המחברים מבקשים להודות למיס ליאנה מצקייביץ&#39; לסיוע טכני. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני מדינת ממשלה התפעולית תשתיות וממשלה האוסטרלית הלאומיים בריאות והמועצה למחקר הרפואי IRIISS והפרויקט גרנט 1031212.

1. זיהום של עכברים עם פ berghei-אנקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של פ cryopreserved berghei האנקה pRBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן עכבר מוחות מלריה עמיד BALB / ג תורם (8-12 שבועות בן) באמצעות טכניקת האיפוק בשתי ידות. הזרק עכבר עם 100-200 μl של pRBC שימוש במזרק אינסולין מ&quot;ל 1 (28g מחט). באופן שגרתי, 1-2 עכברים תורמים מוזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים שלאחר הזיהום 4-5 (פאי) להסיר עכבר תורם מכלוב והנח אותו על תחנת עבודה או משטח עבודה פנויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות לרסן את העכבר עד סוף הזנב ובאמצעות מספריים קטנים לחתוך את קצה הזנב (כ 1 מ&quot;מ). לחלופין, לנקב זנב קטן באמצעות מחט 25 G יכול להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפת הדם מוריד הזנב של העכבר הקרוב לסוף שקופית מיקרוסקופ המעומם סוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית שנייה (מפזר) בזווית של 45 °, ולגבות אותו לטיפה של דם. ברגע שהדם מתפשט לאורך הקצה, לדחוף את המפזר-שקופית הערבnly פני שקופית מיקרוסקופ כדי להפוך את הכתם של הדם. אפשר למרוח לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את כתמי דם במתנול 100% למשך 30 שניות ולאחר מכן כתם שקופיות בGiemsa המוכן טרי למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כתם דם במים זורמים במשך דקות 1, לאפשר לאוויר יבש ולבחון שקופיות מתחת למיקרוסקופ (100x, טבילת שמן). למנות pRBC בתוך 1000 אריתרוציטים ולחשב parasitemia אחוזים. עכברים תורמים צריכים להגיע לרמות parasitemia בין 2.5-5% לפני שניתן יהיו דממו הם לזיהום של חיות ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מעכבר התורם על ידי דימום רטרו מסלולית באמצעות צינור נימי מייקר המטוקריט heparinized. כל הניסויים מבוצעים בעמידה בדרישות וולטר ואלייזה הול המכון בבעלי חי ועדת האתיקה. בהתאם לדרישות ועדת אתיקת בעלי חיים מקומיות נהלי דימום אחרים עשויים להיות בשימוש. להמס כמות הנדרשת של דם במדיום RPMI בריכוז סופי של 1x10 6 pRBC/0.2 מ&quot;ל. תחשוב על זההמטוקריט עכבר רגיל הוא ~ 6x10 9 תאי דם אדומים / מ&quot;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק C57BL ניסיוני / 6 עכברים (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneally (IP) מיליליטר 1x10 6 pRBC/0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר רמות parasitemia של עכברים נגועים בצע את השלבים 1.3-1.8. Parasitemia צריך להיות נחוש כל 2-3 ימים מתחיל ביום 2 או 3 pi </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפרצות של מלריה חמורה בC57BL / 6 עכברים עלולים להתבטא במראה כפוף, ruffed פרווה ופעילות נמוכה. עכברים מסוימים עשויים להתאושש בשלב זה, אך התקדמות לאובדן של רפלקס ליישר עצמי מצביעה על מחלה בלתי הפיכה ובעלי החיים חייבים להיות מורדמים. </li></ol> 2. זלוף Intracardial של עכברים ומיצוי המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מערכת זלוף הכביד ידנית על ידי הבטחת מאגר 500 מ&quot;ל לבעל טור המחובר לחלקו העליון של מעמד עמודה 60 סנטימטרים. חבר צינור פלסטיק לקצה התחתון של המאגר ולאבטח מהדק צינורות לשלוט בזרימת חיץ. צרף צינורית למחט 23 G. Fill את המאגר עם PBS (החזיק ב22 מעלות צלזיוס), פתח לצבוט ולאפשר חיץ לרוץ דרך הצינורות כדי להסיר את כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים פ עכבר berghei אנקה נגועה על ידי 2 משאיפת CO. לאשר את המוות בהעדר הדוושה, מסלולית ותגובות בדרכי נשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד עכבר להרדים על ידי כפות האחוריות וקדמיות dorsally על קרש חיתוך קלקר הכלול במגש פלסטיק. בהתאם להרדמה מקומית Animal אתיקת ועדת דרישות יכולים להינתן בתחילה מוקדמת של pefusion intracardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב צד הגחוני עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים ומלקחיים גדולים כדי לפתוח עור לאורך קו האמצע על מנת לחשוף את חלל בית החזה. עור לקפל ולהדק את הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את עצם החזה עם מלקחיים עדינים ולחתוך את הסרעפת ולאורך שני צידי עצם חזה ניתוק הצלעות. הקפד שלא לפגוע בשום כלי דם גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד לצלעות בחזה באופן רופף לצד הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק שנינות חדרי לבמלקחי h דקים ועלייה ימנית בזהירות חתוך במספריים עדינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 23 ז המחובר למערכת זלוף הכביד לתוך חדר שמאלי לכיוון אב העורקים עולה תוך PBS פועל. הכנס רק 0.5 סנטימטר של קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקב את העכבר למשך 5 דקות או עד ששפכים הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר הסר ולהניח אותה על הבטן שלה. נגב את הראש עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים גדולים, עושה חתך מעל לאזור חוט השדרה הצווארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים מצוינים לעשות חתך החציוני זנב-מקורי מתחיל בבסיס הגולגולת ולקלף את העור כדי לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את הראש, הנח את הלהבים של מספריים קטנים לתוך כל חלל מסלולית ולעשות חתך בין המסלולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אורכים לאורך תפר sagittal ומקלף בזהירות את הגולגולת באונה כל מוח כלפי חוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית, בעדינות להרים את המוח ולמקם אותו לתוך צינור צנטריפוגה 10 מ&quot;ל המכיל בינוני RPMI. </li></ol>3. בידוד של מוח Leukocytes-מוחרם (מנהלת ליגה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בקבינט ביטחון, מקום שנקטף מוח טרי על גבי מסננת נירוסטת תא (40-60 גודל רשת) בצלחת פטרי המכילה 3-5 מ&quot;ל של מדיום תרבות רקמות RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך ברקמת מוח לחתיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף חתיכות קטנות של רקמת מוח דרך מסננת התא באמצעות בוכנת גביש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת homogenate המוח לשפופרת 10 מ&quot;ל וצנטריפוגה XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס גלול ב 3 מ&quot;ל של מדיום RPMI, המכיל 0.05% collagenase D ו2U/ml DNAse I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב תערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. להסיר שאריות של תאים על ידי דחיפת התערובת באמצעות מסננת 70 מיקרומטר ניילון תא ו / או על ידי דוגר על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכב homogenate מוח על 30% מיליליטר כרית 7 Percoll וצנטריפוגה XG ב 400 (ללא ברקסים) למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 1 מ&quot;ל של חיץ תאי דם האדום תמוגה ולדגור על קרח למשך 5 דקות כדיlyse pRBC חסיד, שלא ניתן להסירו מהמוח על ידי זלוף intracardial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל של מדיום RPMI, לשטוף תאים וצנטריפוגות XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנהלת הליגה resuspend המכיל גלולה ב50-100 μl של מדיום RPMI ותאים להעברת צינור אפנדורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquot 5-10 μl של מדגם התא 01:02 בTrypan כחול לזיהוי של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. מגיל 6 ואילך pi יום, כאשר פ עכברי berghei אנקה נגועה להציג סימנים נוירולוגיים, 20,000-100,000 BSLs ניתן לשחזר. </li></ol> 4. Immunophenotyping של מנהלת ליגה על ידי cytometry זרימה הססגונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C, לשאוב supernatant ו resuspend גלול ב 50 μl של חיץ מכתים (PBS, 1% עוברי עגל בסרום (FCS), 2 המ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 1 מתוך מטוהר anti-CD16/32 נוגדן (Fcblock). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עבור 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 1 מ&quot;ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב 50 μl של הכתמת המאגר המכיל דילולים שנקבעו מראש אופטימליים של נוגדני ניאון הנדרשים, CD4 נגד כלומר, אנטי CD8, אנטי TCR ואנטי NK1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שעה 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 1 מ&quot;ל של הצפת כתמים. צנטריפוגה תאי XG ב 250 עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב100 μl של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לצינור פלסטיק cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש cytometer זרימה, לרכוש לפחות 5,000-10,000 אירועים. פקדים מתאימים בתוליים תאים ודגימות פיצויי fluorochrome צריכים להיכלל כנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת cytometry זרימה מתאימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis.">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).</li><li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes.">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).</li><li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=West+Nile+virus:+immunity+and+pathogenesis.">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8++T+cells+in+experimental+cerebral+malaria.">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li><li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria.">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li><li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3++T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria.">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li><li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria.">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li><li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection.">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+malaria+parasite+sequestration:+CD36+is+the+major+receptor,+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration.">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li><li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8++T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis.">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li><li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8++T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens,+largely+regulated+by+CD8alpha++dendritic+cells.">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הבידוד והאנליזה של מנהלת הליגה הוא שיטה המאפשרת אפיון וכימות של תאים דלקתיים הנודדים למוח בתגובה לפגיעה ברקמות או זיהום במודלים של עכברי ניסוי. ההקדמה של צעד זלוף intracardial להסרת תא הדם לפני חילוץ איברים ובידוד התא הבא היא שימושית כדי למנוע זיהום של תאים דלקתיים עם לויקוציטים במחזור שאינו דלקתי. זה לא יכול להיות דרישה הכרחית בזיהומי neurotropic כגון וירוס Encephalomyelitis עכברי שבתאים דלקתיים לחדור למוח parenchyma 5, אך רלוונטי במיוחד במלרית מכרסם, בי אריתרוציטים נגועים וLeukocytes הדלקתי נשארים מוחרמים בתוך כלי דם ולא מסתננים רקמת המוח . בהתאם לכך, זלוף intracardial של עכברים נגועים במלריה לא צריך להיות מומלץ רק לניתוח של מנהלת הליגה, אך יכול להיות שימושי גם עבורהערכה של קיבוע טפיל רקמות 10,11. בדומה לויקוציטים במחזור שאינם דלקתיים, גלגולים המוקדמים של טפילי מלריה אינם מסוגלים לדבוק לאנדותל כלי הדם, ויש להסיר על ידי הליך זלוף. לעומת זאת, pRBC חסיד (schizonts הבוגר) מופיע להישאר בתוך כלי דם במוח. פ הטפילים הטרנסגניים Anka berghei מבטאים לוציפראז כבר נוצרו 12 והם משאב יקר ערך עבור סוג זה של ניתוח. לאחר הדבקה עם קווי לוציפראז מבטא-, רקמות התפייס הטפיל יכול להיקבע על ידי הדמיה של מוח perfused מבעלי חיים נגועים