这项工作是从杰克逊实验室的启动资金支持。

1。准备鼠神经胶质细胞培养的神经元培养空调<ol><li>涂有胶原蛋白溶液（1:3稀释Purecol DDH 2 O中）的T75烧瓶。烧瓶一身正气，干通宵的组织文化引擎盖。 </li><li>夹层缓冲液（人工脑脊液：119 mM氯化钠，5 mM KCl中，1毫摩尔MgCl 2和30mM葡萄糖，25mM的HEPES，pH值7.4，无钙）和神经胶质细胞介质（DMEM培养液与10％胎牛血清，10单位/ ml青霉素，10 μg/ ml链霉素，和Glutamax）的制备和贮存在4℃下，直到准备使用。 </li><li>在当天的神经胶质细胞培养，神经胶质细胞介质加热在37°C水浴老鼠的大脑解剖前至少30分钟。小鼠胚胎或新生儿安乐死的快速斩首。在解剖显微镜下分离出脑皮层。 </li><li>解剖脑组织在木瓜蛋白酶溶液（100毫升木瓜蛋白酶和20μl1％DNA酶I在2毫升夹层缓冲液）在37℃下消化FOR 20分钟。 </li><li>木瓜蛋白酶消化后，脑组织用10ml预先温热的神经胶质细胞介质漂洗。新鲜的神经胶质细胞的介质（2毫升），然后加入到消化的脑组织，用火抛光的玻璃巴斯德吸管研磨和组织。 </li><li>新鲜的神经胶质细胞的介质（8毫升）中加入游离的组织。 A 70微米的细胞过滤器，用于过滤分离的组织悬液。然后将细胞接种于T75培养瓶（一般2-3个胚胎，种子T75烧瓶），置于37℃细胞培养孵化器。 </li><li>第二天，从T75烧瓶中的是媒体吸气。将烧瓶用10ml PBS漂洗。新鲜的神经胶质细胞介质（10-15毫升），然后加入到每个烧瓶中。 </li><li>在10-12天，神经胶质细胞在T75烧瓶中应该是融合。胶质细胞用PBS漂洗，和5毫升的0.05％胰蛋白酶被添加到每个的T75烧瓶中。 </li><li>胰蛋白酶在37℃下温育5分钟后，神经胶质细胞是从每个T75烧瓶中的解离和神经胶质细胞被分成两个不同的胶原蛋白涂覆的T75烧瓶。 </li><li>培养插入（Millipore公司PICM03050）的制备是通过将它们放置到6孔板中，涂层与胶原蛋白，并空气干燥过夜。神经胶质细胞介质（每次2毫升）置于下方插入每一种文化。 </li><li>胶质细胞用胰蛋白酶消化，并接种到培养插入从汇合的T75烧瓶（1的T75烧瓶中每6孔板中，每次2毫升插入）。这些神经胶质细胞培养插入将使用条件的培养的神经元。 </li></ol> 2。神经元培养<ol><li>神经细胞培养的盖玻片进行清洗浸泡在70％HNO 3，至少过夜。然后用盖玻片DDH 2 O的至少3倍，并且Isotemp烘箱中干燥（&gt; 200℃）中过夜。 </li><li>清洗的盖玻片放置在6孔板中，每孔的一个盖玻片。盖玻片都涂有聚-L-赖氨酸的水溶液（2毫升，0.1％在100mM硼酸，pH值= 8.5）中，在37℃培养箱中培养过夜。 </li><li> “聚-L-赖氨酸溶液的除去从盖玻片和盖玻片与蒸压DDH 2 O洗涤3次盖玻片然后，保温在37℃培养箱中培养过夜的电镀介质（补充有5％热灭活的马血清，10单位/ ml青霉素，10μg/ ml链霉素，Glutamax; 2％B27补充剂的Neurobasal添加到镀介质的当天使用过它）。 </li><li>翌日，除去镀敷介质和2毫升的新鲜电镀媒体与B-27被添加到各孔中，有一个玻璃盖玻片。 </li><li>怀孕的小鼠（E15-18）被安乐死与CO 2，和小鼠胚胎用断头安乐死。海马或纹状体解剖从脑组织中，并用冰冷的夹层缓冲区，用于培养的海马神经元或纹状体介质棘状神经元，分别放入15毫升锥形管。 </li><li>解剖脑组织用木瓜蛋白酶解离，在步骤1.4）和1.5）中所描述。 </li><li> Following解离，每个神经元的悬浮液中的细胞数用血细胞计数器计数。神经元，然后接种于每个盖玻片的6孔板中，每孔的密度为0.4×10 6个细胞，并且培养在37℃的培养箱中培养过夜（神经元是DIV 0）。 </li><li>为了制备用于调节的培养的神经元，神经胶质细胞培养插入的神经胶质细胞介质除去从神经胶质细胞培养插入和新鲜电镀介质中加入下面的插入物中的插入件和2毫升（2毫升）。 </li><li>第二天（DIV 1），与神经元的盖玻片置于下方的神经胶质细胞培养插入，在各孔中的一个盖玻片。 </li><li>神经元的输入与体积的一半新鲜预热的供给媒体（B-27），每3​​-4天，直到他们准备的转染和成像实验。 </li></ol> 3。转染<ol><li>神经细胞转染用脂质体2000。对于每一个神经细胞培养（每一种文化盖玻片），2微升使用脂质体2000和1微克DNA。没有补充新鲜的Neurobasal培养基被用来稀释脂质体和DNA。 </li><li> DNA与Lipofectamine混合后在室温下温育20分钟。 </li><li>下次从每个插入件内部的1毫升的媒体从每个神经胶质细胞培养插管的下方，和1毫升，将介质传送到一个​​锥形管。