרי עם שום תוסף משמש לדילול Lipofectamine וה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA וLipofectamine מודגרת למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר לאחר הערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 1 מ&quot;ל של תקשורת מכל עלון מתחת תרבות גליה, ו1 מ&quot;ל מתוך כל הוספה, ולהעביר את התקשורת לצינור חרוטים. הוסף את אותו הנפח של תקשורת מלבה + B27 למדיום הציל ולדגור על 37 ° C. בינוני זו משמשת לתרבות עצבית בעקבות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת 20-דקות Lipofectamine / דנ&quot;א, מחדירה תרבות גליה יוסרו רגעי מהצלחות 6-כן. תערובת Lipofectamine / דנ&quot;א 200 μl מתווספת לכל coverslip עם הנוירונים. מחדיר תרבות גליה מכן חזר לכל באר, מעל לנוירונים. דור של בועות תחת הקרום של מחדירה התרבות יש להימנע. הנוירונים מודגרת עם תערובת Lipofectamine / דנ&quot;א על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדואר תקופת 2-4 שעתי דגירה, מוסיפה גליה יוסרה שוב. תקשורת התרבות עם תערובת Lipofectamine / DNA היא תוסר מכל טובה. התקשורת שנשמרה בשלב 3.3) מתווספת לנוירונים (2 מ&quot;ל לטוב). מחדיר תרבות גליה מוחזרים לכל באר, והתקשורת מכל גליה להוסיף מוסרת, ו2 מ&quot;ל של התקשורת מצעד 3.3) הוא הוסיף לכל הוספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים בתרבית ל24-72 שעות נוספות כדי לאפשר ביטוי של cDNA transfected לפני TIRF ההדמיה מבוצע על הנוירונים האלה. </li></ol> 4. TIRF הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF: 119 mM NaCl, KCl 2.5 מ&quot;מ, גלוקוז 30 מ&quot;מימ, 2 המ&quot;מ CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 HEPES מ&quot;מ, pH = 7.4) ישמש לניסויים חייה הדמיה. מערכת הדמית TIRF היא מותאם אישית הגדרה עם 100-mW ציאן ליזר לעירור, וחיוב כפל אלקטרוני מצמידי מכשיר מצלמה (EMCCD) לגלאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניסויי הדמיה, aCSF הוא הזהיר ב37 &amp; dלמשל; אמבט מי C לפחות 30 דקות. להוסיף החימום להדמיה חייה ממוקם על במת מיקרוסקופ, ולהוסיף החימום, ליזר, והמצלמה התחממו לפחות 30 דקות לפני תחילת ניסויי ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip עם הנוירונים transfected הוא כנס לתוך התא חייה ההדמיה. ACSF מראש התחמם הוא ממוקם בתא אחרי התא מורכב; שלב זה אמור להסתיים במהירות אפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתא ממוקם על הוספת החימום על במת מיקרוסקופ, הנוירונים transfected מזוהים ויזואלית תחת מצב הדמיה עלית ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נוירונים בריאים transfected מזוהים (ראה איורים 1 ו 2), אנחנו בדרך כלל לבצע 1 דקות של צילום אקונומיקה כדי לחסל פלואורסצנטי pHluorin קיים מראש על קרום הפלזמה, כמו pHluorin-קולטנים על קרום הפלזמה יש רמות גבוהות מאוד כאשר קרינה TIRF ההדמיה ראשונה התחילה, אשר מפריע להדמיה של תוספות אישיותאירועי ertion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות photobleach, הגדרת מכפיל הרווח של האלקטרון במצלמת EMCCD מוגדרת למקסימום, וההקלטה מתבצעת על דקות 1 ב 10 רץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הקלטה תכיל 600 תמונות. אירועי הכנסה מזוהים בשמם על ידי משחק חזרה ההקלטה באמצעות ImageJ. אירועי החדרה בודדים מנותחים באופן ידני באמצעות ImageJ. </li></ol> 5. נציג תוצאות התרבות העצבית העקבית היא המפתח לניסויים מוצלחים חייה הדמיה. איור 1 מציג נוירונים ביפוקמפוס עכבר התרבית באמצעות פרוטוקולנו בין 11 ל DIV דיב 18. זה ברור מהתמונות שהנוירונים פתחו תהליכים נרחבים וכי התהליכים דנדריטיים מכוסים בצפיפות עם קוצים הדנדריטים, סימנים שהנוירונים האלה הם בריאים בתרבות. פרוטוקול התרבות שלנו יכול לשמש גם לסוגים אחרים של תאי עצב במוח. לדוגמה, לאחרונה שימוש בפרוטוקול זה לתרבותהנוירונים striatal בינוניים קוצניים במחקר במטרה לבחון הקולטן D2 דופמין (DRD2) כניסה בנוירונים בתרבית עכבר striatal בינוני קוצני 9. איור 2 מראים נוירונים קוצניים בינוניים striatal עכבר תרבית באמצעות פרוטוקולנו בDIV 8. יש לנו גם בצע בהצלחה TIRF הדמיה של DRD2s pHluorin המתויג-superecliptic בסוג זה של תא עצב. איור 3 מציג ביטוי של pHluorin מתויג-DRD2 (pH-DRD2) בנוירון בינוני קוצניים ויזואליזציה של pH-DRD2 כניסה בתא עצב זה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> איור 1. תרבות היפוקמפוס עכבר תוך שימוש בשיטת תרבות הממשק. DIV: ימים במבחנה, ביום של התרבות נחשב DIV 0. מהתמונות ניכר כי נוירונים ביפוקמפוס הבוגרים בסוג זה של התרבות שבין 11 ל 15 DIV DIV. בשעת 11 וDIV 13, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצי filipodia ולא בשלים. בגיל 15 וDIV18, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצים גדולים, אינדיקציה של נוירונים בוגרים יותר. לוחות שמאל:-הגדלה נמוכה תמונות של נוירונים ביפוקמפוס עכבר בגילים שונים. לוחות נכונים: תמונות בהגדלה גדולה (זום על הדנדריטים עצביים של הפנל השמאלי) של תהליכים דנדריטיים עצביים עם קוצים הדנדריטים בגילים שונים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> איור 2. התרבות המאוסה striatal הבינוני הקוצנית נוירון בשיטת תרבות הממשק. הנוירונים שבתמונות הם בDIV 8. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> איור 3. נוירון עכבר striatal הבינוני הקוצני transfected עם סופר קולט האקליפטית pHluorin מתויג-דופמין D2 (pH-DRD2). תמונה מהשמאל היא הקרנת עוצמתו מרבית של הקלטת זמן לשגות (600 תמונות, 100 אלפית שני לכל תמונה). ראשי חץ לבנים מצביעים על החדרת שלפוחי בודדה של pH-DRD2. תמונה זו שומרת מידע הכנסה בממד xy אבל מאבדת את המידע בזמן. תמונה מהימין מציגה הקרנת עצמה מרבית yt, שבו מחסנית xyt היא מסובב 90 מעלות סביב ציר y, ופיקסל המקסימאלי בכל שורת ציר x מוקרן על פיקסל בודד ציר y. תמונה זו שומרת מידע החדרה לאורך ציר yt אבל מאבדת את מידע ציר x.

