עבודה זו נתמכה על ידי מענק NS64571 מן NINDS (CLH), על ידי בפרס פיתוח קריירה מוקדמת ממרפאת מאיו (CLH), ועל ידי מתנה נדיבה של דונלד פרנסיס Herdrich (CLH). ברצוננו להודות תזרים מרפאת מאיו Core cytometry לסיוע.

1. וירוס הזרקה תוך גולגולתי: הטכניקה הבאה שונתה והוא מנוצל באופן נרחב על ידי המעבדה שלנו ועמיתיו. בקצרה, הזרקה תוך גולגולתי של המתח של דניאל של Encephalomyelitis Murine Theiler של הנגיף (TMEV) או העמדת פנים, זיהום (1, 10) מתבצע על עכברים צעירים (רצוי 5-6 שבועות של גיל) כדי לעורר leukocytes המוח הסתננות (BILs). שים לב כי התוצאות יהיו שונות בין המתח של דניאל, זן שעועית, והמתח GDVII. לצורך קצירת BILs, עכברים לקבל 2x10 5 PFU של TMEV ו נגועים למשך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מחט הזריקה (27 מד, ¼ ב, Kendall), כדי מזרק אוטומטי המילטון 1 מ&quot;ל ולהגדיר לספק 10 μl של הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את TMEV ב 10 DMEM μL לתוך המזרק עם תשומת לב קפדנית בועות אוויר. כאשר מתאים, עכברים דמה נגוע לקבל 10 μl של מווירוסים DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני הזריקה, לשפוך כ 1 מ&quot;ל של isoflurane לצנצנת פעמון המכיל רשת חוטי כותנה עם המצע שמתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מקום direclty על רשת תיל בצנצנת בפעמון עד שהם הופכים הרדים בקלילות, רגישות לצבוט-הבוהן משותקת על ידי נשימתית הרדמה, כ 10-15 שניות. עכברים לא צריך לבוא במגע ישיר עם isoflurane, כחומר יכול להיות מעצבן מאכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד תחת הרדמה, להכין עכברים להזרקה על ידי במהירות באיתור הקואורדינטות המתאימות באזור קליפת המוח הקדמית על הגולגולת באמצעות גילוח דיות. המיקום הכללי להזרקה הוא 1 מ&quot;מ הקדמי כדי גבחת ו 1 מ&quot;מ לרוחב תפר sagittal בצד ימין (איור 1). בעוד זריקה stereotactic עשוי להתאים כמה מצבים ניסיוני, מצאנו כי יד חופשית הזרקה ללא גילוח או דיות מתאים רוב הניסויים. קריעת פרווה עם נקודת מחט לאורך צירים גם מתאים ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות זריקה, המזרח בניצב מחט לגולגולת ולחץ דרך העצם עד לעומק של כ 3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס וירוס לתוך המוח ידי לחיצה על כפתור מזרק המילטון למטה מחכים 2 שניות הנגיף להזין את המוח לפני נסיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את המחט במקום עכבר בכלוב, נקי ויבש. עכברים להתעורר מן ההרדמה במהירות ולהמשיך לתפקד נורמלי בתוך דקות. תנו תשומת לב ראויה עכברים סימפטומים חריגים, כגון דימום יתר מאתר ההזרקה, כמו המתת חסד של בעלי החיים עשויים להיות מתאימים. טיפול בבעלי חיים פרופר 6 ודבקות המכונים הלאומיים לבריאות טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת הנחיות שימוש חייב להיות אחריו. </li></ol> 2. Brain-הסתננות הכנה תא ליקוציט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מסביב לתחתית באוקרידג&#39; צנטריפוגות צינורות אשר יכול להכיל קיבולת של 30 מ&quot;ל עם 10 מ&quot;ל RPMI 1640, 9 Percoll מ&quot;ל ו 1 מ&quot;ל PBS 10X וצינורות צריך לשבת על הספסל RT במהלך תהליך הסרת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו Ficoll-Paque פלוס לטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידי יתר isoflurane שונה 5 במהירות להסיר את המוח באמצעות נירוסטה רקמות מרית ומכניסים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל RPMI על הקרח. בנסיבות מסוימות, PBS-זלוף עשוי להיות מתאים כדי להסיר את התאים במחזור הדם ההיקפית של הכנת BILs. עכברים צריך להיות מלא כראוי הרדים לפני זלוף-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת המוח פתרון RPMI ל 7 מ&quot;ל מטחנת זכוכית פיירקס Tenbroeck רקמות המותג homogenize בעדינות עם 10-15 ושבץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet נוסף 5 מ&quot;ל RPMI לתוך homogenizer ו pipet למעלה ולמטה פעמיים. העברת המוח homogenate (בערך 10 מ&quot;ל) ל צינור עגול התחתונה הכין בעבר בעדינות להפוך 2-3 פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין homogenate המוח בבית 7800g שד &#39;למשך 30 דקות ב RT ב הרוטור קבוע זווית F0360 ב צנטריפוגה אלגרה X-22R Beckman קליניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר שאריות המיאלין אשר צפו לחלק העליון של השיפוע. איסוף שכבת ליקוציט שצף מעל תא דם אדום גלולה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים שכבת ליקוציט דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך 50 מ&quot;ל חרוטי. תביאו פתרון עד נפח 50 מ&quot;ל עם RMPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין המכיל ההשעיה תא בדילול בצנטריפוגה קליני ב 1500 סל&quot;ד (600g Ave) במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאסוף את התא גלולה. Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל FACS חוצץ (1% שור אזיד סרום אלבומין, נתרן 0.02% סידן ומגנזיום ללא PBS) ולהעביר את ההשעיה תא עגול 5 מ&quot;ל צינורות התחתונה FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות בבסיס ההשעיה עם פלוס 1 Ficoll-Paque מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור ב 2500 סל&quot;ד (1,400 נתן) בצנטריפוגה קליניים עבור 25 דק &#39;ב RT עם הבלם לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שכבת לבנים, מוכי על הממשק (איור 2) עם פיפטה 1 מ&quot;ל ולהעביר צינור חדש FACS 5 מ&quot;ל. לשטוף גאמות עם חיץ 4 FACS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור ב 1500 סל&quot;ד (600g Ave) במשך 5 דקות ב RT בצנטריפוגה קליניים בתאי גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולאסוף תא גלולה. Resuspend גלולה ליקוציט במאגר המתאימים ולשמור על קרח בצינור FACS חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים, להעריך את כדאיות התא על ידי הרחקה Trypan כחול לנתח ידי cytometry הזרימה. באופן כללי, החוקרים יכולים לצפות לרכוש כ 5 x 10 5 תאים / החי. </li></ol> 3. תזרים cytometric immunophenotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בידוד ספירת לויקוציטים, לסובב את התאים במשך 3 דקות על 1500 סל&quot;ד (600 נתן) בצנטריפוגה קליני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בחסימת למאגר המכיל את הפעולות הבאות: חיץ FACS, supernatant מ 2.4G2 hybridoma (FC לחסום; anti-CD16/32) ו בסרום שור העובר ביחס של 10:05:01 ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולהוסיף נוגדנים כנגד אנטיגנים מצומדות תאיים על התאים חסומים בריכוז של 1:200 ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך. כתם דגירה תאים μl 200 בצלחת V-96-התחתונה היטב. בקרות מתאימות כוללות תאים בלא כתם דגימות פיצוי fluorochrome, לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים מוכתם ב RT במשך 3 דקות על 1500 סל&quot;ד (600 נתן) בצנטריפוגה קליני באמצעות המתאים הרוטור עבור 96-גם הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לשטוף את התאים עם FACS חיץ 200 μl ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על טכניקה כביסה מעל פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, resuspend התאים paraformaldehyde 2% ולהעביר צינורות FACS. קיבוע נדרש ניתוח תזרים cytometric של תאים נגועים של biosafety 2 ריאגנטים רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התאים קבוע על FACS BD Calibur הבא שיטה שונה תזרים cytometry 8 ולנתח את הקבצים הלא מקוונים באמצעות FlowJo, WinMDI או cytometry אחרים הזמינים תזרים תוכנת ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של אירועים 50-100,000 לדגימה נדרש בדרך כלל עבור immunophenotyping הולם. </li></ol> נוגדנים מצומדות ישירות השתמשו בניסוי זה: CD45 זוהה עם שיבוט 30-F11. Ly6C / G זוהה עם Gr1 שיבוט, RB6-8C5. CD11b זוהה עם שיבוט M1/70. F4/80 זוהה עם שיבוט BM8. 4. נציג תוצאות: אנחנו מראים phenotyping תא תוצאות BILs העכבר על זיהום 24 שעות שלאחר (איור 3). Leukocytes הוכתמו עכבר אנטי PerCP מצומדות-CD45 לזהות תאים חיסוניים, PE-מצומדות אנטי עכבר Ly6C / G לזהות מונוציטים דלקתיות, APC-מצומדות אנטי עכבר CD11b ו-APC מצומדות אנטי עכבר F4/80 כדי לזהות תאים השושלת מונוציטים. הניתוח בוצע באמצעות מכשיר FACS Calibur BD. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. לוקליזציה האנטומי של הזריקה. ההזרקה ממוקם 1 מ&quot;מ הקדמי כדי גבחת ו 1 מ&quot;מ לרוחב תפר sagittal בצד ימין. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Leukocytes איור של הפרדת צבע של לויקוציטים ו BILs. נאספים בתחילה ישירות מתחת לשכבת פסולת המיאלין ומעל גלולה RBC ב השיפוע Percoll. השכבה הלבנה, רכות (BILs) בממשק נאסף השיפוע Ficoll. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. Immunophenotype של המוח infilatrating leukocytes ב 24 שעות לאחר ההדבקה. Leukocytes עכבר בודדו מן המוח על ידי צנטריפוגה ההפרש צפיפות רקמת homogenates מוכן מחיות ב 24 שעות לאחר ההדבקה תוך גולגולתי. תאים הוכתמו נוגדנים fluorescently-מצומדות נגד עכבר CD45, Ly6C / G, CD11b ו F4/80. Gating ראשוני בוצע על ידי התוויית CD45, סמן תאים חיסוניים, נגד פיזור קדימה (FSC), אינדיקטור של גודל התא (C). היי CD45 (A, D), CD45 lo (B, E), ו CD45 נג (F, G) אוכלוסיות נותחו לאחר מכן על רמות הביטוי היחסי של סמנים מונוציטים ו macrophage Ly6C / G, F4/80 (A, B , ו), ו CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + מונוציטים דלקתיות נמצאו כמעט אך ורק באוכלוסיה היי CD45 (A, D), עולה בקנה אחד עם חדירה של תאים אלה מהפריפריה. לעומת זאת, Ly6C/G-F4/80 lo CD11b מקרופאגים + נמצאו כמעט אך ורק CD45 lo (B, E) CD45 נג (G) אוכלוסיות, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ תושב. בניסויים רבים, מעולם לא נצפתה CD45 בתאי היי או Ly6C / G + + F4/80 CD11b + מונוציטים דלקתית במוח של נגוע או זיוף-infecטד עכברים (מידע לא מוצג).