保存的介质和孵育在37℃，加入相同体积的送入介质+ B27此介质被用于转染后的神经元培养。 </li><li>脂质体/ DNA孵育20分钟之后，神经胶质细胞培养插入瞬间从6孔培养板中除去。 200μl的脂质体/ DNA混合物被添加到每个与神经元的盖玻片。神经胶质细胞培养插入各孔中，然后返回到上述的神经元。文化插入膜下的气泡的生成，应避免。神经元与脂质体/ DNA混合物在37℃下温育2-4小时。 </li><li>后日Ë2-4小时的潜伏期，神经胶质细胞中插入被删除了。与脂质体/ DNA混合物的培养基从各孔除去。步骤3.3）中保存的介质被添加到神经元（2毫升每孔）。神经胶质细胞培养插入返回到各孔，除去从每个插入的神经胶质细胞介质，并从步骤3.3）中的2毫升的介质加入到每个插入件。 </li><li>神经元培养24-72小时，让这些神经元表达的转基因前TIRF成像。 </li></ol> 4。 TIRF成像<ol><li>人工脑脊液（人工脑脊液：119 mM氯化钠，2.5mM的氯化钾，30mM葡萄糖，2mM的的CaCl 2，1毫摩尔的MgCl 2，25mM的HEPES，pH值= 7.4），将被用于活成像实验。我们的TIRF成像系统是自定义设置了100-mW的青色激光激发，电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机的检测器。 </li><li>成像实验前，学联组织警告说，在37＆D例如，C水浴至少30分钟。实时成像的加热刀片被放置在显微镜载物台上，并加热刀片，激光，和摄像机的成像实验开始前至少30分钟温热。 </li><li>与转染的神经元的是，甲盖玻片活成像室组装成。预先温热的人工脑脊液被放置在被组装后的腔室的腔室，此步骤中，应尽可能快地完成。 </li><li>一旦被放置在腔室上的显微镜载物台的加热刀片，转染的神经元被确定视觉外延荧光成像模式下。 </li><li>健康转染后的神经元被识别（参照图1和图2），我们通常执行1分钟的光漂白剂，以消除在质膜上，预先存在pHluorin荧光在质膜上的pHluorin-受体具有非常高的荧光水平时第一次启动TIRF成像，干扰可视化的个人插件ertion事件。 </li><li>光漂白剂，EMCCD相机上的电子倍增器的增益设定是设定为最大，并进行记录，持续1分钟，在10赫兹。 </li><li>每个记录将包含600个图像。个别插入的事件都通过播放录音背面使用ImageJ。个人的插入手动使用ImageJ分析事件。 </li></ol> 5。代表性的成果一致的神经细胞培养的关键是成功的实时成像实验。 图1显示了小鼠海马神经元培养我们的协议从11 DIV息18。很明显，从图像的神经元建立了广泛的过程，而树突覆盖密集的树突棘，迹象表明，这些神经元在文化上是健康的。我们的培养方法也可用于其他类型的神经元在大脑。例如，我们最近使用的协议，以文化纹状体中等棘神经元在一项研究中，研究多巴胺D2受体（DRD2）插入在培养的小鼠纹状体的中等棘神经元9。 图2显示了小鼠纹状体中等棘神经元培养8 DIV使用我们的协议。我们还成功地进行这种类型的神经元中的superecliptic pHluorin标签DRD2s TIRF成像。 图3示出的表达pHluorin标签多巴胺D2（pH值-DRD2）在培养基中的多刺的pH-的DRD2插入在该神经元的神经元和可视化。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> 图1。小鼠海马文化的使用界面培养法。 DIV： 体外日，这一天被认为是文化DIV 0。从图像中，显而易见的是，在这种类型的文化之间的DIV 11和15 DI​​V成熟的海马神经元。在11和13的DIV，神经元树突与filipodia和未成熟棘覆盖。在DIV 1518，神经元树突覆盖着大刺，显示更成熟的神经元。左图：低倍率的图像在不同年龄的小鼠海马神经元。右图：高倍率的图像变焦在左侧面板中的神经元树突的神经元树突，树突棘在不同的年龄。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> 图2。鼠标纹状体中等多刺的神经元培养使用接口的培养方法。在图像的神经元在DIV 8。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> 图3：鼠标纹状体中多刺的神经元转染超黄道pHluorin标记多巴胺D2受体（PH-DRD2）。图片的左边是随时间推移记录的最大强度投影（600个图像，100毫秒每幅图像）。白色箭头指示个人水泡的pH-D插入RD2。此图片保留在xy尺寸的插入信息，但失去的时间信息。在右边的图像示出YT最大强度投影，在其中的XYT堆栈围绕y-轴旋转90度，并在每个x轴的线中的最大像素被投射到一个单一的y轴像素。此图像保留沿YT轴插入信息，但失去了x轴信息。