<ol>
	<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li><li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA.">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li><li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK.">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li><li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+(GluR2)+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization.">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li><li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites.">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li><li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N,+phosphorylation.">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li><li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor.">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li><li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion.">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane.">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li><li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li><li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+AMPA+receptors+(AMPARs)+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs.">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li><li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses.">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP:+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis.">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li><li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience.">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li><li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity.">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors.">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מסיבות שאינן ידועות, הנוירונים עכבר הם תמיד קשים יותר לתרבות מאשר תאי עצב בעכברים. מניסיוננו, תרבות מעורבת של תאי עצב וגליה עובדת היטב עבור נוירונים עכבר תרבית ראשוניים. עם זאת, תרבות כזו מעורבת אינה מתאימה לניסויי TIRF הדמיה, כמו בסוג זה של נוירונים התרבות והתהליכים של...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגים</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פתרון קולגן שור מטוהר (Purecol)</td&gt;<td&gt; המתקדם Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פניצילין סטרפטומיצין (עט דלקת)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פירובט נתרן</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקוז הגבוה DMEM</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סרום שור עוברי (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פפאין</td&gt;<td&gt; ורטינגטון קורפ יוכימית</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease אני מלבלב שור (DNase)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10 מ&quot;ג</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdפוספט&gt; של Dulbecco נאגר מלוח (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0.05% טריפסין</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdhydrobromide&gt; פולי-L-ליזין</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חומצה בורה</td&gt;<td&gt; פישר סיינטיפיק</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בינוני Neurobasal</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 תוספת סרום חינם</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סרום סוס חום פעיל</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; פישר סיינטיפיק</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&lt;הוספת תרבות</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons

