ברצוננו להודות לחברי בהווה ובעבר המעבדה קישור שעזר לפתח את פרוטוקולי המתואר כאן, במיוחד ג&#39;ין פונטה, אשר פיתח את ההליך המקורי. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מ-NIH (AG12423) ואת איגוד האלצהיימר (פרס זניט) כדי CDL

1) הכנת צמיחה נמטודות צלחות מדיה עבור assay שיתוק. מבחני שיתוק מבוצעות על צמיחה תקן נמטודות מדיה (NGM) צלחות בשימוש שגרתי עבור ג elegans התפשטות וגנטיקה (Stiernagle, 2006). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי הפתרון NGM המכילה NaCl, אגר ו Peptone בבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף את הכמויות המתאימות של CaCl 2 סטרילי, אורציל, כולסטרול, MgSO 1M 4 ו - 1M KPO 4. Aliquot 10 מ&quot;ל של נוזל לתוך NGM מ&quot;מ x 60 כל 15 מ&quot;מ צלחת פטרי. אפשר NGM לחזק הלילה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בדיקת ההשפעות של תרכובות / תמציות, aliquot תמצית על כל צלחת ולהשתמש מפזר כדי לפזר באופן שווה את תמצית על פני הצלחת. אפשר לחלץ לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. כרכים על מ&quot;ל 1 ידרוש זמן רב יותר להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט כל צלחת עם μL של 250 א &#39; coli OP5O זן גדל מדיה LB לילה עבור צפיפות אופטית של 0.4-0.6. אפשר חיידקים להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר. </li></ol> משתנים רלוונטיים הגיל של צלחות יש השפעה משמעותית על assay השיתוק, כמו צלחות מבוגרים יותר נוטים להתייבש. צלחות השתמש שפכו בתוך שבוע assay שיתוק. לקבלת תוצאות אידיאלי, לשפוך צלחות 3-4 ימים לפני תחילת אוכלוסיות תולעת סינכרוני [ראו (2) להלן]. לצורך ניסוי כלשהו, ​​להשתמש רק צלחות זרמו מן אצווה אותו. לשנות את הגודל של הדשא (כלומר הבחינו לעומת התפשטות) ו / או סוג של חיידקים גם לשנות את ההתנהגות של התולעים. מבחני שיתוק יכול להתבצע באמצעות חלופה א coli זנים כמקור מזון (למשל, זן HT115 בשימוש האכלה ניסויים RNAi), אבל זה יכול לשנות את קינטיקה של שיתוק, וכן הוא מחייב בקרה פנימית המתאימה. 2) הכנת גיל סינכרוני אוכלוסיות תולעת מסננים CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) אני; dvIs27 [Myo-3 / Aβ ​​minigene + רול-6 (su1006) גן סמן] X הוא הנפוץ ביותר עבור assaying Aβ-Induced שיתוק זה זן מהונדס דגמים אחרים זמינים. חוקרים אקדמיים תמורת סכום סמלי של גנטיקה Caenorhabditis מרכז (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את בתיאום הגיל של האוכלוסייה מבחן עדיף להתחיל עם דור ההורים מסונכרן. שבוע לפני שיזם את assay שיתוק של האוכלוסייה הבדיקה, השתמש בבורר תולעת פלטינה להעביר 20-30 מבוגרים הרה להולדת על 10 ס&quot;מ צלחות כמה NGM התפשטות עם OP50 עבור ביצה 2 שעה שכב על 16 מעלות צלזיוס (טמפרטורת מתירני עבור CL4176 ). הסר את המבוגרים הרה להולדת צאצאים ולאפשר לגדול במשך 7 ימים, ועד אז הם יהיו &quot;ביום השני&quot; הרה להולדת מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (יום 1) ומבוגרים היום השני הרה להולדת משמשים להכנת לגיל סינכרוני אוכלוסיות הבדיקה. עבור כל תנאי הניסוי המטרה היא ליצור צלחות בשלושה עותקים המכיל 50-75 גיל סינכרוני תולעים. באמצעות בורר תולעת פלטינה, העברת 10-12 של 2 מבוגרים יום הרה להולדת על 60 מ&quot;מ (10 מ&quot;ל נפח) צלחות NGM מנוקדות OP50. אפשר התולעים להטיל ביצים על 16 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ולאחר מכן לבחור את ומבוגרים ולאפשר הביצים לבקוע ולגדול ב 16 ° C. בשלב זה הוא הכי טוב שיש מישהו שלא יהיה הבקיע את הצלחות לקוד אותם, אז מלך השערים יהיה עיוור תנאי הניסוי. </li></ol> משתנים רלוונטיים שלב ההתפתחות העוברית כאשר הביצים מוטלות (~ שלב 26 תאים עבור סוג תולעים בר בתנאים אופטימליים) היא פונקציה של גיל תזונה למבוגרים. אם המבוגרים הרה להולדת משמש להכנת האוכלוסייה מבחן מבוגרים או רעב, ביצים בשלב מאוחר יותר יהיה מונח, הפחתת בתיאום הגיל של האוכלוסייה ואת שחזור של קינטיקה שיתוק. זה חיוני מאשר מונו axenic (כלומר, רק OP50 חיידקים) תרבויות משמשים (חיידקים מזהמים יכולים להשפיע קשות זה assay), וכן שחזור הוא הגבוה ביותר אם צלחות בשלושה עותקים יש מספר דומה של תולעים. 