ברצוננו להודות לKacergis מיכאל לקבלת סיוע טכני וLianfeng וו לדיונים וקראתי את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס פיתוח קריירה מ-NIH / NIDDK (K08DK087941 לAAS), NIH / NIDDK אימוני מענק (5T32DK007028 לECP), ניו Scholar הקרן הרפואית אליסון פרס הזדקנות (לAAS) ובצ&#39;ארלס H פרס. הוד קרן ילד בריאות מחקר (לAAS).

<ol>
	<li>Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+ubiquitous+fat+storage+organelles+in+C.+elegans.">Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans.</a> BMC Cell. 11, 96 (2010).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.+Toxicological+Sciences:+An+Official.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official.</a> Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).</li><li>Ashrafi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+fat+regulatory+genes.">Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes.</a> Nature. 421, 268-272 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modularity+of+nuclear+hormone+receptors+in+a+Caenorhabditis+elegans+metabolic+gene+regulatory+network.">Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).</li><li>Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polygenic+control+of+Caenorhabditis+elegans+fat+storage.">Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage.</a> Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).</li><li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans.">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322, 957-960 (2008).</li><li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10, 430-435 (2009).</li><li>Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+bacterial+diet+on+fat+storage+in+C.+elegans.">The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans.</a> PLoS ONE. 4, e7545 (2009).</li><li>Yen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods.">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Rabbitts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glo-3,+a+novel+Caenorhabditis+elegans+gene,+is+required+for+lysosome-related+organelle+biogenesis.">glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis.</a> Genetics. 180, 857-871 (2008).</li><li>Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-2,+an+insulin+receptor-like+gene+that+regulates+longevity+and+diapause+in+Caenorhabditis+elegans.">daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 277, 942-946 (1997).</li><li>Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rictor/TORC2+regulates+fat+metabolism,+feeding,+growth,+and+life+span+in+Caenorhabditis+elegans.">Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans.</a> Genes Dev. 23, 496-511 (2009).</li><li>McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans:+a+model+for+exploring+the+genetics+of+fat+storage.">C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage.</a> Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).</li><li>Hellerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).</li><li>Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+for+fat+regulatory+genes+with+SRS+microscopy.">RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.</a> Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).</li><li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Nile+red,+a+fluorescent+hydrophobic+probe,+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections:+comparison+with+oil+red.">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red.</a> 33, 833-836 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Hope, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).</li><li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+13C+isotope+labeling+strategy+reveals+the+influence+of+insulin+signaling+on+lipogenesis+in+C.+elegans.">A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans.">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).</li><li>Wang, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiles+and+the+risk+of+developing+diabetes.">Metabolite profiles and the risk of developing diabetes.</a> Nature medicine. 17, 448-453 (2011).</li><li>Rhee, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+profiling+identifies+a+triacylglycerol+signature+of+insulin+resistance+and+improves+diabetes+prediction+in+humans.">Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).</li><li>Lewis, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+signatures+of+exercise+in+human+plasma.">Metabolic signatures of exercise in human plasma.</a> Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).</li><li>Rhee, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling+identifies+markers+of+uremia.">Metabolite profiling identifies markers of uremia.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).</li><li>Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structural+analysis+of+three+neutral+glycosphingolipids+from+a+mixed+population+of+Caenorhabditis+elegans+(Nematoda:Rhabditida).">Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida).</a> Glycobiology. 7, 265-275 (1997).</li><li>Christie, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Lipid Methodology - Two. , 69-111 (1993).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li><li>Wahlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nile+red+for+the+rapid+in+situ+quantitation+of+lipids+on+thin-layer+chromatograms.">Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms.</a> J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).</li><li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+C.+elegans.">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Screening+and+Biosensing+with+Fluorescent+C.+elegans+Strains.">High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains.</a> J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).</li><li>Comizio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+lipid+and+triglyceride+response+to+energy+deficit:+relevance+to+body+composition+models.">Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models.</a> The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).</li><li>Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+wax+ters+and+other+lipids+by+the+marine+copepod,+Calanus+helgolandicus.">The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus.</a> J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+PPARalpha+in+maintaining+phospholipid+and+triacylglycerol+homeostasis+during+energy+deprivation.">Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation.</a> J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).</li><li>Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+lipid-globular+protein+mosaic+model+of+membrane+structure.">A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Turkish, A. R., Sturley, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neutral+lipid+biosynthesis:+an+evolutionary+perspective.">The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).</li></ol>

המחברים אין אינטרסים מנוגדים לגילוי.