באמצעות מערכת IVIS 10,11. השוואה ישירה של טפיל-התפייס בימים 6-7 pi במוחם של בעלי חיים ומוח של עכברי perfused נגוע בטפילי כתב שלב ספציפיים (כלומר להביע לוציפראז רק במהלך שלב schizont) יהיה שימושי עבור אימות נוספת של שיטה זו. אחדחסרון מהותי של גישות מסורתיות לניתוח היסטולוגית של רקמות תאי הסתננות היא שהטכניקות הללו אינם מאפשרות הערכה של אוכלוסיות תאים שדורשות הכרה בסמן יותר מתא אחד לזיהוי שלהם (כלומר NK1.1 + + αβTCR CD1d מוגבל NKT או CD4 + + T תאי Foxp3 רגולציה). בניגוד ליסטולוגיה, ניתוח cytometric זרימה של לויקוציטים הדלקתי הוא נוח לstainings נוגדנים המרובים, מתן כלים שימושיים מאוד לאפיון פנוטיפי מקיף של חודר סלולרי 7,9,13. בנוסף, שיטה זו היא רגישה מספיק כדי לזהות אוכלוסיות תאים המתרחשים בתדרים נמוכים כמו 1-3% מintravascular הסך לחדור, לרבות אנדוגני לא רק, אלא גם תאים שהועבר adoptively כמו גם תאי T ספציפיים לאנטיגן. פ טפילים הטרנסגניים Anka berghei מבטאים אפיטופים MHC II-MHC אני מוגבל ומOVA 14 </sעד&gt; כבר נוצר (PbTG). טפילים אלה מאפשרים ניתוח של תגובות חיסוניות טפיל ספציפיים על ידי שימוש בתאי T מהונדסים מOT-I ו-II OT עכברים, אשר מזהים את MHC מקודד אני ואפיטופים השניים מוגבלים ביציות MHC, בהתאמה. שימוש בשיטה המתוארת כאן, הועבר adoptively Ly5.1 + CD8 + תאי T מOT-I עכברים ניתן היה לזהות בין מנהלת הליגה לLy5.2 עכברים + C57BL / 6 PbTG נגוע, מתן עדויות לכך שתאי T דלקתיים נודדים למוח ב תגובה למלריה הן 14 טפיל ספציפי. הניתוח של מנהלת הליגה שימושי גם כדי להעריך את הפוטנציאל של טיפולים חדשניים אנטי דלקתיים במודלים של בעלי חיים קדם קליניים. לדוגמה, היכולת של נוגדנים חד שבטי כנגד חלבון CXCR3 הכמוקין IFN-γ-מושרה 10 (IP-10) כדי למנוע חדירת intravascular מוח ולהקל על תסמיני מחלה הקשורים למלריה חמורה הודגמה בהצלחה באמצעות זהשיטת 11. מגבלה אחת ששיטה זו יכולה להיות היא שהמספר הכולל של תאי מוח התאוששו מאדם אחד הוא בדרך כלל מספיק עבור קבוצה אחת של stainings נוגדנים. לכן ניסויים נפרדים יש צורך אם יותר מ 4-6 סמנים סלולריים נדרשים לניתוח. באופן כללי, הוא ההליך קל לביצוע. הצעד היחיד שעלולה לדרוש קצת אימון ראשוני הוא זלוף intracardial. כמה רמזים שיכולים להיות שימושי כדי להתגבר על בעיות פוטנציאליות מופיעים בטבלת 1.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות וחוצצים </td></tr><tr><td> הפתרון של Giemsa Azur eosin תילן הכחול </td><td> מרק Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> דילול 1:10 במים מזוקקים </td></tr><tr><td> RPMI בינוני </td><td></td><td></td><td> העכבר tonicity </td></tr><tr><td> עכבר tonicity PBS </td><td></td><td></td><td> פוספט 20 מ&quot;מ נתרן, 0.149 NaCl, 7.3 pH </td></tr><tr><td> 0.4% Trypan הכחול </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T-8154 </td><td> 01:02 דילול </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> ורטינגטון יוכימית </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) אני </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D4263-5VL </td><td> מלבלב שור </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% בפתרון PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure טריס </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד אמוניום (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> מאגר תמוגה תא אדום </td><td></td><td></td><td> 17 המ&quot;מ טריס, 4 Cl 14nM NH, 7.2 pH </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA disodium מלח </td><td> מרק </td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M, 7.2 pH </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> נוגדנים וconjugates </td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD16/CD32 (FC בלוק), השיבוט 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> μl 1 בחיץ מכתים 50 μl (0.5mg/50 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> CD4 FITC-אנטי עכבר, השיבוט