ברצוננו להודות לשרה דיק למתן קריאה והערות ביקורתיות. MAR הקתדרה לחקר גנטיקה מולקולרית בקנדה והוא תלמיד מחקר בינלאומי של הווארד יוז הרפואי במכון. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לMAR מהמכונים הלאומיים לבריאות, הווארד יוז הרפואי במכון, המכון הקנדי לחקר בריאות, אגודה לניוון שרירים ותכנית מחקר קתדרת קנדה.

כל הניסויים טופלו בהתאם לתקנות אוניברסיטת אוטווה לטיפול בבעלי חיים וטיפול. ראה בטבלת 1 סקירה כללית של הפרוטוקול. 1. לפני שמתחיל את הבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונים הבאים: 0.2% מסוג collagenase אני בDMEM (המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר; הגבוה גלוקוז, L-גלוטמין עם 110 מ&quot;ג / המ&quot;ל פירובט נתרן). לשני שרירי אדי להכין 2 מ&quot;ל של 0.2% בCollagenease DMEM. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. 10 דקות לפני הבידוד, prewarm על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. aliquots הנוסף של collagenase החי אפשר להקפיא ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. הערה: להשתמש DMEM עם פירובט נתרן לאורך כל ההליך. סיבים לא ישרדו במדיום נתרן פירובט חופשי. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת כביסה (להשתמש כדי לבצע את כל הכביסות). תוספת DMEM עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין. סנן דרך 0.22 מיקרומטר מסנן לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת תרבות Myofiber. תוספת DMEM עם 20% FBS, 1% תמצית עוף עובר ו1% פניצילין / סטרפטומיצין. לסנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Matrigel מנות מצופות. לסיבי התרבות לתקופה ארוכה של זמן, מומלץ להשתמש Matrigel כמצע ציפוי. כדי להכין מנות מצופות Matrigel, להפשיר aliquot של Matrigel ב 4 ° C למשך הלילה. היום אחרי, לדלל Matrigel 1:10 בDMEM. שמור Matrigel ב 4 ° C בכל העת ולהימנע משינויי הטמפרטורה פתאומיות כמו זה יהיה ליצור גבישים מיקרוסקופים בתוך פתרון Matrigel כתוצאה מהציפוי אחיד. מנות Place להיות מצופות בקרח. מנות מעיילות עם מספיק נפח כדי לכסות את פני השטח. תן לו לשבת במשך דקות 1. להסיר לגמרי את שאריות Matrigel. בואו מאכלים יבשים על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות לפני שימוש או לילה. </li></ul> הערה: aliquots של Matrigel המדולל ניתן מחדש מספר פעמים, למטרת ציפוי אם הם נמצאים ב4 &amp; דהז; ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, הקפד לנקות את תחנת מיקרוסקופ וכלים המבתרים עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך שני בידודי אדי (עכבר אחד) להכין חמש מנות פלסטיק פטרי (60 * 15mm) כדלקמן: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבע מנות לבידוד (1 לשריר דיסוציאציה, 3 לכביסות סידוריות). כל המנות חייבות להיות מצופות עם סוס סרום (HS) כדי למנוע מmyofibers מצרף לפלסטיק. למעייל, 3 מיליליטר פיפטה של ​​סרום סוס לכל מנה, מערבולת לאפשר אפילו ציפוי, להסיר את סרום הסוס ולתת את המנה יבשה במשך לפחות 30 דקות. הוסף 4 מ&quot;ל של DMEM לכל מנה. שמור מנות על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 חממה 5% לפני השימוש. </li></ul> הערה: סרום על סוסים יכול להיות שימוש חוזר מספר פעמים, אם שמר סטרילי. לחלופין, פתרון של HS 10% בDMEM יכול לשמש למאכלי פרווה. השתמש בכלים מצופים HS לאורך כל הפרוטוקול וכאשר myofibers culturing בתנאים משתנים. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת אחת תשמש לmyofibers התרבות לאחר הבידוד. Altניתן להשתמש בגדלי צלחת ernative או פורמטים לתרבות הסופית של myofibers בהתאם ליישומים במורד זרם. עם זאת, אנו לא מציעים גדלי צלחת גדולים יותר מאשר 60 * 15mm. Myofibers יכול להיות כל זמן בהשעיה לא יותר מאשר 96 שעות לפני התכווצות היפר מתרחשת. לזמנים ארוכים יותר תרבות, אנו ממליצים להשתמש בכלים מצופים Matrigel או צלחות. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבידוד סיב אחד (2 אדי), להכין שתי pipettes פסטר סטריליים: פיפטה משעממת אחד גדולה לטיפול בשרירים ופיפטה שעם הקטנה למניפולצית myofiber. השתמש בעט יהלומים כדי לחתוך כל כוס טפטפה לאורך הרצוי ולק חום כדי להחליק הקצוות של פיפטה. על ידי שימוש בלהבה, עקומת קצה פיפטה השעם הקטנה. זה יעזור טיפול סיבים בודדים. להבה לעקר. מעייל כל פיפטה עם HS לפני השימוש. </li></ol> 2. Dissection שרירים ועיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך הניסויים אלה, 8 בן שבוע SV129, Pax7 קואל Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) וMyf5-Cre; Rosa26YFP היו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רסס גפיים אחוריים עם אתנול 70%. להצמיד את החיה (את הפנים) לפורום תמיכה שיש לך הבנה טובה יותר של האיבר האחורי במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, לחתוך דרך כל אורכו של האיבר ולחשוף את השרירים שמתחת. הסר את העור, כמו גם כל שיער או פרווה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים בסדר, לחתוך fascia הדק מבלי לפגוע בשרירים הבסיסיים. חזותי למקם האד. אדי נמצא בתא הקדמי של הגפה האחורית בדיוק מתחת לשריר tibialis הקדמי (ת&quot;א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרתו של שני מלקחיים, לחשוף את גידי דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גידי דיסטלי (של שניהם ת&quot;א והאד) עם מספריים חדים Cohann-Vannas האביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים החזיקו את שניהם ת&quot;א ושרירי אדי ידי גידיהם ולמשוך בעדינות את השרירים לקראת הסוף הפרוקסימלי. בשלב זה אתה אמור להיות מסוגל לראות בבירור אתשרירי האד פשוט מתחת לשריר ת&quot;א. עכשיו, להפריד את האד משרירי ת&quot;א על ידי משייכת שני הגידים בכיוונים מנוגדים (1B איור). הימנע ממתיחה בשריר האד במהלך ביצוע פעולה זו כדבר יפגע בmyofibers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את גיד האד. כדי להמחיש טוב יותר את הגיד הפרוקסימלי הוא עשוי לסייע בשלב זה להסיר את שריר ת&quot;א. היא עשויה גם לעזור לחתוך כמה רקמת חיבור סביב הברך (התרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגיד הפרוקסימלי ועדינות להסיר את האד (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי החזקת השריר באמצעות הגידים שלו, להעביר אותו ל 2 מ&quot;ל של פתרון collagenase הכין בעבר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. הערה: לבידוד סיבים מוצלחים, חשוב לבודד את האד מגיד לגיד, כך ששלמות myofiber נשמרה. צעדים 2.3-2.9 יכולים להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתח. לחלופין, השימוש בmagnifying זכוכית עשויה גם לעזור לי תצוגה טובה יותר של השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.3-2.9 לבודד אדי 2. העברת האד השני באותו הצינור. כדי להימנע מעיכול לא אחיד, בידוד של אדי 2 אמור להסתיים לא יותר מ 5 דקות אחרי הראשון. הערה 1: זמן דגירה עלול צריך להיות מותאם בהתאם לפעילות collagenase. ארוכה או קצרה דגירה ייתכן שתהיה צורך בהתאם לגודל, הגיל ו / או מצב שריר (שרירי fibrotic למשל זקוקים לזמן עיכול ארוך יותר). הערה 2: אם בוחן את התנהגות תאי לווין בתנאי רגיעה, תסיסה בזמן עיכול שריר עשוי להפעיל תאי לווין 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך זמן העיכול, לבדוק באופן קבוע את השריר כדי למנוע יתר מערכת עיכול. עצור את העיכול כאשר שרירים מתחילים להשתחרר וmyofibers גלויים. כדי להפסיק עיכול, להעביר שני השרירים בזהירות לצלחת פטרי prewarmed עם 4 מ&quot;ל של DMEM (dissociatiעל צלחת). השתמש פיפטה הגודל נשא הגדולה לביצוע פעולה זו. הערה: למנוע overdigestion השריר באופן בלתי נמנע זה תוצאות בבידוד של myofibers נדבק היפר. </li></ol> 3. אחת Myofiber דיסוציאציה ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר myofibers, השתמש בכוס טפטפה השעם הגדול כדי לשטוף את השריר עם מדיום חם עד סיבים טבעיים מתחילים ששוחררו. אל triturate שריר כמו זה יהיה בהכרח תוצאה של סיבים מזיקים. לבצע את זה ואת הצעדים הבאים תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך שחרור myofibers עד המספר הרצוי הוא הגיע. אם המנה נדרשה בטמפרטורת חדר במשך יותר מ 10 דקות לאפשר 5 דקות (מינימום) דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 מחדש לאזן הבינוני. הערה: אם בינוניים מגיע לטמפרטורות שמתחת פיסיולוגי (37 מעלות צלזיוס) במשך זמן ממושך myofibers ימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגודל קטן נשא פיפטה, transfer לחיות myofibers הבודד למנת prewarmed חדשה (הראשון של שלוש כביסות רצופות). לטפל בכל myofiber בנפרד במקום להעביר כמויות גדולות של myofibers בבת אחת. במידת צורך, לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 10-15 דקות כדי לאזן מחדש את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.3 עבור 2 יותר פעמים או עד שכל myofibers ופסולת המתים יוסרו. אנו ממליצים לפחות שלוש כביסות רצופות ללנקות נכון. הערה: myofibers המת יופיע כקצר והיפר התכווץ תחת מיקרוסקופ האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת myofibers הבודד על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בצלחת השטיפה האחרונה (DMEM בלבד) לשעה אחת לפחות לפני המעבר למדיום התרבות. זה מאפשר myofibers להסתגל לתנאים במבחנה בהעדר הסרום. מצאנו כי תרבות המיידית של myofibers במדיום עשיר סרום מגביר התכווצות סיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה אחת, להעביר לצלחת myofibers prewarmed חדשה או לפורמט המתאים התרבותבהתאם ליישום במורד הזרם. סיבי תרבות במדיום סרום גבוה כדי לאפשר הפעלת תא לווין. לחלופין, ריכוזים שונים של סרום או תמצית עובר עוף יכולים לשמש גם. שינוי בינוני בכל יום אחר. </li></ol> 4. יישומים במורד זרם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining. myofibers Live יכול להיות קבוע ומוכתם בכל נקודת זמן במהלך הבידוד. Immunofluorescence יכול להתבצע על myofibers הן צף ומצע מצורף. אם הכתמת myofibers הצף, השתמש כוס טפטפה משעממת קטנה להעביר myofibers מפתרון אחד למשנו. לחלופין, ניתן לשמור myofibers באותו היטב לאורך כל ההליך ולהוסיף / להסיר פתרונות באמצעות כוס טפטפה. הימנע משאיפה רגילה כמו זה יגרום להסרה כמו גם את myofibers. בקצרה, להסיר לחלוטין את התרבות בינונית; myofibers לתקן בparaformaldehyde 4% prewarmed (PFA) למשך 5 דקות. בהרחבה לשטוף מספר פעמים בPBS. Incubamyofibers טה ב1% גליצין ב PBS או פתרוני מרווה סטנדרטיים אחרים כדי למזער מכתים רקע PFA. במידת צורך, permeabilize myofibers עם 0.1% Triton X-100 ב PBS למשך 10 דקות ואחרי 5 דקות לשטוף בPBS. דגירת סיבים בפתרון חסימה (10% סוס סרום, 0.1% Triton X-100, 1% NaN) עבור 1 שעה בטמפרטורת חדר או עדיף למשך הלילה ב 4 ° C. פתרוני חסימה אלטרנטיביים יכולים לשמש, בהתאם לנוגדן של עניין. לשטוף פעם ב PBS למשך 5 דקות. דגירה עם הנוגדן הראשוני המתאים דילול בפתרון חסימה לשעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. שטוף סיבים 3 פעמים ב 5 דקות לשטיפה בPBS להסיר את כל נוגדנים מאוגדים. דגירה עם נוגדנים משני המתאימים ל45 דקות לשעה 1 בטמפרטורת חדר. לשטוף 3 פעמים ב 5 דקות לשטיפה בPBS. Counterstain גרעינים עם 1 מ&quot;ג / המ&quot;ל DAPI. אם הכתמת סיבים צפים, להעביר כל סיבים לשקופית זכוכית מתאימה למיקרוסקופיה. הסר את כל עודפים של PBS או בינוני. החל הרכבת Mediאום ולאחר מכן להוסיף coverslip. המשך לדמיין myofibers תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה תרשים 4 לimmunofluorescence נציג myofibers אד. הליכים חלופיים באמצעות צביעת fixatives החזק מתוארים ברמא, מ &#39;ואח&#39;. וWosniak 11, AC et al. 