הבנה טובה יותר של מנגנונים המסדירים את הסחר בין קולט הפלזמה ממברנה (PM) והתאים תאיים דורשת גישה ניסויית להחלטות מרחב ובזמן מצוינים. יתר על כן, גישה כזו יש גם יש יכולת להבחין קולטנים מותאמים בצהריים מאלו בתאים תאיים. והכי חשוב, גילוי קולטנים בשלפוחית ​​אחת דורש רגישות גילוי יוצאת דופן, שכן כל שלפוחית ​​נושא רק מספר קטן של קולטנים. גישות סטנדרטיות לבחינת סחר קולט כוללות biotinylation פני שטח בעקבות זיהוי ביוכימי, שאין לו לא את ההחלטות דרושות מרחב ובזמן; ובדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הקולטנים immunolabeled, אשר דורשים קיבוע כימי של תאים ולכן לוקה ברזולוציה הטמפורלית מספיקה 1-6. כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנחנו ואחרים פתחנו והעסקנו Stra חדשtegy המאפשר הדמיה של ההחדרה הדינמית של קולטנים לשעה עם רזולוציות מרחב ובזמן מצוינים 7-17. הגישה כוללת תיוג של ה-GFP-pH רגישה, 18 pHluorin superecliptic, לתחום התאי N-המסוף של הקולטנים. Superecliptic pHluorin יש את המאפיין הייחודי של הניאון ב-pH הניטראלי ולא ניאון ב-pH חומצי (pH &lt;6.0). לכן, את הקולטנים המתויגים הם כאשר אנשים שאינם ניאון בתוך לומן חומצי של שלפוחית ​​סחר תאי או תאי endosomal, והם הופכים בקלות דמיינו רק כאשר הם נחשפים לסביבת ה-pH הניטראלית התאית, על פני השטח החיצוניים של ראש הממשלה. האסטרטגיה שלנו וכתוצאה מכך מאפשרת לנו להבחין הקולטנים PM מאלה בתוך שלפוחית ​​סחר תאית. כדי להשיג החלטות מספיק מרחב ובזמן, כמו גם את הרגישות הנדרשת כדי ללמוד סחר דינמי של קולטנים, שהועסקנו כולל פנימי משקףמיקרוסקופיה יון הניאון (TIRFM), שאפשר לנו להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של דימות אופטי (~ 170 ננומטר), ההחלטה הזמנית של מיקרוסקופיה וידאו שיעור (30 מסגרות / שני), ואת הרגישות לגילוי קרינה של ה-GFP אחת מולקולה. על ידי הדמית pHluorin-תויג תחת קולטנים TIRFM, הצליחו ישירות לדמיין אירועי הכנסת קולט בודדים לתוך PM בנוירונים בתרבית. גישת הדמיה זו יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת על כל חלבון קרום בתחום תאי שאפשר לתייג עם pHluorin superecliptic, ותאפשר נתיחה של המנגנונים המפורטים המרכזיים שמנחים החדרה של חלבוני קרום שונים (קולטנים, תעלות יונים, מובילים, וכו &#39;) כדי PM.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons at JoVE.com

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

על ידי תיוג התחומים התאיים של קולטנים בממברנה עם pHluorin superecliptic, ועל ידי הדמית קולטנים היתוך אלה בתרבית תאי עצב של עכבר, אנו יכולים לחזות אירועים ישירות החדרת שלפוחי בודדים של הקולטנים לממברנת הפלזמה. טכניקה זו תהיה סייעה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים הכנסת קולט לממברנת הפלזמה.

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Views.  The Jackson Laboratory. על ידי תיוג התחומים התאיים של קולטנים בממברנה עם pHluorin superecliptic, ועל ידי הדמית קולטנים היתוך אלה בתרבית תאי עצב של עכבר, אנו יכולים לחזות אירועים ישירות החדרת שלפוחי בודדים של הקולטנים לממברנת הפלזמה. טכניקה זו תהיה סייעה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים הכנס...

Video: Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...