H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-אנטי עכבר NK1.1, PK136 שיבוט </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-אנטי עכבר CD8, 53-6-7 שיבוט </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-אנטי עכבר TCR-β, שיבוט H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-אנטי עכבר CXCR3, 220803 שיבוט </td><td> מו&quot;פ מערכות </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated-אנטי עכבר CCR5, שיבוט C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד וחומרים </td></tr><tr><td> שקופית מיקרוסקופ SuperFrost </td><td> Lomb Menzel-גלזר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלקחי נתיחה, מספריים </td><td> רידא Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 מ&quot;ל PBS מאגר </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צינור גומי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מחט 23 ז </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> תא דיסוציאציה ערכה המכילה מתכת מסננת </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> תקליטור-1 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר </td><td> BD פלקון </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH נויבאואר </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות זרימה cytometry </td><td> Bד פלקון </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and analysis of brain-sequestered leukocytes from plasmodium berghei anka-infected mice

אנו מתארים שיטה לבידוד ואפיון של תאי דלקת חסיד מכלי דם במוח של פ עכברי berghei אנקה נגוע. זיהום של-זני עכברים רגישים עם תוצאות מתח טפיל זה באינדוקציה של קדחת מוח ניסיונית, תסמונת נוירולוגית שחוזר על היבטים חשובים מסוימים של מלריה חמורה Plasmodium falciparum בתיווך ב1,2 בני האדם. צורות בוגרות של מלריה בדם שלב לבטא חלבונים טפילים על פני השטח של כדורי האדום הנגוע, המאפשר להם להיקשר לתאי האנדותל של כלי דם. תהליך זה גורם לחסימות בזרימת דם, וכתוצאה מהיפוקסיה ושטפי דם 3 וגם ממגר את הגיוס של לויקוציטים הדלקתי לאתר של קיבוע טפיל. בניגוד לזיהומים אחרים, וירוסים כלומר neutrotopic 4-6, שני תאי המלריה parasitized דם האדומים (pRBC), כמו גם הקשור inflammleukocytes atory יישאר מוחרם בתוך כלי דם ולא מסתנן parenchyma המוח. לפיכך, כדי למנוע זיהום של לויקוציטים המוחרם עם תאים שאינם דלקתיים במחזור, זלוף intracardial הנרחב של עכברים נגועים לפני חילוץ איברים ועיבוד רקמות נדרש בהליך זה כדי להסיר את תא הדם. לאחר זלוף, המוח נקצר ומבותר לחתיכות קטנות. מבנה הרקמה שבש עוד יותר על ידי טיפול האנזימטית עם collagenase D וDNAse I. אז homogenate המוח וכתוצאה הוא centrifuged בשיפוע Percoll המאפשר פרדה של לויקוציטים מוח המוחרם (מנהלת ליגה) מהמיאלין ופסולת רקמות אחרות. תאים מבודדים אז נשטפים, נספר באמצעות hemocytometer ומוכתם עם נוגדני ניאון לניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה. הליך זה מאפשר אפיון הפנוטיפי מקיף של לויקוציטים הדלקתי נודד למוח מחדשsponse לגירויים שונים, כולל שבץ, כמו גם זיהומים נגיפיים או טפילים. השיטה מספקת גם כלי שימושי להערכת טיפולים חדשניים אנטי דלקתיים במודלים של בעלי חיים קדם קליניים.

התוצאות באיור. 2 אחוזים מהופעות ולמספרים מוחלטים של אוכלוסיות שונות מנהלות התאוששו ממוחם של עכברי perfused או unperfused בקרה נגועה מלריה, ונאיביים. מנהלת הליגה מבודדת הוכתמה PE-אנטי NK1.1 ונוגדני APC-אנטי TCR-β כפי שצוינה בפרוטוקול הטקסט. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 7-9, αβTCR + תאי T מורכב שיעור גבוה של ברכת מנהלת הליגה במוחם של עכברים נגועים במלרית perfused (היום 6 פאי). אוכלוסייה זו שנראית באופן משמעותי ייצוג במוחם של בעלי חיים שאינם perfused (איור 2A-B). ההפחתה לכאורה של תדרים סלולריים T במוח שאינו perfused הייתה קשורה באחוז גבוה במידה ניכרת ומספר כולל של תאים שליליים כפולים (αβTCR - NK1.1 -) בבעלי חיים אלה (איור 2A-B). אחוז גבוה ומספרים בתאים שליליים כפולים במוחה unperfused לא היו מתגלה רק בעכברים נגועים במלריה, אלא גם בna &amp; iuמ&quot;ל; פקדי ve, טוען כי תאים אלה הם תאי דם לבנים שאינם דלקתיים המצויים בכלי דם במוח שהם התאוששו יחד עם תאי דלקת אם זלוף intracardial אינו מבוצע. שתי דוגמאות נוספות של מנהלת ליגת ניתוח מוצגות באיור. 