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotide או transfection פלסמיד החולף. myofibers החי ניתן transfected עם siRNA פלסמיד או לגן / s של עניין ספציפי. כאשר באמצעות siRNA, transfection הכפול מומלץ למציאה יעילה של גנים. מומלץ לבצע transfection הראשון לאחר שעות 8 מהבידוד. שש שעות לאחר transfection, להחליף עם מדיום חדש. לtransfection siRNA, אנו מציעים להתחיל באמצעות ריכוז סופי של 50 ננומטר. מציאת ביטוי גנים יכולה להיות מנותחת על ידי מיצוי RNA או רצוי על ידי immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום נגיפי. זיהום של myofibers החי הוא אפשרי אם כי השכיחות של תאהמוות הוא גבוה יותר מאשר עם transfection Oligo והיעילות של זיהום עלול להיות משתנים בהתאם לתנאים בשרירים ובגיל. לדוגמה, השריר myofibers המבוגר ללא פגע במיוחד שאינו מגיב לזיהום נגיפי בשל נוכחותם של lamina הבסיס אשר הוכח כדי לספק מחסום הגנה נגד מארח זיהום 13, 14. וקטורי lentiviral עדיפים על וקטורי retroviral כי הם יכולים להדביק תאים רדומים (המיטוטי לא). לזיהום נגיפי, מומלץ לסיבי תרבות על צלחת Matrigel מצופית או צלחת ולתת myofibers להסתגל לתנאי מדיה עבור 24 השעות הראשונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חי הדמיה. חי הדמיה של myofibers במיוחד זמן רבה ומחייבת מיקרוסקופ מצויד ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 קאמריים. זה שימושי בעת הערכת ההתנהגות של תאי לווין בודדים. העבודה שנעשה שימוש בטכניקה זו כבר סייעה לגילוי ההטרוגניות תא לווין וללמוד Behavior על סיבים (15 ו 16). </li></ol>

<ol>
	<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+of+muscle+satellite+cells+on+intact+myofibers+in+culture.">Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture.</a> Dev. Biol. 115 (1), 129-139 (1986).</li><li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants.">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31 (10), 773-779 (1995).</li><li>Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Misunoya, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+isolation+and+culture+for+cellular+molecular,+pharmacological,+and+evolutionary+studies.">Single muscle fiber isolation and culture for cellular molecular, pharmacological, and evolutionary studies.</a> Methods Mol. Biol. 798, 85-102 (2012).</li><li>Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells.">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods Mol. Biol. 290, 281-304 (2005).</li><li>White, R. B., Bi&#233;rinx, A. S., Gnocchi, V. F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+muscle+fibre+growth+during+postnatal+mouse+development.">Dynamics of muscle fibre growth during postnatal mouse development.</a> BMC Developmental Biology. 10 (21), 1-11 (2010).</li><li>Siegel, A. L., Kuhlmann, P. K., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cell+proliferation+and+association:+new+insights+from+myofiber+time-lapse+imaging.">Muscle satellite cell proliferation and association: new insights from myofiber time-lapse imaging.</a> Skeletal Muscle. 2 (1), 1-7 (2011).</li><li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry.">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 798, 53-64 (2012).</li><li>Engler, A. D., Griffin, M. A., Sen, S., Bonnemann, C. G., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness:+pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments.">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> J. Cell. Biol. 166 (4), 877-887 (2004).</li><li>Boonen, K. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscle+stem+cell+niche:+regulation+of+satellite+cells+during+regeneration.">The muscle stem cell niche: regulation of satellite cells during regeneration.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 14 (4), 419-431 (2008).</li><li>Wozniak, A. C., Anderson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+isolation+and+maintenance+of+satellite+cell+quiescence.">Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence.</a> Biochem. Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).