<ol>
	<li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornaviruses+and+cell+death.">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li><li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay.">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li><li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li><li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain.">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li><li>Donovan, J., &amp;amp, P. . B. r. o. w. n., , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+&#38;+restraint.">Handling &#38; restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenteral+injections.">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li><li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur.">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li><li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination.">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li><li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+in+mice:+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination.">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה כדי לקבוע את איכות ההכנה שחדר המוח תא, להבדיל אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים 2, 9. בשלב נקודות חריפה, שיטה BILs שלנו תשואות באחוזים גבוהים של מונוציטים דלקתי בתוך האוכלוסייה CD45hi כמו גם באחוזים גבוהים של מקרופאגים באוכלוסייה CD45l...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> האו מעבדה </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> דניאל זן </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> מסביב לתחתית באוקרידג&#39; צנטריפוגות מבחנות </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> רוש </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll Paque-Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול 0.4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> BD פלקון </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 מ&quot;ל מזכוכית פיירקס המותג Tenbroeck מטחנת רקמה </td><td> דיג </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> תא 40 מיקרומטר מסננת </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל חרוטי </td><td> BD פלקון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> סיגמא </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS צינורות </td><td> BD פלקון </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור העובר </td><td> סיגמא </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 hybridoma </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> שחקן המשנה V-התחתונה צלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> אלגרה X-22R צנטריפוגה או שווה ערך </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96 גם צלחת דלי הרוטור </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> קבוע זווית הרוטור </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7.5 </td><td> עץ הכוכבים, Inc </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> שיבוט: 30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> שיבוט: RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> שיבוט: M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> שיבוט: BM8 </td></tr></tbody></table>

isolation of brain-infiltrating leukocytes

אנו מתארים שיטה להכנת leukocytes המוח הסתננות (BILs) מעכברים. אנו מדגימים כיצד להדביק עכברים עם Encephalomyelitis Murine Theiler של הנגיף (TMEV) באמצעות טכניקת ההזרקה מהירה תוך גולגולתי ואיך לטהר אוכלוסייה ליקוציט מועשר של תאים שחדרו מן המוח כולו. בקצרה, בעכברים מורדמים עם isoflurane בתא סגור חופשיים יד מוזרק בעזרת מזרק המילטון לתוך קליפת המוח הקדמית. עכברים נהרגים אז לאחר ההדבקה באמצעות מנת יתר isoflurane והמוח כולו בזמנים שונים המחולצים, ומעורים ב RPMI עם מטחנת רקמה Tenbroeck. Homogenates המוח הם centrifuged דרך שיפוע Percoll רציפה של 30% כדי להסיר את פסולת התא המיאלין אחרים. ההשעיה התא הוא מתוח אז 40 מיקרומטר, שטף centrifuged על שיפוע רציפה פלוס Ficoll-Paque לבחור ולטהר את לויקוציטים. Leukocytes נשטפים אז resuspended ב buffers מתאים immunophenotyping ידי cytometry הזרימה. Cytometry זרימה מגלה אוכלוסייה של תאים חיסוניים מולדים בשלבים המוקדמים של דלקת בעכברים C57BL / 6. ב 24 שעות שלאחר זיהום, תת מרובות של תאים חיסוניים נמצאים BILs, עם האוכלוסייה העשירה של Gr1 + + ו CD11b F4/80 + תאים. לכן, שיטה זו שימושית המאפיינת את התגובה החיסונית דלקת חדה במוח.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes at JoVE.com

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.0K Views.  Mayo Clinic College of Medicine. שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

Video: Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...