הפרוטוקול שהוצג מאפשר סינון מהיר, בקנה מידה גדול של רמות שומנים בג elegans, הניתן להתאמה בקלות למסכי תפוקה גבוהות. בניגוד לשיטות ששמשו בעבר, שכרוכים בצעד קיבעון ממושך בparaformaldehyde אחרי כמה מחזורי הקפאת הפשרת 8,10, הפרוטוקול שלנו דורש קיבוע 3-דקות פשוטים בisopropanol. אנחנו גילינו שעל ידי הכתמת ג elegans ב 40% isopropanol, הם הופכים באופן חופשי לחדיר הנילוס אדום, ללא שימוש באמצעים נוספים בהקפאה או הפשרת קיבעון. כמו כן, כנילוס אדום סלקטיבי מאיר במדורים הידרופובי בספקטרום הירוק 18,19,31, לא destaining הוא הכרחי. בסך הכל, בעלי חיים יכולים להילקח מצלחות RNAi לבעלי חי תמונה צבעוניות ומוכנים בקצת מעל 2.5 שעות. שיטה זו ניתן לבצע יחסית בזול ועם שחזור גבוה. השיטה לא תלויה ביכולתו של ג elegans לספיגה או להתרכזלצבוע, ולכן אין לו אותן המגבלות כמו האכלה באמצעות שיטות המבוססות על צבעים חיוניים. בהתחשב שחזור ודיוק של מדידות, השיטה מתאימה לסינון מספר גדול של הגנים inactivations ידי RNAi. אם לכמת את רמות שומנים בדם הוא רצוי על בסיס צביעה מקבעת הנילוס האדום, אנו ממליצים על השימוש ב4-6 ביולוגיים משכפל את הבקרות המתאימות והבדיקה סטטיסטית מיושמת. סביר להניח כי רב inactivations הגן מוביל לבעלי חיים קטנים (עקב שיבוטי RNAi גורמים פיתוח מתעכב או נעצר) היה יוצא ממסך לרגולטורי שומן, ללא כל קשר לחילוף חומרים של שומן. בזמן שתכנית ניתוח התמונה שנוצלנו חשבונות לתולעים בגדלים שונים על ידי נרמול עוצמת הקרינה לאזור התולעת, חוקרים בודדים יכולים להיות גם שירצו לשקול השוואה בין רמות מכתים השומן של חיות קטנות לבעלי חיים מסוג פראי של שלב התפתחות דומה. ב<html> מקרה של בעלי חיים קטנים או התפתחותית נעצרו עם מסת שומן נמוכה בעליל, אנו מציעים שלא שיטה אחת מספיקה כדי להדגים מטבוליזם שומנים שונים. מעקב ניסויים אחדים, כולל SPE-GCMS, עשויים להידרש כדי לברר את תפקוד שומנים ברגולציה של גנים אלה. לרגולטור טבולים ידועים fasn-1, ניתוח SPE-GCMS בהשוואה לבעלי החיים המתאימים התפתחותית N2 L2 בקרה הייתה צורך לאשר את הפנוטיפ השומן הנמוך בעליל מצא בהשוואה לחיות בקרה למבוגרות. בעוד כתמי שומן הנילוס האדום עולים רמות שומן נמוכות יחסית למבוגר לשלוט RNAi, בהשוואה לבעלי חיים בשלב מתאים-L2 בקרת RNAi, אין הבדל ניכר היה לראות. בהתאם לכך, שימוש בשיטה שנייה, כימות יוכימי כלומר יחס TAG / PL היה צורך לקבוע כי fasn-1 הוא רגולטור אמיתי של מסת שומן, כfasn-1 RNAi הוא יוכימית מובחנת מחי במה מתאימה-L2 בקרת RNAi. ריבה = &quot;jove_content&quot;&gt; למרות שאנו מציגים הדמיה ועיבוד לפלטפורמת תפוקה גבוהה, מיקרוסקופ זקוף קונבנציונלי יכול לשמש בקלות ללכוד תמונות מתולעים רכובים על agarose 20 רפידות או על גודל קונבנציונלי טפלון מודפס 8-12 שקופיות מיקרוסקופ גם . המגבלה היחידה היא שככל שפלואורסצנטי הירוקה של טיפי שומנים המוכתמים photobleaches הנילוס האדום במהירות, בתנאי חשיפה שיטתיים ואחידים צריכים להיות בשימוש על מנת להבטיח השוואה בין תמונות. אנו מוצאים כי מיקרוסקופ אוטומטי לחלוטין עם תנאי רכישת תמונה אחידים עובד הכי טוב להשפעה זו. אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה הוא שאחרי שהם אספו את התמונות ניתן לשמור לניתוח מחדש בעתיד. אותן תמונות יכולות לשמש כדי לקבוע את גודל גוף, בנוסף לתכולת שומן. יתר על כן, כתוכניות חישוביות מתקדמות יותר, יש סיכוי לניתוח תולעת אחת, שהניב תוצאות מובהקות סטטיסטימבאר אחת. לכן השיטה שלנו שמנצלת מיקרוסקופיה תפוקה גבוהה יש כמה יתרונות על פני שיטות שמשתמשות במסך שפורסם Copas Biosort לכמת אותות ניאון 32,33. עם זאת, מתודולוגיות בהחלט מחמיאות. קביעה מדויקת, ביוכימי של תוכן שומנים על ידי SPE וGC / MS מאשרת המכתימה הנילוס האדום ממאגרי השומן הגדולים בג elegans. למרות quantitation המוחלט מושגת מהכתמה מקבעת הנילוס האדומים ונחישות שומנים ביוכימי לעתים קרובות אינו תואם באופן מושלם, בשתי השיטות לייצר תוצאות לשעתקו מאוד משמעותיות מבחינה סטטיסטית, שמסכימות איכותי. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לענות על צרכימים הספציפיים של חוקרים פרטיים שיחייבו ניתוח נוסף של המעמדות הנפרדות של glycosphingolipids, פוספוליפידים או טריגליצרידים בהווה בדגימות שונות. יש לציין שקבוצות אחרות השתמשו בטכנולוגיה tha האחרn SPE להפריד כיתות שומנים לפני GC / 22 MS. שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוהה (HPLC) יש יתרונות על פני SPE בכך שהם עשויים להיות מסוגלים שומנים טובים יותר נפרדים מובחנים ניטראליים (למשל, TAG diacylglycerols, חומצות שומן חופשיות, והאסטרים כולסטרול) משומנים קוטביים (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine) וגליקול-sphingolipids. אנחנו בוחרים SPE כי זה דורש מינימום של חומר מוצא (2,500-5,000 תולעים), היא מדגישה את חנויות הגדולות לטווח ארוך אנרגיה, תגיות, המרכיבות את רוב שומני השבריר הניטראלי 4, והוא מהיר, אין צורך ציוד מיוחד או צלחות. יודגש, שמבוסס על תערובות סטנדרטיות, SPE מפריד לחלוטין תגיות מפרספקטיבה, וניתן לשחזור ואמין ביותר (ראה 5 איור). אמנם לכמת וניתוח של אסטרים מתיל חומצת שומן דורשים GC / MS, ציוד זה זמין בדרך כלל, ואם לא באופן מקומי, דגימות רשאיותלהיות שנוצר כאמור לעיל ואוחסן ב -80 ° C עד הניתוח תחת חנקן ע&quot;י משת&quot;פ או מסחרי GC / MS שירות מסודר. פלט GCMS מכיל נתונים ברזולוציה גבוהה על כל חומצת שומן בתוך כל מיני שומנים. זה מאפשר קביעת הבדלים מפורטים בין דגימות מושוות. כדוגמה, החוקר יכול לקבוע אם רמות חומצות שומן מסוימות שונו בשפע באופן משמעותי יותר מאחרים בdaf-2, lpd-3-1 או fasn RNAi לעומת בקרת וקטור. כלי עצום וחזק זה ולכן יכול לספק מידע מפורט על אילו מיני שומנים הם שינו בשפע בכל מניפולציה ניסויית. לצורך הניתוח שלנו, אנחנו לרוב לנרמל המוניים TAG למסת PL. בעוד חלבון או DNA יכול לשמש גם כדי לנרמל את מסת שומנים בעקבות נחישות מaliquot של תולעת גלולת sonicated, אנו מוצאים כי שיטות אלה כפופים לintטעות אנושה roduced במהלך כל שלבי pipetting והתאוששות במדגם מכל מוצא. זה מסיבה זו עלינו בחרתי במקום להשתמש המונית PL כגורם הנורמליזציה שלנו. סטנדרטים טבעיים הציגו בתחילת הפרוטוקול (tritridecanoin לTAG, 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול) לPL) מתבצעים דרך כל השלבים של מיצוי השלב המוצק ו הכנת תהילה, ולהבטיח התאוששות כמותית ונציג של שניהם שברים PL TAG ו. אותה הערבות לא יכולות להתבצע אם חוקרים להשתמש בחלבון או DNA כדי לנרמל המוני TAG. אנו מאמינים PL להיות מד החזק ביותר שבאמצעותו להשוות את רמות TAG פני דגימות, כפי שכבר הראה בעבר כי PL משתנה רק בדקדקנות על ידי אותו הגירוי ולחולל משמרות המוניות גדולות ברמות TAG, רעב ממושך למשל או פעילות גופנית מוגברת - 34 36. PL כנראה משחקי תפקיד מבני, הבטחת נזילות הממברנה והסלולרי integrity ותפקידי איתות, ולא כאמצעי לאחסון האנרגיה 37-39. בידות שלנו, יחס TAG / PL קרוב ביותר למה שמתקבל על ידי צביעת שומנים מקבעים מבוססת עם הנילוס אדום, ומסכים עם זה שנמצא על ידי קבוצות אחרות 21. אסטרטגיה חלופית משמשת וטס המעבדה, שבו אחוז TAG שומנים מחושב לעומת שומנים כלל 9,22,29. השימוש בסוגים שאינם ילידים של TAG וPL הסטנדרטי מבטיח שלא חומצות שומן מקומיות תיכללנה בחישוב הנורמליזציה. הבחירה של אורך שרשרת מבוססת אך ורק על הצורך של תקנים אלו שלא להתערב בספקטרום ההמוני של חומצות שומן מקומיות. מצאנו כי חומצות שומן של 13:00 ו17:00 לשרת טובה ביותר למטרה זו. זה אפשרי, בהתחשב בתכונות הכימיות השונות של חומצות שומן קצרות שרשרת, שהסטנדרטים של חומצת השומן הטבעי שלנו לא יכולים להיות נציג של התאוששות של כל החומצות או שרשרות עם הבדל שומן שרשרת באורךמדדי רוויה erent. כך אפשר כי במהלך SPE או GCMS אנו עשויים לראות הבדלים ביעילות של טיהור או זיהוי בין שומנים באורכי שרשרת שונים. בהתבסס על זה והיינון השונה של חומצות שומן שונות בGCMS, אין זה אפשרי לעשות הצהרה מוחלטת על השפע של כל חומצת שומן נתון. לכן, אנו משווים רק בין דגימות בטווח של שכיחות ניסוי יחידה של כל חומצת שומן נתון. אם אחד לא רצה לכמת חומצת שומן לחלוטין, אופן זה יכול להיות מושגת תהיה לרוץ מדגם הוכן כאמור מתובל בכמות ידועה של גרסת יציבות כותרת isotopically 13 C של חומצת שומן או שדומה, כך שזה יכול להיות להבדיל מתבסס על מסה של יון ההורה בMSD, למשל. בהתחשב בכך שאנו משווים רק כמויות יחסיות של סוגי שומנים או כל חומצת שומן נתון, סטנדרטי PL 17:00 TAG ו13:00 לשרת מטרה זו במידה מספקת, במינימום עלות, ללהבטיח התאוששות נאותה ונציג של כל כיתת שומנים בדם. עד לנקודה זו, חלה חוסר הקונצנזוס באשר לפרשנות של תוצאות מסוימות מתקבלת על ידי שיטות שונות, ומה המתודולוגיות הרווחות צריכות להיות. בסך הכל זה יש לציין כי אין שיטה אחת בבידוד הוא אידיאלי ללמוד חילוף חומרים של שומן בג elegans. עם זאת, באמצעות הקרנה מרובה ושיטות אימות, ניתן להשיג את האמון בנתונים המתקבלים על גני רגולצית שומנים. לפיכך, אנו מתכוונים לפרוטוקולנו לשרת כסמן לעבודה בעתיד בתחום ג מחקר השומן elegans.