</li><li>Verma, M., Asukura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Single+Muscle+Fiber+Isolation+from+Alcohol-Fixed+Adult+Muscle+following+&#946;-Galactosidase+Staining+for+Satellite+Cell+Detection.">Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following &#946;-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 60-67 (2001).</li><li>Wosniak, A. C., Pilipowics, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Met+expression+and+mechanical+activation+of+satellite+cells+on+cultured+muscle+fibers.">C-Met expression and mechanical activation of satellite cells on cultured muscle fibers.</a> J. Histochem. Cytochem. 51 (11), 1437-1445 (2003).</li><li>Huard, J., Feero, W. G., Watkin, S. C., Hoffman, E. P., Rosenblatt, J. D., Glorioso, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basal+lamina+is+a+physical+barrier+to+herpes+simplex+virus-mediated+gene+delivery+to+mature+muscle+fibers.">The basal lamina is a physical barrier to herpes simplex virus-mediated gene delivery to mature muscle fibers.</a> J. Virol. 70 (11), 8117-8123 (1996).</li><li>Feero, W. G., Rosenblatt, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+delivery+to+skeletal+muscle:+insights+on+maturation-dependent+loss+of+fiber+infectivity+for+adenovirus+and+herpes+simplex+type+1+viral+vectors.">Viral gene delivery to skeletal muscle: insights on maturation-dependent loss of fiber infectivity for adenovirus and herpes simplex type 1 viral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 8 (4), 371-380 (1997).</li><li>Kuang, S., Kuroda, K., grand, F. L. e., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+self-renewal+and+commitment+of+satellite+stem+cells+in+muscle.">Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle.</a> Cell. 129 (5), 999-1010 (2007).</li><li>Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+timelapse+analysis+of+muscle+satellite+cell+motility.">3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility.</a> Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells.">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates:+a+mechanism+for+self-renewal.">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li></ol>

אין אינטרסים מתחרים.

הבידוד והתרבות של myofibers הבודד משרירים שלמים מספקים מצוין במודל מבחנה כדי ללמוד את התהליך של התחדשות שריר. תכונה ייחודית של מערכת זו היא השמירה על תאי לווין בסביבה הפיזיולוגית שלהם מתחת lamina הבסיס. והכי חשוב, טכניקה יכולה לשמש כדי לחקור התנהגות תאי גזע שריר בשתי מדינות הופעלו רגיעה ול. במהלך 20 השנים האחרונות, מערכת תרבות myofiber ספקה תובנה משמעותיות לביולוגיה של אוכלוסיית תאי הלווין ביחס לשני גורמים פנימיים וחיצוניים. על ידי myofibers הבודד culturing, הטרוגניות תא לווין ביחס לmyofiber, סוג שריר או פוטנציאל משובים טופלה 15. מחקרים משוכללים באמצעות הדמית חיה של סיבי תרבית יחידים מותרים למידע צובר בדפוס נדידת תאי לווין 16. הרכישה של נתונים כמותיים היאסימפוני אפשרי. אמנם זמן רב, הוא מספק מידע משמעותי על ההפצה וההתרחשות של אירועים ספציפיים (תאי גזע סימטרי יחס חלוקה, שגשוג והתמיינות, וכו &#39;). יחד עם יישומים שתוארו קודם לכן, חלבון או RNA חילוץ מסיבים בודדים הוא גם אפשרי, למרות בידודה של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין על ידי FACS או באמצעים אחרים עלול לספק פלטפורמה טובה יותר כדי לחקור שינויי ביטוי חלבון או גן ברמה מולקולרית. מניסיוננו, השלב הקריטי ביותר לבידוד סיבים מוצלחים הוא &quot;הגיד לגיד&quot; בידוד (שלבים 2.5-2.9 בטקסט הפרוטוקול). זה מבטיח שלאחר עיכול שריר, סיבים משתחררים מהאד עם ניזק מינימאלי או ללא הגדלת הביצועים שלהם ובכך בשלבים הבאים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב / חומרים </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C0130-1g </td><td> הכן הטרי כל הזמן לקבלת תוצאות אופטימליות. aliquots הנוסף של collagenase החי ניתן לאחסן ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> גלוקוז DMEM הגבוה + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> בנוסף לפן / דלקת יש צורך לצמצם זיהומי אוויר </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי מאופיין </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> לוט # KUJ35152 </td></tr><tr><td> סוס סרום </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> לוט # AVJ82494 </td></tr><tr><td> תמצית עוברי עוף </td><td> כימי מדויק </td><td> CE-650-T, תצווה B7035010 </td><td> הימנע ממחזורי הקפאת הפשרה-. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> aliquots החנות ב -20 ° C. הימנע ממחזורי הקפאת הפשרה-. אחסן aliquots המדולל ב 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מספרי Cohann-Vannas אביב 6mm להבים-ישר ארפ </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> נוספת איריס הדקה מספריים-10.5cm </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחי מוריה, איריס מעוקלות </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> פסטר פיפטות </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> יהלומי עט </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm צלחת פטרי </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0.22 מסנן מיקרומטר </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> מקור אור נוסף עשוי להידרש יש נוף להתמקד טוב יותר </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle

התחדשות שרירים במבוגרים מתבצעת על ידי תאי גזע תושבים נקראים תאי לווין. תאי לווין מוגדרים לפי עמדתם בין lamina הבסיס וsarcolemma של כל myofiber. ידע הנוכחי של ההתנהגות שלהם מסתמך במידה רב על השימוש בפרוטוקול בידוד myofiber האחת. בשנת 1985, בישוף תאר פרוטוקול לבודד סיבים חיים בודדים מflexor digitorum רוויס (FDB) של חולדות בוגרות במטרה ליצור במערכת מבחנה שבהתאחדות הפיסית בין myofiber ותאי הגזע שלה נשמרה 1. בשנת 1995, Rosenblattmodified פרוטוקול הבישוף כאלה שmyofibers נקטף ומטופלים בנפרד ביחידים לאחר עיכול collagenase במקום להיות מבודד על ידי הכח הכביד שקיעת 2, 3. רוזנבלט או בישוף הפרוטוקול מאז הותאם לשרירים שונים, גיל או תנאי 3-6. טכניקת בידוד myofiber היחידה היא הכרחיתכלי בגלל היתרונות הייחודיים שלה. ראשית, בפרוטוקול myofiber היחיד, תאי לווין נשמרים מתחת lamina הבסיס. זוהי תכונה ייחודית של הפרוטוקול כטכניקות אחרות כגון מיון תא הופעל פלואורסצנטי דורשות כימיות ומכאנית רקמה 7 דיסוציאציה. למרות שמערכת תרבות myofiber לא יכולה להוות תחליף למחקרי vivo, זה להציע פלטפורמה מצוינת כדי לטפל במאפיינים ביולוגיים רלוונטיים של שריר בתאי גזע. myofibers היחיד יכולה להיות מתורבת בתנאי ציפוי סטנדרטיים או בתנאים משתנים. תאי לווין על myofibers הצף נתונים לכמעט שום השפעה אחרת מאשר סביבת myofiber. קשיחות מצע וציפוי הוכחו להשפיע על היכולת של תאי לווין להתחדש שרירי 8, 9 באופן עצמאי להיות מסוגל לשלוט בכל הגורמים הללו מאפשר אפליה בין תגובות נישה תלויה ועצמאיות. ריכוזים שונים של סרום ליגם הוכח יש השפעה על המעבר מרגיעה להפעלה. כדי לשמר את מצב הרגיעה של תאי לווין הקשורים אליו, סיבים צריכים להיות כל זמן במדיום סרום נמוך 1-3. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר בודקות את הגנים מעורבים במצב הרגיעה. במדיום עשיר סרום, תאי לווין להפעיל במהירות, מתרבה, נודד ולהבדיל, ובכך מחק בתהליך התחדשות vivo 1-3. המערכת יכולה לשמש לביצוע מגוון של מבחנים כגון בדיקה של מעכבים כימיים; ביטוי אקטופי של גנים על ידי משלוח וירוסים; גן oligonucleotide המבוסס עקום למטה או הדמיה חייה. מאמר וידאו זה מתאר את הפרוטוקול המשמש כיום במעבדה שלנו לבודד myofibers הבודד מLongus extensor digitorum (אדי) השרירים של עכברים בוגרים (6-8 שבועות).