3) transgene אינדוקציה Assay שיתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (יום 3) צלחות Upshift עד 25 ° C 48 שעות לאחר סיום הביצה סינכרוני להניח, תולעים צריך להיות בשלב הזחל השלישית (L3). פלטות צריכים להיות מסודרים בלי לערום ב 25 ° C בחממה כדי לאפשר צלחות כל להגיע 25 ° C באותו זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (יום 4) ניקוד בגין השיתוק של תולעים (זן CL4176) בשעה 18-20 שעות לאחר התחלת upshift. בשלב זה, את כל התולעים באוכלוסייה צריך הגיעו הזחל השלב הרביעי (L4). המשך הבקיע בשתי שעות במרווחים עד שכל תולעים על כל הצלחות משותקים. מסיבות שאינן ידועות, שיתוק אפילו לא על פני אורך הגוף: באזור הראש הוא החלק האחרון של התולעת להפסיק לזוז. לכן, worms כי יזמו לאחרונה שיתוק לא יכול לתרגם את פני הצלחת, אבל יכול להזיז את ראשם, ובכך לנקות חיידקים סביב הקדמי שלהם להשאיר &quot;הילה&quot; של חיידקים פינה. תולעים אלו יהיו תמיד להיות משותק לחלוטין, ולכן תולעים עם הילות מסווגים כמו משותק. תולעים מסוימות לא יהיו הילות אבל גם לא להראות תנועה ספונטנית; אלה נבחנים על ידי דרבון עם בורר את התולעת. אם תולעת דקר לא יכול לעבור התפשטות הגל גוף מלא על דרבון, הוא גם הבקיע כמו משותק. לקבלת ניקוד יעיל, זה הכי קל להעביר את התולעים משותק למגזר ללא רבב של הצלחת, כך שהם לא יהיו rescored במתכוון תקופת הניקוד הבא. (זה גם מאפשר אי - מסווג תולעים להפגין תנועה, מה שמאפשר תיקון ניקוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור עקומת שיתוק, בכל נקודת זמן שבריר של תולעים על כל צלחת שלא היה משותק מומר אחוז, ואת ממוצע אחוז &quot;unparalyzed&quot; הוא זמם נגד הזמן מהופעת upshift. (הרציונל זממו בדרך זו הוא כי עקום וכתוצאה מקביל רשמית עקומת ההישרדות, וכך ניתן לנתח באמצעות תקן הלא פרמטרית סטטיסטיקות ההישרדות.) </li></ol> משתנים רלוונטיים Upshift של תולעים myo-3/Aβ מהונדס חייב להתרחש לפני שהם מגיעים לשלב אמצע L4 לשיתוק להיות יזם, כמו האמרגן-3 מיו מוסדר התפתחותי, צמצמה באופן משמעותי ביטוי מאוחר L4 או תולעים בוגרות. כמו כן, הביטוי של transgene זו חסומה אם תולעים להיות רעב, אז זה חיוני כי התולעים הם המדושנים במהלך הניסוי. אנחנו מעולם לא נצפתה תולעת משותק לשחזר בשום תנאי, ואחרי שעה של 12-16 upshift, כל CL4176 תולעים ישתקו, גם אם הם מורידה הילוך עד 16 ° C. ב זן CL4176, upregulation מספיק ביטוי transgene לגרום לשיתוק יכול להתרחש בטמפרטורות נמוכות יותר (כלומר, 20-25 ° C) למרות עיתוי שיתוק יהיה שונה. שיעור שיתוק תלוי זן מהונדס מסוים בשימוש (בנינו זנים myo-3/Aβ עם שני שיעורי מהר יותר לאט יותר מאשר CL4176), ולכן עם זנים החלופה חלון הניקוד ייתכן שיהיה צורך להתאים. 4) נציג תוצאות שמוצג באיור 1 היא מזימה של עקומת שיתוק עבור CL4176, הן טופלו וחשוף mM 6.27 קפאין (הריכוז הסופי בצלחת NGM). טיפול זה גורם עיכוב מאוד משמעותי מבחינה סטטיסטית שיתוק של כ 4 שעות, שבה אנו מפרשים מעיד כפי הדיכוי של רעילות Aβ במודל זה. שמוצג באיור 2 הוא ניסוי עצמאי assaying את ההשפעות של cafestol, אחרת נמצא מתחם קפה. העלילה זה אופייני עבור טיפולים שאינם השפעה רעילות Aβ. שים לב, בניסויים הן כמחצית מטופל CL4176 אוכלוסיות משותקים ב 24 שעות, ושיתוק תושלם על ידי 28 שעות. אלה הם זמנים אופייני שיתוק שליטה CL4176 אוכלוסיות. סטיות משמעותיות בין עיתוי זה מעיד על התנאים הסביבתיים שינו או מחיקה ספונטנית של עותקים transgene. (CL4176 מכיל מערך chromosomally משולבת מהונדס עם מספר עותקים של transgene myo-3/Aβ. למרות מערך מהונדס הוא בדרך כלל יציב למדי, כל הריבוי של זן בטמפרטורות&gt; 16 ° C יבחר עבור תולעים נדיר כי עברו המחיקה ספונטנית של transgenes, וכתוצאה מכך וריאנטים כי יהיה מופחת הביטוי Aβ ותוצאות שיתוק איטי יותר.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. עקומת שיתוק עבור זן CL4176 תולעים מטופל או חשופים לקפאין 6.27 מ&quot;מ (Sigma). פעמים הם ציינו מן ייזום upshift הטמפרטורה. ברים שגיאה = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. עקומת שיתוק עבור CL4176 תולעים חשופים 0.48 mM cafestol (Sigma). ברים שגיאה = SEM