3 ואיור. 4. בקצרה, עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). עמותות זמניות בין גיוס יקוציט למוח והופעת תסמינים נוירולוגיים (בין 6-8 ימים pi) הוכחו בפ berghei אנקה נגועה 7-9 עכברים. בדוגמא הספציפית הזה, עכברים נגועים במלריה היו מורדמים ביום 6 פאי, ומנהלת הליגה טוהרו כמתואר בטקסט הפרוטוקול. מנהלת הליגה מבודדת הוכתמה PE-אנטי NK1.1 CD4 FITC-אנטי, APC-אנטי TCR-β, ונוגדני PerCPCy5.5-אנטי CD8α. הדגימות נרכשו באמצעות cytometer BD Biosciences FACSCalibur זרימה והניתוח בוצע באמצעות תוכנת 3.0.1 סמור. באמצעותתאי ble היו מגודרים על ידי קדימה ופיזור צד. את האחוזים של תאי NK, תאי T ותאי NKT (NK1.1 + TCR + תאים) מוחרמים במוח של עכברים תמימים ונגועים במלריה (היום 6 pi) המסומנת בפנלים העליונים (איור 3 א). הפנלים התחתונים מראים אחוזים מהסוג CD4 + וCD8 + לימפוציטים מסוג T בין NK1.1 המגודר - αβTCR + תאים (איור 3 א). איור. 3B מתאר דוגמה שבמספרים מוחלטים של CD4 + ותאי T CD8 + מוח מוחרמים חושבו ביום 6 pi עם פ berghei אנקה. באופן כללי, ניתן 20,000-100,000 מנהלת הליגה התאוששה ממוחם של פ עכברים נגועים אנקת berghei. מספר גורמים כגון פאי הזמן, רגישות של עכבר הזן או ההכללה של טיפולים אנטי דלקתיים עשויות להשפיע על התאוששות תא. באופן שגרתי, מוח אדם אחד מספק מספיק תאים לסט 1 מתוך stainings נוגדנים. בדוגמא שספקה בFiגרם. 4 השימוש בקולט הכמוקין של לימפוציטים מסוג T מוח המוחרם נותח. עכברים נגועים בפ berghei האנקה ומנהלת הליגה היינו מבודדת ביום 6 תאי pi הוכתמו APC-אנטי TCR-β, נוגדני biotinylated-אנטי CCR5-אנטי CXCR3 PE ו, ואחרי דגירה עם-PerCPCy5.5 streptavidin הצמוד. דוגמאות נרכשו ונותחו לפי איור. 3. את היסטוגרמות מייצגת אחוזי התאים + αβTCR בין מנהלת ליגה הכוללת בעכברים נגועים בקרה-מלריה ונאיביים. חלקות הגובה באמצע והפנלים תחתונים מראות את האחוזים של CXCR3 + + וCCR5 תאים בתוך αβTCR המגודר + תאים. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50112/50112fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50112/50112fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של ההליך לבידוד וניתוח של מנהלת הליגה<html> מפ עכברי berghei אנקה נגוע. (1) aliquot cryopreseved של פ berghei האנקה pRBC הוא הפשיר ו1 או 2 עכברים תורמים נגועים. (2) הרמות כעבור ארבעה ימים parsitemia של עכברים תורמים מחושבות, עכברים תורמים הם דילולים דממו ודם שהוכנו לזיהום של עכברי ניסוי. אז זיהום מלריה הוא להגדיר בC57BL מלריה החמורה רגיש / 6 עכברים. (3) בפאי 5-7 ימים, עכברים מורדמים על ידי 2 משאיפת CO ומייד intracardially perfused כדי להסיר את כל התאים במחזור שאינם חסידים. (4) מוחותיהם אז נקצר וhomogenate מוח שהוכן על ידי עיכול הרקמה עם collagenase D וDNAse I. מנהלת ליגה שלאחר מכן נפרד מהמיאלין ופסולת תא על ידי שיפוע Percoll. (5) זרזה מנהלת הליגה אז נשטפים, נספר באמצעות hemocytometer, מוכתם נוגדני ניאון ונותח על ידי cytometry זרימה. ether.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50112/50112fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50112/50112fig2.jpg" /> איור 2. ניתוח מנהלת ליגה במוחם של עכברי perfused או unperfused. עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). המוח נקצר ב 6 pi היום מחי perfused או unperfused. מנהלת הליגה הייתה מבודדת, מוכתמת נוגדנים אנטי NK1.1 ואנטי TCR ניאון ונותח על ידי cytometry זרימה. () חלקות דוט מתארות אחוזי תאי NK, לימפוציטים מסוג T, NK1.1 + + TCR תאים והתאים שליליים כפולים NK1.1 - TCR - בperfused (פנלים עליונים) או (הפנלים תחתונים) unperfused עכברי בקרה נגועות מלריה, ונאיביים . (ב) המספר