כאן תארו את הבידוד של myofibers הבודד משרירי האד של עכברים בוגרים. myofibers המצליח להניב תלוי במספר גורמים, כגון תנאי שריר או גיל או פעילות collagenase. והכי חשוב, את הבידוד של השריר מגיד לגיד בתוצאות myofibers ארוך, ללא פגע משרירי אד. איור 1 מציג צעד אחר צעד ייצוג גרפי של &quot;הגיד לגיד&quot; בידוד. ברגע שהשריר עכל לגמרי, myofibers הם שוחררו על ידי הפעלת לחץ עדין לשרירים. 2A האיור מראה תמונה מייצגת של ניסוי בידוד myofiber אחרי הכביסה הראשונה. בנקודה זו התרבות מכילה תערובת של צרורות של myofibers הבודד אשר מופיע כמבנים צינורי ארוכים ונוצצים, היפר נדבק myofibers שהם כהים וקצרים ופסולת מתהליך העיכול. בסופו של לפחות שלוש כביסות רצופות, רק myofibers החי בודדה צריך להישאר בדיsh לתרבות או ניתוח במורד הזרם (האיור 2B). האיור 2C תערוכות סיבים ארוכים, בשידור חי, בהשוואה לסיבים התכווצו היפר (ג&#39;). בעת הבידוד, תאי לווין מופיעים כבליטות קטנות על פני שטח myofiber (איור 3 א). אם נשמר במדיום עשיר סרום, תאי לווין להפעיל, מתרבים, נודדים וסופו של דבר למזג לתוך myotubes (B). לאחר 15 ימים בתרבות, בכל myotubes להביע Myf5 הכתב YFP (ג) טוען כי התחדשות שרירים במבוגרים מתבצעת על ידי תאים שבשלב מסוים במהלך פיתוחם הביעו הגורם הקובע myogenic Myf5. כל תאי הלווין להביע גורם שעתוק התיבה לזווג Pax7 17. קו עכבר כתב Pax7Cre-TdTomato ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תאי לווין דרך הביטוי של אות ניאון TdTomato (תרשימים 3D ו-E). איור 4 מראה נציג immunofluorescence של כפול Pax7 + / תאי לווין Myod. קלסי כפול Pax7 + / Myod + תאי לווין נחשבים אבות שרירים מחויבים שגשוג שיהיה גם להשלים את תכנית הבידול על ידי ויסות Pax7 למטה תוך השמירה על ביטוי או לחזור לרגיעה לMyod ידי ויסות מטה Myod ושמירת Pax7 ביטוי 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. בידוד שריר אד מהעכבר hindlimb. . Hindlimb של עכבר בוגר 8 שבוע. חיצים מציינים את הגיד הדיסטלי (ברך) וגיד הפרוקסימלי (רגל). ב &#39;. מיקום האנטומי של שריר tibialis הקדמי (ת&quot;א) וLongus extensor digitorum (אדי) השריר. ג. על ידי החזקת האד באמצעות הגיד הפרוקסימלי, השרירים יפנו לכיוון הברך לחשוף את הגיד הדיסטלי. ד. הגיד הדיסטלי הואלגזור והאד הוא שוחרר. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. תוצאות מייצגות של ניסוי בידוד myofiber יחיד. . תמונת שדה מוארת של ניסוי בידוד myofiber בשלב השטיפה הראשונה. החץ אדום מציין myofibers החי, חץ לבן מצביע myofibers קבלניים היפר וחץ צהוב מציין תאים, myofiber או פסולת ECM. ב &#39;. אחרי שוטף רצוף בDMEM, רק myofibers חיים יישאר. C ו &#39;. תמונה מייצגת חי myofiber שלם ארוך (C) והיפר קצר נדבק myofiber (ג&#39;). 10 מיקרומטר ברים. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio אובזרוור Z1 המצויד בAxioCam משאבי אנוש. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="איור 3"/> Figur<html> דואר 3. תוצאות מייצגות של ניסוי תרבות myofiber יחיד. . תמונת שדה מוארת של myofiber יחיד, חיה עם התא שלה הקשור בלווין (חץ) מייד לאחר הבידוד (זמן 0). ב &#39;. myofibers היחיד היה מצופה על Matrigel ותרבית במדיום עשיר סרום במשך 15 ימים. חץ לבן מצביע myotubes נבדל בהשוואה לתאים בודדים (חץ צהוב) C. myofibers היחיד מMyf5Cre; עכבר RosaYFP היה בתרבית כמו בB. חץ מציין Myf5 myotubes הנגזר. D ו-E. myofibers היחיד מPax7Cre; TdTomato הייתי מבודד ותקן מייד אחרי. חיצים מעידים תא Pax7 חיובי שקט לווין (E, אדום). גרעינים היו counterstained עם DAPI (ד &#39;). בר: 50 מיקרומטר. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio אובזרוור Z1 המצויד בAxioCam משאבי אנוש. דרכים &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. דוגמה לצביעת immunofluorescence של תאי לווין על myofibers. Myofibers היחיד הייתי מבודדת ותרבית במשך 72 שעות בתנאים משתנים. תאי לווין על myofibers הוכתמו לתא סמן Pax7 הלווין הספציפי (B, אדום) וMyod הגורם הרגולטורי myogenic (C, ירוק). גרעינים היו counterstained עם DAPI (). בארים: 50 מיקרומטר. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Axio אובזרוור Z1 המצויד בAxioCam משאבי אנוש. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Dissection שריר (5 דקות כל שריר) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיד לגיד בידוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים חדים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניזק לשריר מינימאלי </li></ul></td></tr><tr><td> עיכול שריר (30-45 דקות) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורהרגיש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> בידוד סיבים </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע על מניפולציה של סיבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את הפסולת עם כמה כביסות </li></ul></td></tr><tr><td> תרבות סיבים (עד שבועות 3-4) </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורמט: כל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי: סוס סרום, Matrigel </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני: בסיס או גבוה בסרום </li></ul></td></tr></tbody></table> טבלת 1. סקירה כללית של פרוטוקול בידוד myofiber. פרוטוקול בידוד myofiber כוללת 4 שלבים עיקריים. לכל שלב, הזמן המשוער ונקודות קריטיות עיקריות הם דנו. לדיון מפורט בכל שלב, מתייחס לטקסט בפרוטוקול.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle at JoVE.com

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן הזהב<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את המעבר של תאי לווין ברגיעה, הפעלה והתמיינות. חשוב מכך, מערכת תרבות myofiber אחת שומרת על קשר תא myofiber / גזע, שהוא מרכיב חיוני בנישה של תאי הגזע בשרירים.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

isolation-culture-individual-myofibers-their-satellite-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

62.4K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן הזהב במבחנה מערכת ללמוד את המעבר של תאי לווין ברגיעה, הפעלה והתמיינות. חשוב מכך, מערכת תרבות myofiber אחת שומרת על קשר תא myofiber / גזע, שהוא מרכיב חיוני בנישה של תאי הגזע בשרירים.

Video: Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...