שימור של מסלולים מטבוליים בין בני אדם ואת elegans Caenorhabditis נמטודות הופך אותו אורגניזם מודל רב עצמה לחקר השמנה. בעוד ג elegans אין לי adipocytes הייעודי לאחסון שומן כמו ביונקים, שהם עושים חנות טריגליצרידים בטיפי שומני 1 ויש רבים מאותם רגולטורים של אחסון שומן ושימוש באנרגיה 2,3. לבדיקה לרמות שומן בג elegans, מספר שיטות הוצעו עם רמות שונות של נוחות והצלחה. השימוש פעם המשותפת של צבעי ניאון, חיוניים 4-7 נקרא לאחרונה לשאלה, וריאגנטים אלה הוכיחו שמכתימים תא נפרד ממחסן אחסון השומן העיקרי של ג elegans 1,8-11. צבעים מקבעים מבוססים שאינם ניאון, כגון סודאן השחורה ושמן האדום O, תוך הדגשה מוצלחת בטיפי שומנים בתולעת 12-14, אין להם כגדול טווח דינמי כדי לכמת כנורותסנאט צבעים 8,13,15. יתר על כן, שיטות נוכחיות של קיבעון לצבעי ניאון והן הלא ניאון הן זמן רבים וכרוכות בשלבים מרובים, הפשרה להקפיא ו / או שימוש בכימיקלים רעילים 1,9,10. השימוש באנלוגים שומנים BODIPY כותרת ספציפיים שדווח להדגשת טיפי שומנים כאשר מאכילים את התולעים חיים עם תיוג לטווח קצר 15. עם זאת, מסתמך על ספיגה של הצבע ולכן הוא מוטה על ידי ג טיפול elegans ומטבוליזם של חומצות שומן אנלוגים BODIPY. חלופה הוקמה על צבעי שומני צביעה היא תווית חינם פיזור, קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) או פיזור ראמאן מגורה (SRS) מיקרוסקופי, המנצל את תכונות הרטט האופייניות של מולקולות שומנים לדמיין מאגרי שומן 10,16, 17. עם זאת, ציוד מיוחד יקר הוא הכרחי לשיטה זו, והתפוקה נמוכה במקרה הטוב. כדי למלא את הצורך בanaly מהיר, מדרגיםאחות של חנויות שומנים ניטראליות בג מחקר מטבולי elegans, אנחנו מציגים את רומן, שיטה לשעתק מאוד של שומנים בדם מכתים מקבע מבוסס הנילוס האדום. תכונות ספקטרליות וphysicochemical של הצבע האדום הנילוס lipophilic לגרום משמרת צהובה זהב רפאים בשיאו עירור של הפליטה, שמאפשרים לו לזרוח בספקטרום הפליטה הירוק רק כאשר בסביבת שומנים עשירה, אך לא בסביבות קוטב יותר 18 , 19. כך טיפי שומנים יכולות להתגלות לאחר צביעה פשוטה על ידי השימוש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מסנן נקבע למיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההקלות והנגישות של טכניקה זו להפוך אותו אידיאלית למסכי תפוקה גבוהות. אנחנו גם להדגים שיטה לזווג, קפדנית לקביעה הביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות מיצוי שלב מוצק וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה המונית. מדידת שומנים ביוכימית בקורלציה עם נחישות מיקרוסקופית הנילוס האדום מבוסס של ג elegans faמסה לא, ואמורה לשמש כאישור לממצאים שנעשו בנחישות שומנים מיקרוסקופיות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> משכפל 96-pin </td><td> Nunc </td><td> 250520 </td><td></td></tr><tr><td> אגר LB </td><td> ביולוגי בארה&quot;ב </td><td> L1500 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטורים מכאניים </td><td> Biohit M קו </td><td> M10, M100, M300 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettor האלקטרוני </td><td> קו Biohit E </td><td> E1200 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ז KH 2 PO 4 </td><td> סיגמא </td><td> P0662 </td><td> 6.0 pH מעוקר ידי מעוקר </td></tr><tr><td> 1 ז MgSO 4 </td><td> סיגמא </td><td> M2643 </td><td> עיקור ידי Autoclaving </td></tr><tr><td> 1 ז CaCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> C2661 </td><td> עיקור ידי מעוקר </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S5886 </td><td></td></tr><tr><td> 5 כולסטרול מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> סיגמא </td><td> C8667 </td><td> באתנול 100% </td></tr><tr><td> 200 מ&quot;ג / המ&quot;ל Carbenicillin </td><td> ביולוגי בארה&quot;ב </td><td> C1100 </td><td> מסנן מעוקר 0.2 μ </td></tr><tr><td> 1 ז IPTG </td><td> ביולוגי בארה&quot;ב </td><td> I8500 </td><td> מסנן מעוקר 0.2 μ </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;ג / המ&quot;ל אמפיצילין </td><td></td><td></td><td> מסנן מעוקר 0.2 μ </td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ג / המ&quot;ל טטרציקלין </td><td></td><td></td><td> באתנול 100% </td></tr><tr><td> אגר Bacto </td><td> BD </td><td> 214040 </td><td></td></tr><tr><td> 96-TC גם צלחות </td><td> BD-Falcעל </td><td> 353072 </td><td> ל96-RNAi גם </td></tr><tr><td> צלחות מלבניות / T </td><td> Thermo Scientific </td><td> 242811 </td><td> להטבעת RNAi </td></tr><tr><td> מדיה LB </td><td> ביולוגי בארה&quot;ב </td><td> L1530 </td><td> הכין לפי הוראות יצרן </td></tr><tr><td> 96-גם בלוקי Assay באר עמוקים </td><td> קורנינג </td><td> כוכב משנה 3960 </td><td> בלוק assay מלבני V-תחתון </td></tr><tr><td> בלוק Assay ובכן 96-גם רדוד </td><td> קורנינג </td><td> כוכב משנה 3956 </td><td> בלוק assay סיבוב V-תחתון </td></tr><tr><td> סרטי איטום סטרילי </td><td> VWR </td><td> 89134-432 </td><td></td></tr><tr><td> סרטי איטום אלומיניום </td><td> קורנינג </td><td> כוכב משנה 6570 </td><td> קלטת איטום Thermowell לצלחות 96-כן </td></tr><tr><td> M9 המאגר </td><td> ראה מקווה et al. 20 </tד&gt; <td></td><td> ראה מתכון בהמשך </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0407 </td><td></td></tr><tr><td> הנילוס האדום </td><td> Invitrogen </td><td> N-1142 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> דיג </td><td> BP2632-4 </td><td></td></tr><tr><td> aspirator 96-pin </td><td> סמנכ&quot;ל מדעי </td><td> VP177A-1 </td><td></td></tr><tr><td> 96-כן שקופיות מיקרוסקופ רעול פן טפלון </td><td> Thermo Scientific </td><td> מנהג </td><td> יכול גם להזמין Trevigen 96-היטב Cometslide </td></tr><tr><td> 96-כן Coverslides זהב חותם </td><td> Thermo Scientific </td><td> מנהג </td><td> גם להשתמש 2 96-היטב Cometslide </td></tr><tr><td> צלחת PCR עמוק היטב </td><td> VWR </td><td> 89049-178 </td><td></td></tr><tr><td> סרט דבק ללא סטרילי </td><td> VWR </td><td> 60941-070 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ תפוקה גבוהה </td><td> ליקה </td><td> DM6000 אוטומטי לחלוטין עם במה לפני 96-היטב </td><td> עם סט Chroma 49002 GFP מסנן ואובייקטיבי 2x </td></tr><tr><td> Sonicator אמבטיה </td><td> Diagenode </td><td> Bioruptor XL </td><td></td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> סיגמא </td><td> 366927-4L </td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td> דיג </td><td> אופטימה F456-4 </td><td></td></tr><tr><td> תקן פוספוליפידים </td><td> שומני פולאר AVANTI </td><td> 830456P </td><td> 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול) </td></tr><tr><td> תקן טריגליצריד </td><td> NuChek Prep </td><td> T-135 </td><td> tritridecanoin </td></tr><tr><td> Wiretrol 50 Pipet μl </td><td> דיג </td><td> 21-176-3A </td><td> דראמונד Scientfic </td></tr><tr><td>אצטון </td><td> סיגמא </td><td> 320110-4L </td><td></td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> דיג </td><td> A300-500 </td><td></td></tr><tr><td> הקסאן </td><td> דיג </td><td> אופטימה H306-1 </td><td></td></tr><tr><td> טור סיליקה SPE </td><td> Thermo Scientific </td><td> 60108-317 </td><td> Hypersep SI, מיטת 100 מ&quot;ג שרף </td></tr><tr><td> סעפת כרומטוגרפיה שלב מוצקה </td><td> סיגמא </td><td> 57265 </td><td> Supelco Visiprep 24 DL </td></tr><tr><td> Pipets ורוסיליקט </td><td> דיג </td><td> 13-678-27F </td><td> 10 מיליליטר גודל </td></tr><tr><td> ורוסיליקט Pipets פסטר </td><td> דיג </td><td> 13-678-8B </td><td></td></tr><tr><td> צינורות תרבות ורוסיליקט </td><td> דיג </td><td> 14-961-27 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות ורוסיליקט משורשרים </td><td> VWR </td><td> 14235-460</td><td> 8 קיבולת מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Caps פנוליות לצינורות תרבות </td><td> דיג </td><td> 14-823-211 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS בקבוקוני autosampler </td><td> Agilent </td><td> 5188-6592 </td><td></td></tr><tr><td> כובעים לבקבוקוני autosampler </td><td> Agilent </td><td> 5185-5861 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS </td><td> Agilent </td><td> 6890 GC / 5973 MSD </td><td> לבוש עם עמודת Supelcowax-10 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> נמטודות צמיחת מדיה (NGM): במשך 25 צלחות RNAi 96-כן, להכין 1 ליטר של NGM: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> הסכום </td></tr><tr><td> מי deionized </td><td> 1 ליטר </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3 גרם </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> 17 גרם </td></tr><tr><td> Bacto peptone </td><td> 2.5 גרם </td></tr><tr><td colspan="2"> מחזור נוזל חיטוי 121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות עם בר ומערבבים. אפשר לקרר עד 60 מעלות צלזיוס בחישה בסט צלחת חמה ב 60 ° C. ואז להוסיף את הדברים הבאים: </td></tr><tr><td> 1 ז MgSO 4 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 5 כולסטרול מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1 ז KH 2 4 ת.ד. (pH 6.0) </td><td> 25 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1 ז CaCl 2 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 200 מ&quot;ג / המ&quot;ל carbenicillin </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1 ז IPTG </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> לוותר לצלחות RNAi 96-כן. חנות ב 4 ° C עד שימוש, עד 2 שבועות. </td></tr></tbody></table> צלחות מלבניות אמפיצילין / טטרציקלין LB אגר (/ T): עבור 20 צלחות A / T, להכין 1 ליטר של מדיה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td&gt; מגיב </td><td> הסכום </td></tr><tr><td> מי deionized </td><td> 1 ליטר </td></tr><tr><td> אגר LB (ביולוגי ארה&quot;ב) </td><td> 32 גרם </td></tr><tr><td> 2 M NaOH </td><td> 1.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אגר Bacto </td><td> 2.5 גרם </td></tr><tr><td colspan="2"> מחזור נוזל חיטוי 121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות עם בר ומערבבים. אפשר לקרר עד 60 מעלות צלזיוס בחישה בסט צלחת חמה ב 60 ° C. ואז להוסיף את הדברים הבאים: </td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> 3 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 100 מ&quot;ג / המ&quot;ל אמפיצילין </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> לוותר 45 מ&quot;ל לכל צלחת. חנות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, עד 4 שבועות. </td></tr></tbody></table> תקשורת LB חיידקי צמיחה: עבור 4 ליטר, מספיק לגידול וresuspending 25 בלוקים 96-כן אבקת מיקס 62 גרם LB (ביולוגי בארה&quot;בALS), 4 ליטר מים מזוקקים ו -4.8 המ&quot;ל 2 M NaOH. חיטוי ב1 ליטר או 0.5 ליטר, מחזור aliquots נוזל, 40 דקות. ניתן לאחסן עד 1 שנה בבקבוקים אטומים בטמפרטורת חדר. השלך אם מעונן. 100 מ&quot;ג / המ&quot;ל אמפיצילין מערבבי 5 גרם אמפיצילין אבקה ומי deionized להיקף כולל של 50 מ&quot;ל. סנן לעקר 0.2 μ, לוותר ב1 aliquots מ&quot;ל ולהקפיא ב -20 ° C עד שימוש. 5 מ&quot;ג / המ&quot;ל טטרציקלין הוסף אבקת 1.25 גרם לטטרציקלין מיליליטר אתנול 250 100%. מערבב היטב עד להמסה וחנות ב -20 ° C במכל האור חזק באופן מלא. 200 מ&quot;ג / המ&quot;ל Carbenicillin מיקס 10 גרם אבקה ומי carbenicillin deionized להיקף כולל של 50 מ&quot;ל. סנן לעקר 0.2 μ, לוותר ב1 aliquots מ&quot;ל ולהקפיא ב -20 ° C עד שימוש. 5 מ&quot;ג / מ&quot;לכולסטרול הוסף כולסטרול גרם 1.25 למיליליטר אתנול 250 100%. מערבב היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. 1 ז MgSO 4 ממס 120.37 גרם MgSO 4 במי 800 מ&quot;ל deionized. הבא נפח סופי למחזור 1 ל חיטוי 40 דקות נוזל וחנות בטמפרטורת חדר. 1 ז CaCl 2 ממס 110.98 גרם CaCl 2 במי 800 מ&quot;ל deionized. הבא נפח סופי למחזור 1 ל חיטוי 40 דקות נוזל וחנות בטמפרטורת חדר. 1 ז KH 2 PO 4, 6.0 pH ממס 136.09 גרם KH 2 PO 4 במי 800 מ&quot;ל deionized. pH ל 6.0 ולהביא את הנפח סופי למחזור 1 ל חיטוי 40 דקות נוזל וחנות בטמפרטורת חדר. M9 מאגר: 1 לL-Routinely לעשות 8-10 קבוצות L להמס 3 גרם KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 HPO 4, 5 גרם NaCl, 1 מ&quot;ל 1 ז MgSO 4 ב900 מ&quot;ל. הבא נפח סופי לaliquot 1 ל ב100-500 מ&quot;ל ובקבוקי חיטוי 40 דקות במחזור וחנות נוזליים בטמפרטורת חדר. 10 N NaOH להמס 400 גרם NaOH במי 800 מ&quot;ל deionized, מאפשר לקרר ולהביא לנפח סופי של 1 ל חנות ב 50 צינורות מ&quot;ל בטמפרטורת חדר. 1 ז IPTG הוסף IPTG 23.81 גרמו למי deionized ולהביא נפח כולל עד 100 מ&quot;ל. סנן לעקר 0.2 μ, לוותר ב1 aliquots מ&quot;ל ולהקפיא ב -20 ° C עד שימוש. הכנת תמיסת ביצת אקונומיקה / NaOH: 20 מ&quot;ל מספיק להכנת ביצה אחת הוסף 4 מיליליטר אקונומיקה, 1 המ&quot;ל 10 N NaOH, 5 המ&quot;ל H 2 O, ו10 מ&quot;לחיץ M9 לצינור פוליפרופילן חרוטי מ&quot;ל 50. הפוך מייד לפני השימוש. פתרון מנייה אדומה הנילוס הוסף אצטון% 50 המ&quot;ל 100 לאבקה 25 מ&quot;ג הנילוס האדום. מערבב היטב ולאחסן בטמפרטורת חדר במכל parafilmed אור חזק. יכול להיות מאוחסן במשך חודשים בצורה זו. פתרון הנילוס אדום מכתים: עבור 500 מ&quot;ל, מספיק לצביעה 30 x 96-צלחות גם הוסף פתרון 3 מ&quot;ל הנילוס האדום מניות עד 40% 500 המ&quot;ל v / v isopropanol. אחסן בטמפרטורת חדר בבקבוק זכוכית עטופה בנייר האלומיניום. הכן מייד לפני השימוש. תקן פוספוליפידים שוקל סטנדרטי 7.6 מ&quot;ג פוספוליפידים, 1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול), בכוס זכוכית. מתמוסס בכלורופורם 02:01 20 מ&quot;ל: מתנול (25 nanomoles ל50 μl). שמור מכוסה בנייר אלומיניום עד לשימוש.התקן גם יכול להיות כל זמן ב-80 מעלות צלזיוס בבקבוקון זכוכית עם מכסה אטום פנוליות במשך שנת 1. תקן טריגליצריד שוקל סטנדרטי 6.8 מ&quot;ג טריגליצרידים, tritridecanoin, לכוס זכוכית. מתמוסס בכלורופורם 02:01 30 מ&quot;ל: מתנול (16.7 nanomoles ל50 μl). שמור מכוסה בנייר אלומיניום עד לשימוש. התקן גם יכול להיות כל זמן ב-80 מעלות צלזיוס בבקבוקון זכוכית עם מכסה אטום פנוליות במשך שנת 1. </td></tr></tbody></table>

biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in caenorhabditis elegans

נמטודות ג elegans התפתח כמודל חשוב ללימוד מסלולים הגנטיים המשתמרים ויסות חילוף חומרים של שומן שהיא מתייחסת להשמנה אנושית ופתולוגיות הקשורים אליו. כמה מתודולוגיות קודמות פתחו להדמיה של ג מאגרי שומן הטריגליצרידים עשירי elegans הוכיחו להיות מוטעה, הדגשת תאים סלולריים אחרים מאשר טיפי שומנים. שיטות אחרות דורשות ציוד מיוחד, הן זמן רב, או להניב תוצאות לא עקביות. אנחנו מציגים את שיטה מהירה, לשחזור, מקבע מבוססת הנילוס אדום מכתימה לאיתור המדויק ומהיר של טיפי שומנים ניטראליות בג elegans. צעד קיבוע קצר ב40% isopropanol עושה חיות לחלוטין חדירות הנילוס אדום, אשר לאחר מכן משמש לכתם בעלי חיים. תכונות ספקטרליות של צבע lipophilic זה לאפשר לו לזרוח חזק ובררני, בספקטרום צהוב הירוק רק כאשר בסביבת שומנים עשירה, אך לא יותרסביבות קוטב. לפיכך, טיפי שומנים ניתן דמיינו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד ביכולת הדמית GFP פשוט לאחר רק צעד קצר הנילוס אדום מכתים בisopropanol. מהירות, המחיר סביר, והשחזור של פרוטוקול זה להפוך אותו אידיאלי למסכי תפוקה גבוהות. אנחנו גם להדגים שיטה מותאמת לקביעה הביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות גז כרומטוגרפיה המוני ספקטרומטריית. פרוטוקול קפדני יותר זה אמור לשמש כאישור לתוצאות המתקבלות מנחישות השומנים המיקרוסקופיות הנילוס האדום. אנו צופים כי הטכניקות הללו יהפכו לסטנדרטים חדשים בתחום ג מחקר מטבולי elegans.