המוחלט של תאים שליליים כפולים ולימפוציטים מסוג T וחושב על יום פאי 6 עם פ berghei אנקה ועכברי בקרה נאיביים. כל הבר represeNTS הממוצע של 3 דגימות ± SEM, * p&gt; 0.05. <img alt="איור 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50112/50112fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50112/50112fig3.jpg" /> איור 3. תאי NK ותאי T יכולים להיות מזוהים במוחם של פ עכברים נגועים אנקת berghei. עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). מוחות הוצאו ב 6 pi היום אחרי זלוף מבעלי החיים מורדמים. מנהלת הליגה הייתה מבודדת, מוכתמת באנטי NK1.1, אנטי TCR, אנטי CD4 ונוגדני ניאון אנטי CD8 ונותח על ידי cytometry זרימה. () פנלים למעלה מתארים אחוזי תאי NK, תאי T וNK1.1 + + TCR התאים בעכברים נגועים בקרה-מלריה ונאיביים. פנלים תחתונים להמחיש אחוזי CD4 + ותאי T CD8 + בתוך αβTCR המגודר + NK1.1 - (ב) המספר המוחלט של CD4 המוח המוחרם + ו CD8 + תאי T חושבים על יום פאי 6 עם פ berghei אנקה ועכברי בקרה נאיביים. כל עמודה מייצגת הממוצע של 3 דוגמאות ± SEM. <img alt="איור 4" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50112/50112fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50112/50112fig4.jpg" /> איור 4. רוב לימפוציטים מסוג T הנודד למוח בתגובה לזיהום מלריה חמור להביע קולט הכמוקין CXCR3. עכברי C57BL / 6 היו נגועים בפ berghei האנקה (1x10 6 pRBC). מוחות הוצאו ב 6 pi היום אחרי זלוף הנרחב של בעלי החיים מורדמים. מנהלת הליגה הייתה מבודדת, מוכתמת באנטי TCR, אנטי CXCR3 ונוגדנים אנטי CCR5 ונותח על ידי cytometry זרימה. פנלים עליונים מתארים אחוזי αהלימפוציטים βT בעכברים נגועים בקרה-מלריה ונאיביים. חלקות הגובה להמחיש אחוזי CXCR3 + (אמצע פנלים) וCCR5 + (פנל תחתון) בתוך תאי הלימפוציטים + αβTCR מגודרים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> בעיה </td><td fo:width="4.5in"> פתרון בעיות </td></tr><tr><td> זלוף לא הושלם </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו שPBS הוא בטמפרטורת חדר לפני מרוסס עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא לכופף את כלי הדם שהיו מתחת לכלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות carful לא לניק כל איברים (למשל הכבד) כאשר פותחים את בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את קצב זרימת PBS ל~ 5 מ&quot;ל / דקה. דם לא יוסר מהר מספיק אם הזרימה איטית מדי, שעלול לגרום לקרישי דם. אם הזרימה היא מהירה מדי, בלחץ הגבוה עלול לפגוע בכלי דם קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תכניס את המחט עמוקה מדי בלחדר השמאלי כמאי לנקב זה המחיצה. כדי להימנע מכך, לצייר 5 מ&quot;מ סימן מקצה המחט להשתמש כמדריך. </li></ul></td></tr><tr><td> לא מספיק מנהלת הליגה התאוששה </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו parasitemia של פ עכברים נגועים אנקת berghei. על 5-6 pi היום, העכברים צפויים להגיע ~ parasitemia% 4-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו collagenase D וריכוז DNAse אני בקוקטייל העיכול. אין מספיק אנזימים עלולים לסכן את התאוששות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הארך את עיכול אנזימטי של רקמת המוח עד 1 שעה. </li></ul></td></tr></tbody></table> טבלת 1.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice at JoVE.com

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם במוח<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע מתוארים. השיטה מאפשרת כימות, כמו גם אפיון הפנוטיפי של לויקוציטים הבודד לאחר ההכתמה עם נוגדני ניאון וניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

12.7K Views.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם במוח Plasmodium berghei עכברי אנקה נגוע מתוארים. השיטה מאפשרת כימות, כמו גם אפיון הפנוטיפי של לויקוציטים הבודד לאחר ההכתמה עם נוגדני ניאון וניתוח שלאחר מכן על ידי cytometry זרימה.

Video: Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...