<ol>
	<li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer's+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans.">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li><li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta.">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li><li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer's+disease+amyloid+beta-peptide+(1-42)+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model.">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li><li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants.">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li><li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans.">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li><li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein.">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li><li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול שתיארנו ניתן להשתמש ביעילות כדי assay את ההשפעות הרעילות של תרכובות על Aβ. פורסם דוגמאות כוללות את השפעת גינקו בילובה תמצית המרכיבים (וו et al. 2006) ו - רסרפין (אריה et al. 2009). תרכובות כי כבר מגן מפני רעילות Aβ במערכות אחרות יש גם הוכח להיות מגן במודל זה (למשל, ממנטין, התוצאות שלנו לא פורסם). הרציונל חשוב להקמת מודל זה היא כי מפותח כלים גנטיים ומולקולריים זמין ב C. elegans יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים של רעילות Aβ. לפיכך, השפעת מוטציות ספציפיות על רעילות Aβ ניתן assayed (למשל, את ההשפעה של הפחתת דמוי אינסולין איתות על ידי החדרת daf-2-הפסד של פונקציית מוטציה, Florez-מקלור et al. 2007), המודל הזה יכול גם ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות של מעל ביטוי transgenes (פונטה et al. 2008). עשינו לאחרונה שימוש נרחב במודל זה כדי לבחון את ההשפעות על הרעילות של יחיד החלפות חומצות אמינו Aβ (נתונים שלא פורסמו). המודל המתואר כאן מהונדס מבחני ההשפעה של הביטוי Aβ חריפה על תפקוד תא שריר. בזמנו של שריר תאים שיתוק sarcomere שלהם הם שלמים; את הפנוטיפ שיתוק אינו תוצאה של מוות של תאים בשריר. עם זאת, לאחר שיתוק (~ 48 שעות לאחר upshift הראשונית) יש פירוט של שלמות השריר ועל המוות הסופי של התולעים. אנחנו לא בחנו את האפקט הזה במורד הביטוי Aβ או השתמשו בו כסמן רעילות. Aβ ועין מתנהלת ביטוי המודל המתואר כאן אינו מתאים חוקרת טיפולים לווסת β עמילואיד היווצרות כשלעצמה. למרות תולעים מהונדס עם טופס ביטוי מכוננת Aβ פיקדונות עמילואיד לזיהוי בקלות (פיי et al 1998;.. Link et al 2001), תולעים מהונדס עם הביטוי Aβ ועין מתנהלת לעתים נדירות יש מרבצי העמילואיד ואת הפנוטיפ מופיע שיתוק עצמאית של בתצהיר עמילואיד (דרייק et al. 2003). תוצאות המחקר עולות בקנה אחד עם הדעה כי רעילות חריפה הנגרמת ביטוי בתוצאות Aβ מהצטברות של Aβ oligomeric מסיסים, לא בתצהיר עמילואיד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים </td><td> Quantity/2L </td><td> החברה / קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> סיגמא אולדריץ / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> אגר </td><td> 40 גרם </td><td> סיגמא אולדריץ / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> 5g </td><td> סיגמא אולדריץ / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2ml </td><td></td><td> 147.02mg/mL ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> אורציל </td><td> 2ml </td><td></td><td> 2mg/mL ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> כולסטרול </td><td> 2ml </td><td></td><td> 5mg/mL באתנול (לא החיטוי) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2ml </td><td></td><td> 246.5mg/mL ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50 מ&quot;ל </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. מ&quot;ל, 48mg K2HPO4/mL ב DDH 2 O, ה-pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying &beta;-amyloid toxicity using a transgenic c. elegans model