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	<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li><li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA.">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li><li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK.">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li><li>Lin, D. T., Huganir, R. 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A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane.">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li><li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li><li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity.">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors.">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

不知什么原因，小鼠神经元总是很难培养的大鼠神经元。在我们的经验中，混合培养的神经元和神经胶质细胞的原代培养的小鼠神经元。然而，这样的混合培养TIRF成像实验是不适合的，在这种类型的培养的神经元和其流程往往顶部的神经胶质细胞上生长的情况，神经元的胞体和树突状进程鞭长莫及TIRF显微镜。因此，较低的密度盖玻片上少数神经胶质细胞的神经元培养TIRF成像的理想选择。我们首?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;试剂名称</strong</td&gt;<td<strong&gt;公司</strong</td&gt;<td<strong&gt;产品目录号</strong</td&gt;<td<strong&gt;评论</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;纯化的牛胶原溶液（Purecol）</td&gt;<td&gt;“高级”BIOMATRIX</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hank氏平衡盐溶液（HBSS）</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td青霉素，链霉素（笔链球菌）</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;丙酮酸钠</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM高糖</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;牛胎儿血清（FBS）的</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;木瓜蛋白酶</td&gt;<td沃辛顿生化公司</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;从牛胰脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNA酶I）</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0.05％胰蛋白酶</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;硼酸</td&gt;<td&gt;费舍尔的科学</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal培养基</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27的无血清补充</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;热不活动的马血清</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;脂质体2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen公司</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt;费舍尔的科学</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;企业文化插入</td&gt;<td&gt;密理博</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons

质膜（PM）和细胞内受体之间贩运的机制更好地理解需要具有出色的空间分辨率和时间分辨率的实验方法。此外，这种方法还必须有分辨能力定位于PM在细胞内的受体。最重要的是，检测的受体，在一个单一的囊泡需要优异的检测灵敏度，因为每个囊泡进行只有一小数量的受体。检查受体活动的标准方法，包括表面生物素的生化检测，缺乏必要的空间和时间的决议;和荧光显微镜检查的immunolabeled表面的受体，这需要细胞化学固定，因此缺乏足够的时间分辨率1-6。为了克服这些限制，我们和其他人开发的，采用了一种新STRAtegy，使可视化动态插入的受体出色的空间分辨率和时间分辨率7-17 PM。该方法包括pH敏感的GFP，superecliptic的pHluorin 18的N-末端胞外结构域的受体的标记。 superecliptic pHluorin荧光在中性pH值和非荧光在酸性pH值（pH值&lt;6.0）的独特属性。因此，标记受体的非荧光内酸性细胞内转运囊泡管腔或内体舱室时，它们变得容易地可视化，只有当暴露于细胞外的中性pH值环境上的外表面的PM。因此，我们的战略使我们能够区分PM表面受体，在细胞内囊泡。为了达到足够的空间和时间分辨率，以及学习所需的动态贩卖受体的敏感性，我们采用全内反映离子荧光显微镜（TIRFM），这使我们能够实现光学成像（〜170 nm）的最佳的空间分辨率，时间分辨率的视频率显微镜（30帧/秒），且灵敏度来检测单个GFP的荧光分子。成像pHluorin标记的受体TIRFM下，我们能够直接可视个人到PM培养的神经元受体插入事件。这种成像方法可能被应用于任何膜蛋白的胞外结构域，可以标记superecliptic pHluorin，并且将允许的密钥的详细机制不同的膜蛋白（受体，离子通道，运输等）插入到夹层PM。

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Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

通过标记与superecliptic pHluorin膜受体的胞外域的，并通过成像这些融合在培养的小鼠神经元受体，我们可以直接可视化个别水泡插入事件到质膜的受体。这种技术将有助于阐明受体插入到质膜的分子机制。

成像pHluorin标记插入到质膜受体原代培养的小鼠神经元

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

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Neuroscience

13.1K 次观看.  The Jackson Laboratory. 通过标记与superecliptic pHluorin膜受体的胞外域的，并通过成像这些融合在培养的小鼠神经元受体，我们可以直接可视化个别水泡插入事件到质膜的受体。这种技术将有助于阐明受体插入到质膜的分子机制。