דוגמה של צלחת הדמיה שנלקחה דרך העבודה המכתימה השומן שמוצג באיור 1. פקדים ספציפיים לשומן גבוה (daf-2 האינסולין רצפטור RNAi), דל שומן (חלבון lpd-3 הנדרש לאחסון גרגרי שומנים במעי RNAi), שומן קטן ונמוך (fasn-1 חומצות שומן synthase RNAi), ווקטור ריק ( שליטה) מראה את השינויים בעוצמת קרינה בהתאם לרמות השומן של בעלי החיים, ועל הסכומים שנקבעו על ידי השומנים המתאימים GC / MS ניתוח (איור 2). שים לב שinactivations הגן מוביל למקובעים התפתחותית, חיות קטנות לעתים קרובות נראה שיש שומן נמוך בהרבה מאשר חיות בקרה מבוגרות, ללא קשר לכל קשר לחילוף חומרים של שומן (איור 3). ניתוחים משניים, כולל ניתוח מכתים וביוכימיה שומנים עם SPE-GCMS של פקד חיים פרועים מסוג של שלב התפתחותי דומה צריכים לעשות כדי להבטיח את תוקפו שלקטן או התפתחותית נעצר להיטים חיוביים. במקרה של fasn-1 RNAi (איור 2), חיות במעצר או L2 או L3 שלב זחל, ויש לי כתמי שומן נמוכים יותר מאשר השליטה RNAi למבוגרים, אבל דומה בשפע לבעלי חי L2-L3 שלב בקרת RNAi (אחוזי כתם שומן של מבוגר שליטת RNAi: 49.9 ± 4.5% לfasn-1 RNAi ו20.2 ± 2.1% לL2 השליטה RNAi, ו64.7 ± 1.3 עבור L3 השליטה RNAi). לחלופין, הניתוח ביוכימי הצביע TAG נמוך / יחס PL משלב L2 תאם חיות בקרת N2 (TAG / PL: 22.5 ± 2.9 עבור fasn-1 RNAi ו46.1 ± 3.4 לבמה תאם השליטה RNAi, P ≤ 0.05). כך, במקרה זה יכול להיות מאושר על ידי ניתוח ביוכימי שfasn-1 יש תפקיד באחסון שומנים בדם ולא רק ירידת שלב ספציפי במסת שומן. ניתוח המעקב של תולעי הדמיה נשען בכבדות על פלטפורמה חישובית כגון Profiler הסלולרי באמצעותWormToolbox 30. למספר קטן יותר של תמונות, פלטפורמת ניתוח תמונה זמינה לציבור כגון ImageJ, זמין באופן חופשי מ-NIH, ניתן להשתמש. לצורך הניתוח שלנו, תסריטי Matlab ייחודיים שמשו ראשון לזהות היטב, ולאחר מכן להוציא בארות ריקות או אלה עם בועות, ולהבחין בין פסולת קטנה מתולעים. בקרת איכות ידנית הכרחית עבור תמונות שמסומנות להרחקה מהסיבות שהוזכרו לעיל. מצאנו באופן אמפירי שעוצמת אחוזון ה -90 של פיקסלים תולעת פני היטב, מנורמל לאזור תולעת על פני, בתנאים עקביים מטרי של הכתמת עצמה בכל שלבי פיתוח תולעת (איור 3). שילוב מסת שומן כללית על פני השטח של התולעת, להיפך, הייתה נוטה לצבור תולעים קטנים, בהירות באופן שקול עם תולעים עמומים גדולים. בגלל השיטה שלנו אינה משתלבת אות ניאון מוחלטת על השטח של התולעת, בלקיחת אחוזון עצמה, שינויים בגודל תולעת כשלעצמה לא יעשולא הטית העצמה נמדדת. במקום זאת, הבדלים בהתפלגות עוצמת פיקסל נמדדים. עם זאת, על אף זאת, הבדלים בולטים נראים בהכתמת חלוקת עוצמת פיקסל בין חיות של שלבי התפתחות שונים, ולכן חשוב לבחון את ההשפעה של RNAi לכל גן חיות נגד של שלב התפתחות דומה (איור 3). השתנות ממוצעות בין משכפל מוצגות באיור 4 מצביעות שחזור גבוה של שיטת הכתמת השומן. שים לב כי כוחה של השיטה הוא תלוי מאוד בקבלת תמונות באיכות לכל צלחת, בתנאי תאורה אחידים, תוך שימוש בזמני חשיפה זהים, ועם בועות מינימאליות, פסולה, או מוצלב של תולעים לתוך בארות אחרות. SPE בוצע בטרום מעורב, מטוהרי סטנדרטים כדי לקבוע את המידה שבי תגיות יכולה להיות מופרדות מפרספקטיבה (האיור 5A). בניתוח זה, השיג 100% שלeparation של TAG וPL, הצביע כעדר מוחלט של חומצות שומן 17:00 נגזרות מPL במדגם TAG והיעדר מוחלט מקביל של חומצות שומן 13:00 נגזרות מTAG במדגם PL (5A איור). כך SPE הוא יעיל ביותר בהפרדת כיתות שומנים. ניתוח זה אינו מצביע על כך שכל התגים באורכי שרשרת שונים יהיו מטוהרים באופן שקול על ידי SPE וזוהו על ידי GCMS עם יעילות דומה. זה רק מבטיח ששומני PL TAG ובסך מופרדים לחלוטין אחד מהשני. מדגם עקבות GC-MS של חיות ברות מסוג N2 שצולמו באמצעות מיצוי שלב מוצק והכנת FAME מוצגת באיור 5 ב. עבור שניהם TAG וPL, פסגות יכולות להיות מזוהות על בסיס זמן שמירה ויונים הוריים ובתה על הספקטרום ההמוני, ושטח הכולל תחת הפסגות זוהו המנורמלות לאזור של הסטנדרטים הפנימיים בהתאמה. כדי לקבוע את הסכום המנורמל של TAG, האזורתחת כל פסגות הכרומתוגרמה TAG, למעט התקן 13:00, נוספו יחד ומחולק בשטח שמתחת לשיא 13:00. כמו כן, על מנת לקבוע את הסכום הכולל המנורמל PL, אזור נתון לכל הפסגות, למעט התקן 17:00, נוספו יחד ומחולק בשטח שמתחת לשיא 17:00. הערכים המנורמלים לדגימות PL TAG ומשמשים מכן לחשב את היחס הסופי TAG / PL לדוגמה: <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1.jpg" alt="משוואה 1" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1highres.jpg"/> יש לציין, כי הנתונים מSPE-GCMS מתירים הרבה יותר מתוחכם ניתוח של חומצות הנמצאות בכל שבריר שומנים מחישוב פשוט של TAG המוחלט ליחס PL שומן. לדוגמה, החוקר יכול לשלב שיא מקביל לחומצת שומן אחת אחת ולהשוות השפע המנורמל שלה על פני דגימות (למשל גomparing בN2 פראי מסוג לעומת daf-2 RNAi האזור המשולב של השיא 18:00 מחולק בשיא 13:00 הסטנדרטי, המנורמל למסת PL כולל חלקי אזור PL 17:00 הסטנדרטי שיא): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2.jpg" alt="משוואה 1" fo:content-width="4.873in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2highres.jpg"/> צריך לבחור החוקר, זה גם יהיה ניתן לקבוע את האחוז של כל חומצת שומן שניתן בשברי PL TAG או כאחוז מהסכום הכולל של חומצת שומן נבדק ו( כדוגמא 18:00 בשבריר TAG בתולעי N2 ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3.jpg" alt="משוואה 1" fo:content-width="4.123in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3highres.jpg"/><img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = &quot;איור 1&quot; fo: תוכן רוחב = &quot;3.25in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg&quot; /&gt; איור 1. עבודה אופיינית לניסוי הכולל. יום 