פרוטוקולים רבים קיימים עבור בידוד myofibers יחיד מן שרירי השלד של עכברים בוגרים. הפרוטוקול שלנו תוכנן עבור עכברים צעירים מאוד עבור עכברים קטנים עם myofibers שביר מאוד. הליך מתוקן זה יכול לשמש לחקר תאי גזע שרירים בסיוע myofiber במהלך התפתחות לאחר הלידה או במודלים של עכבר של מחלות מה שהופך myofibers רגישים במיוחד ללחץ מכני.
ההליך יוצג על ידי גלוריה פגולי, דוקטורנטית, ופדריקה לוסיני, פוסט-דוקטורנטית, שתיהן ממעבדה. עבור ניתוח שרירים וקציר, השתמש סיכה כדי לתקן איבר אחורי אחד מעכבר המתת לחץ, צעיר מאוד או קטן מאוד על לוח ניתוח, ולהשתמש פינצטה חדה כדי להרים את הגיד התחתון של השוקיים לפני הקרסול לגובה הקרסול. חותכים את הגיד ולהשתמש מספריים בסדר לחתוך את כל הדרך סביב השריר לגיד ברמה של פתלה.
מניחים את השריר לתוך צינור של פתרון העיכול ולהרים את הגיד התחתון של longus digitorum extensor, מושך בעדינות כלפי מעלה על הגיד כדי להפריד את לונגוס דיגיטטורום extensor מן השרירים האחרים. חותכים וקוצרים את השריר. לסובב את הרגל כדי להציג את שרירי הגב ולהרים את גיד אכילס.
שריר gastrocnemius ייפרד באופן אוטומטי מן השרירים האחרים. חותכים את הגיד העליון בחלק האחורי של פתלה ומ מניחים את השריר בתסכום העיכול. מרימים את הגיד החיצוני של הרגל ומגלגלים את פינצטה מתחת לגיד כדי להפריד בעדינות את הגיד מהשריר.
לאחר מכן, לחתוך כדי לקצור את השריר ולאסוף את אותם השרירים מן הרגל השנייה באותו אופן. כאשר כל השרירים נאספו, מניחים את צינור האיסוף לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 45 עד 50 דקות ולהפוך במרץ את הצינור 10 פעמים כל 10 דקות. כאשר השרירים מתחילים להשתחרר ואת myofibers להיות גלוי, לנער את הדגימות בפעם האחרונה לפני בזהירות להעביר את ההשעיה העיכול לתוך תבשיל 100 מילימטר חום מראש או סרום מצופה פטרי המכיל 10 מיליליטר של פתרון כביסה.
כדי לבודד myofibers יחיד, מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש בסרום סוס מצופה 200 מיקרוליטר פיפטה קצה כדי לפרק את סיבי השריר בודדים. מעבירים את המופיברים קיימא לתוך סרום סוס מצופה 35 מילימטר צלחת פטרי המכיל חמישה מיליליטר של פתרון כביסה מחומם מראש. כאשר כל myofibers קיימא נאספו, לצייד את דגימות myofiber באינקובטור תרבות התא במשך חמש דקות.
אם יש צורך ביותר myofibers, להשתמש פיפטה זכוכית גדולה נשא כדי triturate מדגם רקמת השריר הנותרים עד סיבים נוספים משתחררים מכנית. כאשר נאספו מספיק myofibers, למקם את המנה לתוך החממה תרבות התא במשך שעה אחת לתקופת שיווי משקל נוספת. בסוף האינקובציה, להעביר myofibers בודדים לתבשיל חדש, מראש מחומם סרום סוס מצופה המכיל את המדיום התרבותי המתאים ולהחזיר את הצלחת לחממה תרבות התא.
לניתוח immunofluorescent של myofibers, לאחר קישור צולב, להסיר את כל אבל מספיק על טבעי, לא להסיר את כל הסיבים ולהוסיף לאותה צינור מיליליטר אחד של 0.5% טריטון X-100 ב PBS עבור דגירה של חמש דקות עם תסיסה עדינה. בסוף הדגירה, לאפשר סיבים להתיישב במשך חמש דקות לפני החלפת על טבעי עם 1.5 מיליליטר של PBS. לאחר חמש דקות של תסיסה עדינה, אפשר לסיבים להסתפק בעוד חמש דקות לפני החלפת העל-טבעי במיליליטר אחד של פתרון חסימה.
לאחר שעה של תסיסה עדינה, החלף את פתרון החסימה בתת פתרון חסימה טרי המכיל נוגדנים ראשוניים בעלי עניין עבור דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה. למחרת בבוקר, לשטוף את הסיבים עם שלוש חמש דקות שטיפה במיליליטר אחד של טרי 0.25% Tween 20 ב PBS באמצעות תסיסה עדינה וחמש דקות של מעים בטמפרטורת החדר לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, סמן את הסיבים בנוגדנים משניים מוגפים פלואורוכרום המתאימים מדוללים בתת פתרון חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה, מוגנת מפני אור, ואחריה שלוש שטיפות ב- PBS בתוספת 0.1% Tween, מוגנות מפני אור, כפי שהוכח.
לאחר הכביסה האחרונה, החלף את העל-טבעי במיליליטר אחד של פתרון DAPI לדגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה, המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הסיבים ולהשתמש פיפטה מצופה פתרון חסימה עם קצה לחתוך כדי לאסוף את הסיבים בזהירות להפיץ את הסיבים על מגלשת זכוכית. מניחים את השקופית תחת מיקרוסקופ ניתוח, ושימוש רק באור הטבעי המשתקף על ידי המראה, להשתמש טיפ חדש 200 פיפטה microliter כדי להפיץ בעדינות את הסיבים כדי להסיר את הפתרון עודף.
לאחר הסרת הפתרון העודף, לאפשר את השקופית להתייבש בחושך במשך 10 עד 15 דקות עד רק נפח קטן מאוד של פתרון נשאר. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של מדיום הרכבה על הסיבים לפני בזהירות הצבת כיסוי להחליק על הרקמות. כדי לאחזר מספר מספיק של סיבים ארוכים, קיימא שיכולים לשרוד 96 שעות במדיום עשיר גורם גדילה, ארבעה שרירים שונים נקצרים בדרך כלל מתעכל.
רק הסיבים השלמים ביותר צריכים להיות מועברים למדיום התרבות. סיבים שבורים ופסולת אחרת יש להשליך. לאחר 72 שעות של תרבות, תאי לוויין פעילים מייצרים צבירות תאים הקשורים למיאופייבר.
אנו מבחינים שתרבות התאים נגזרת מהדלתא של למין שמונה 11 עכברים שליליים כפולים נוצרים על ידי מספר קטן יותר של תאים. לאחר 96 שעות, תאי לווין מבטאים MyoG, להיות גלוי בתוך אשכול התא, ייזום ההידול כלפי myofibers חדשים. יש לציין, דינמיקה מאוחרת של בידול תאי לווין נצפתה בעכברי נוקאאוט מוטנט הומוזיגוס למין בהשוואה לעמיתיהם סוג פראי שלהם.
הקפד לתרגל את צעדי ניתוח השריר כמו קציר שרירים מהיר ומדויק חיוני להצלחת הניסוי. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר תאי לוויין בודדים במהלך הפעלה והתמדה, ומאפשרת את חקר התהליכים המרכזיים שבבסיס צמיחת השרירים והתחדשותם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.
