עבודה זו נתמכה בפרס IMPACT מהמחלקה לאונקולוגיה קרינה, אוניברסיטת אלבמה-בירמינגהם המקיף במרכז הסרטן, קרן הסרטן של לחימת הילדים, ואנג&#39;ל הקרן של גבריאל (לESY.) על ידי.

1. תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות עצביים ולטפל בם כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי קציר לתוך צינורות 15 מ&quot;ל: תקשורת לשאוב, לשטוף עם פוספט נאגרו מלוח (PBS, סידן ומגנזיום חינם), להוסיף טריפסין, לאסוף בצינורות 15 מ&quot;ל, ולנטרל את טריפסין עם מדיה מתאימה המכילה סרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב1000 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב1000 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת ותאי resuspend ב PBS הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemacytometer או נגד התא המועדף עליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תאים צריכות להיות מוכנות מייד לפני תחילת הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הדגימות צריכות להיות מטופל באור הכהה או צהוב כדי למנוע ניזק לדנ&quot;א מאור אולטרה סגול. </li></ol> 2. Assay שביט 1. הכנת מצגת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסי 1% agarose (1 גר &#39;/ 100 מ&quot;ל ב1X טריס בסיס, בורה חומצה, EDTA, שהחפתה) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את השקופיות לagarose המותך ולנגב צד לנקות עם kimwipe. אפשר agarose לאוויר יבש לסרט שקוף. ניתן לעשות זאת מראש ושקופיות ניתן לאחסן. </li></ol> 2. Assay שביט הניטראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון צינת תמוגה (2.5 מ &#39;NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.2.2. ממס% ההיתוך agarose נקודה נמוך 1 (1 גר &#39;/ 100 מ&quot;ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. Agarose צריך להיות מקורר ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להימנע מזירוז מלאכותי של זנב שביט. באופן אידיאלי, agarose צריך להיות מקורר למשך חצי שעה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.2.3. לדלל את השעית התא כך שיש 100.000 תאים למ&quot;ל. מערבב את השעית התא עם נקודת ההיתוך agarose הנמוך (על 37 מעלות צלזיוס) בשעהיחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מחליק שטוח במקרר למשך 30 דקות עד שהעיגול מופיע בפריפריה של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prechill פתרון תמוגה ושקופיות להטביע בפתרון זה למשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C (או במקרר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק מעל או לשאוב את פתרון תמוגה ולהוסיף חיץ אלקטרופורזה ניטראלית 1X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA, 1X TBE). השאר שקופיות במאגר זה במשך חצי שעה במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הצפת prechilled 1X ניטראלית אלקטרופורזה (TBE) בחדר אלקטרופורזה, שקופיות מקום בשקופית מגש אלקטרופורזה. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק אלקטרופורזה הניטראלית 1X חיץ עד 0.2 סנטימטרים מעל שקופיות. חיץ עודף ביןfere עם אלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר) בחושך. </li></ol> 3. Assay השביט אלקליין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון צינת תמוגה (2.5 מ &#39;NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM טריס בסיס, 1% sarcosinate אוריל נתרן, ו1% Triton X-100, 10 pH) בשעת 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסי 1% נמוך היתוך agarose נקודה (1 גר &#39;/ 100 מ&quot;ל ב1X טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) במיקרוגל במשך 3 דקות עד שכל הגרגירים ייעלמו. אז מגניב ב° אמבט מים 37 ג ללפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלבו את התאים במיליליטר 1 x 105 / עם נקודת התכה הנמוכה agarose המותך (על 37 מעלות צלזיוס) ביחס של 1:10 (v / v), בקצרה מערבולת, ופיפטה 50 μl מייד על שקופיות השביט. השתמש בצד של קצה פיפטה להפיץ את השעית התא באופן שווה על פני שטח המדגם. כל קבוצת טיפול צריכה להיות לפחות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום החליקes השטוח במקרר למשך 30 דקות עד למעגל מופיע בפריפריה של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לטבול בתמיסת תמוגה prechilled ועוזב ב4 מעלות צלזיוס למשך שעות 1 עד הלילה בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מפתרון תמוגה, לנקז את השקופיות ולשטוף פעם אחת עם חיץ נטרול קר למשך 5 דקות כדי להסיר חומרי ניקוי ומלחים שיורית לפני צעד אלקלי התרה-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות מקום בתא אלקטרופורזה ג&#39;ל מלא במאגר prechilled טרי אלקטרופורזה (300 המ&quot;מ NaOH, 1 mM EDTA, pH&gt; 13) לא יעלה על 0.5 סנטימטרים מעל שקופיות. יישר שקופיות, כך הם במרחק שווים מהאלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות לשבת במאגר הבסיסי למשך 30 דקות בחושך כדי לאפשר להתרה של ה-DNA והביטוי לניזק אלקלי אחראי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע מתח חשמל לV 1 לכל סנטימטר (נמדד האלקטרודה לאלקטרודה) ולהפעיל למשך 30 דקות ב 4 ° C (או בחדר הקר). </li></ol> 4. תיקון וStaתאי ining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן מאגר אלקטרופורזה עודפת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול במים מזוקקים מחליק מראש מקוררים למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לטבול באתנול 70% מראש מקורר למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות יבשות בן הלילה. אל תחשוף את שקופיות לאור בהיר. דוגמאות יכולות להיות מאוחסנות במשך חודשים בטמפרטורת חדר לפני הבקיע בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם שקופיות על ידי הטבילה בSybr ירוק (1X המדולל ב PBS) למשך 20 דקות במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות ולאפשר להם להתייבש לגמרי בחושך. Agarose יהפוך שקוף כשיבש לחלוטין. </li></ol> 4. יבוא תמונות וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר הירוק המסנן (Zeiss AxioVision) ולנתח באמצעות תוכנת Assay שביט (מכשירי Perceptive). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;ראש השביט&quot; (גרעין) והתוכנה מחשבת את הפרמטרים כוללים רגע ממוצע הזנב וכמות ה-DNA בגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח לפחות 200 תאים לכל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא נתונים ל-Microsoft Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מתכוון לרגע זנב לכל קבוצת טיפול ונתוני עלילה על פי צורך. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה לניתוח assay שביט על תאים עצביים מוצגת באיור 2 ואיור 3. במקרה זה, הקרנה של התאים העצביים גורמת ניזק לדנ&quot;א. כאשר התאים נחשפים לשדה החשמלי, ה-DNA נודד בשיעורים שונים בשל הבדלים בגודל שנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת Assay שביט. יותר הניזק לדנ&quot;א, רחוק יותר את ה-DNA נודד אל מחוץ לגרעין. זה מקטין את עוצמת הניאון בגרעין שהרימה לאחר מכן על ידי התוכנה ותוצאות ברגע זנב גבוה. טבלה 1 מציגה טבלת נציג מהניתוח והאיור 4 assay שביט תערוכות יציגותגרף באשר היא מסוגלת להשוות ניזק לדנ&quot;א בתאים עצביים בעקבות קרינה, כפי שנמדד על ידי assay השביט. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. תרשים זרימה של assay השביט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. תמונות מייצגות של תאים עצביים () ללא ו( ב &#39;) עם זנב שביט. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ניתוח assay שביט באמצעות תוכנת Assay שביט. () תמונות מסך יציג של תמונה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Carl Zeiss ונותחה באמצעות שביטתוכנת assay. (ב) לחיצה על הגרעין או &quot;ראש השביט&quot; (מוקף בעיגול ירוק) יוצרת מפת ניאון וגרף (מוקף בעיגול צהוב) וטבלה (ג&#39;) נתונים (מוקף בעיגול אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. גרף נציג מתקבל על ידי זומם רגע הזנב הממוצע שהושג על ידי ניתוח הניזק לדנ&quot;א בתאים עצביים מוקרנים ובלתי מוקרנים באמצעות assay שביט ניטראלי. כצפוי, קרינת 3Gy (רנטגן) גורמת ניזק לדנ&quot;א כמתואר על ידי רגע זנב הממוצע הגבוה יותר בתאים העצביים המוקרנים. שמוצג הוא רגע ממוצע הזנב (+ / - שגיאה סטנדרטית), ** P &lt;0.01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="טבלה 1"/> טבלת 1. </חזק&gt; שולחן נציג מתקבל על ידי ניתוח assay שביט על תאים עצביים מוקרנים ולא מוקרנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol>
	<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li><li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology.">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay.+An+overview+of+techniques.">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation.">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology.">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin.">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li><li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay.">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair.">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li><li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+a+comprehensive+review.">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li><li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons.">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li><li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice.">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li><li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study.">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li><li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase.">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li><li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+hOGG1,+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li><li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions.">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4 (2010).</li><li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li><li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[gamma]H2AX+and+cancer.">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li><li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis.">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li><li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).</li><li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly+(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy.">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Assay השביט יש את היכולת הייחודית של ניתוח תאים בודדים. זהו יתרון בזיהוי של אוכלוסיות של תאים הממחישות תגובת הפרש לסוכנים ציטוטוקסיות. כמה מגבלות מעשיות צריכות להילקח בחשבון. מספר התאים שניתן להעריך בנפרד עשוי להשתנות בהתאם לפרט. גודל המדגם צריך להיות מוגבר אם יש שונה ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 1.5 צינורות מ&quot;ל </td><td> סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc </td><td> SC-200271 </td><td></td></tr><tr><td> TBE 10X (טריס בסיס, חומצה בורה, EDTA) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 מיליליטר צינור </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> סיגמא </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> רדיד אלומיניום </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> כוס </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת Assay שביט </td><td> מערכת השביט Assay IV תמונת ניתוח </td><td></td><td></td></tr><tr><td> גליל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> קאמרי אלקטרופורזה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט </td><td> Zeiss Vision Axio </td><td></td><td> כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן ירוק יספיק </td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> נקודת התכה הנמוך agarose </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוגל </td><td> סרס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגר סידן, מגנזיום המלוח, חופשי חופשי </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> אספקת חשמל </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> מקרר </td><td> סרס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שליט </td><td> סטייפלס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> להחליק </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן Lauryl sarcosinate </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> Sybr ירוק </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> מגש </td><td> FISהמדעי </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> סיגמא </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> מערבולת </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> אמבט מים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying dna damage in hippocampal neurons using the comet assay