1, צלחות קפואות RNAi ספרייה מוטבעות על גבי צלחות אגרו LB מגבר / ט וטופחה על 37 ° C. יום 2, צלחות מגבר / ט משמשים לתרבויות נוזליות זרעים של שיבוטי RNAi בלוקים גם עמוקים. יום 3, חיידקים מרוכזים על ידי צנטריפוגה והועברו לצלחות RNAi 96-כן. יום 4, L1 הגוזל ג elegans מתווספים לצלחות RNAi בנוזל ולהתייבש. יום 7, בעלי חיים שנאספו בנוזל, מוכתמים באדום בהנילוס 40% isopropanol, רכובים על שקופיות טפלון 96-כן, וצלמו בעזרת מיקרוסקופ תפוקה גבוהה. <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2highres.jpg"/> איור 2. כתמים מקבעים מבוססי הנילוס האדומים גדולים <em&gt; ג חנויות elegans שומן. שדה בהיר נציג ותמונות GFP פלואורסצנטי מוצגות בN2 האכיל תולעים בfasn-1 (שומן קטן, נמוך), lpd-3 (דל שומן), בקרה (וקטור ריק), או daf-2 (שומן גבוה) שיבוטי RNAi. דוגמאות עובדו לפי הפרוטוקול (סכמטי באיור 1). בעלי חיים קבועים, מוכתמים באדום הנילוס, ותוצאת הדמיה ברמות שומנים דומים כפי שמתקבלת ממדידת שומנים ביוכימי. רמות Isopropanol-קבועות הנילוס האדומים פלואורסצנטי, שנרכשו מלפחות 6 משכפלים ביולוגיים, מוצגים בשורה הראשונה. רמות הטריגליצרידים כמותיים, רעיוניות של חנויות שומנים ניטראליות כוללות כאשר מנורמלת לרמות כוללות פוספוליפידים (תג / PL), שנלקחו מ4 משכפל ביולוגי, מוצגים בשורה השנייה. חשוב לציין כי quantitation המוחלט מושגת מהכתמה מקבעת הנילוס האדומים ונחישות שומנים ביוכימי לעתים קרובות אינו תואם באופן מושלם. במקרה זה, אם כי באופן איכותידומה, fasn-1 (RNAi) יש מסה שונה יותר הטריגליצרידים לעומת שליטה בשיטות הביוכימיות מכפי שצוין על ידי מיקרוסקופ, lpd-3 הן comparably שונים, וdaf-2 (RNAi) הן פחות שונים, למרות כל ההבדלים הם מאוד משמעותיים מבחינה סטטיסטית ו מדידות היו לשעתקו מאוד. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM (*, P ≤ 0.01; **, P ≤ 0.0001 ביחס לשליטה, נקבע על ידי T-מבחן המזווג, שני זנב בהנחה שונה שווה). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. מסת שומן נקבע על ידי כתמים אדומים הנילוס קיבעון בשלבי זחל שונים. בעלי חיים גדלו על OP50 חיידקים ונאסף בL1, L2, L3, L4 ושלבי התפתחות בוגרים הרה. תמונות נתפסו לאחר צביעת קיבעון ונותחה באמצעות סקריפט Matlab מותאם אישית כדי לקבוע 90 שנת אחוזון oעוצמת פיקסל f מעל האזור זיהה התולעת. שימו לב שאת רמות השומנים בדם של בעלי חיים להגדיל באופן משמעותי כחי מתפתח מL2 L4 לבמה, ואז להקטין מעט את החיה מתחילה להסיט קלוריות כיוון ההתפשטות של תאי המין בשלב הבוגר. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM ל6-8 חזרות (**, P ≤ 0.0001 ביחס למבוגרים הרה, נקבע על ידי T-מבחן מזווג, שני זנב). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. שחזור גבוה מעבר עצמאי ביולוגי משכפל. מוצג הנה עלילת פיזור של עוצמות קרינה אדומה הנילוס ברחבי ביולוגי משכפל (n = 6-8). עבור כל לשכפל, כל הערכים מנורמלים לעצמה הממוצעת של בקרות הווקטור הריקות. נתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM (**, P ≤ 0.0001 ביחס לשליטה, נקבע על ידי T-מבחן מזווג, שני זנב בהנחהשונה שווה). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5.jpg" alt="איור 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5highres.jpg"/> איור 5. GC-MS chromatograms של SPE מופרד תקנים וTAG סוג פראי ושפע PL. () עקבות GC-MS מוצגות בהפרדת SPE של תקני PL TAG ו. שים לב להיעדר המוחלט של חומצת שומן 13:00 בזכר PL והיעדר המקביל של חומצת השומן 17:00 בשמץ TAG, המציין הפרדה מלאה של TAG (tritridecanoin) מPL (1,2-diheptadecanoyl-SN-glycero -3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול)). (ב) נציג ספקטרום מלא של TAG וPL ממדגם של N2 הפראי סוג האכלת חי וקטור שליטת RNAi (HT115 חיידקים עם L4440 הווקטור RNAi הריק). microliter אחד המדגם הוזרק לAgilent 6890/5973N GCMS על פי הפרוטוקול, ופסגות בודדות זוהו על ידי ךטהזמן ntion וספקטרום המסה שלהם. קיצורים: סקל, חומצת שומן cyclopropane; ISO: ISO-. חומצה מתיל מסועף שרשרת שומן; GLA, חומצת גמא לינולנית; ALA, חומצת אלפא לינולנית; DGLA, חומצה לינולנית גמא dihomo; EPA, חומצת eicosapentaenoic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50180/50180fig5large.jpg" target="_blank">לוחצים כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

הערכה מיקרוסקופית ביוכימית ותפוקה גבוהה של מסת שומן ב-Caenorhabditis Elegans | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות ללימוד<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; חנויות שומנים. הליך מהיר, פשוט, תיקון מכתים-הדמית אגל שומני ניאון ממנף את המאפיינים ספקטרליים של הצבע האדום lipophilic הנילוס. לאחר מכן אנו מציגים מדידה ביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפידים באמצעות מיצוי שלב מוצק וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה המונית.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

biochemical-high-throughput-microscopic-assessment-fat-mass

Google

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Fundamentals

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Unit 1

Chemistry of Life

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

20.4K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות ללימוד Elegans Caenorhabditis חנויות שומנים. הליך מהיר, פשוט, תיקון מכתים-הדמית אגל שומני ניאון ממנף את המאפיינים ספקטרליים של הצבע האדום lipophilic הנילוס. לאחר מכן אנו מציגים מדידה ביוכימית של טריגליצרידים ופוספוליפיד?...

Video: Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...