הצטברות של הפפטיד β עמילואיד (Aβ) הוא האמין בדרך כלל להיות מרכזי הגיוס של מחלת אלצהיימר, אך המנגנון הרלוונטי (ים) של רעילות עדיין אינם ברורים. Aβ מופקד גם לתוך שריר ב שררת הכללה גוף, מיופתיה אדם חמורה. תולעת למד באינטנסיביות נמטודות Caenorhabditis elegans יכול להיות מהונדסים transgenically להביע Aβ האדם. בהתאם הרקמה או העיתוי של הביטוי Aβ, תולעים מהונדס יכול לקבל פנוטיפים מדידים בקלות המשמשים לקריאה מתוך רעילות Aβ. לדוגמה, תולעים מהונדס עם הביטוי הפאן העצבית Aβ יש פגמים היא למידה אסוציאטיבית (Dosanjh et al 2009.), בעוד תולעים מהונדס במבט המכונן שריר ספציפי להראות תלויי גיל מתקדם, שיתוק הפנוטיפ (קישור, 1995; כהן ואח&#39; . 2006). אחת שימושית במיוחד C. elegans מודל מעסיקה מוטציה טמפרטורה רגיש במערכת מעקב mRNA מהנדס טמפרטורה ועין מתנהלת הביטוי שריר transgene Aβ, וכתוצאה מכך פנוטיפ שיתוק לשחזור על upshift טמפרטורה (Link et al. 2003). טיפולים נגד רעילות Aβ במודל זה [למשל, הביטוי של transgene מגן (חסן et al. 2009) או חשיפה תמציות גינקו בילובה (וו et al. 2006)] reproducibly לשנות את שיעור שיתוק הנגרם על ידי upshift הטמפרטורה של אלה מהונדס תולעים. כאן אנו מתארים פרוטוקול שלנו למדידת שיעור השיתוק הזה ג מהונדס דגם אלגנס, עם תשומת לב מיוחדת משתנים ניסיוניים, כי זה יכול להשפיע על המדידה.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Î²-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model at JoVE.com

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

התולעת נמטודות למד באינטנסיביות<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; יכול להיות מהונדסים transgenically לבטא את הפפטיד האדם β עמילואיד (Aβ). ביטוי מושרה של Aβ ב<em&gt; ג elegans</emשריר&gt; מוביל פנוטיפ, שיתוק לשחזור מהיר שיכול לשמש כדי לפקח על טיפולים לווסת רעילות Aβ.

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

25.2K Views.  University of Colorado. התולעת נמטודות למד באינטנסיביות Caenorhabditis elegans יכול להיות מהונדסים transgenically לבטא את הפפטיד האדם β עמילואיד (Aβ). ביטוי מושרה של Aβ ב ג elegans מוביל פנוטיפ, שיתוק לשחזור מהיר שיכול לשמש כדי לפקח על טיפולים לווסת רעילות Aβ.

Video: Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

מעקב סי אלגנס ומדידת התנהגות

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...