מספר התרופות למקד את מסלולי תיקון DNA ולגרום לתא הורג על ידי יצירת ניזק לדנ&quot;א. לפיכך, תהליכים ישירות למדידת ניזק לדנ&quot;א נבדקו בהרחבה. שיטות מסורתיות הן זמן, משאבים רבים, יקרים אינטנסיביים ודורשות תאים משתכפלים. לעומת זאת, בדיקת השביט, assay אלקטרופורזה ג&#39;ל תא בודד, הנה אמצעי מהיר, לא פולשנית, זול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ&quot;א ותיקון. כל הצורות של ניזק לדנ&quot;א, כמו גם תיקון DNA יכולות להיות דמיינו ברמת התא הבודדה באמצעות טכניקה זו עצמה. העיקרון העומד ביסוד assay השביט הוא שדנ&quot;א שלם הוא הורה מאוד ואילו ניזק לדנ&quot;א משבש את הארגון הזה. מחלחל לתוך DNA הפגום agarose המטריצה ​​וכאשר נתון שדה חשמלי, ה-DNA הטעון שלילי נודד לכיוון הקתודה הטעונה במטען חיובי. את גדילי הדנ&quot;א הניזוק הגדולים אינם מסוגלים להעביר רחוק מהגרעין. ניזק לדנ&quot;איוצר מקטעי דנ&quot;א קטנים שנוסעים רחוק יותר מאשר ה-DNA בשלמותה. השביט Assay, תוכנת תמונת ניתוח, אמצעים ומשווה את עוצמת הניאון הכוללת של ה-DNA בגרעין עם DNA שהגר אל מחוץ לגרעין. אות ניאון מהדנ&quot;א הגר פרופורציונלית לניזק לדנ&quot;א. זנב דנ&quot;א כבר בהיר מסמל גדל ניזק לדנ&quot;א. חלק מהפרמטרים שנמדדו הוא רגע זנב שהוא מדד של שניהם כמות ה-DNA וההפצה של ה-DNA בזנב, אורך הזנב והאחוז של ה-DNA בזנב. בדיקה זו מאפשרת למדוד תיקון DNA גם מאז רזולוציה של ניזק לדנ&quot;א מסמנת תיקון התרחש. המגבלה של רגישות היא כ 50 הפסקות גדיל ל1,2 התא דיפלואידי יונקים. תאים שטופלו עם כל סוכנים מזיקים DNA, כגון etoposide, יכולים לשמש כביקורת חיובית. כך assay השביט הוא הליך מהיר ויעיל למדידת ניזק לדנ&quot;א.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay at JoVE.com

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ&quot;א.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

assaying-dna-damage-in-hippocampal-neurons-using-the-comet-assay

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.2K Views.  University of Alabama-Birmingham. Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.

Video: Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...