עבודה זו התאפשרה על ידי המענק-NIH: R01GM109028 (S.P.C.)

1. הנילוס אדום (ע נ) צביעת של ליפידים
<ol><li>הכנה של 5 מ"ג/מ"ל ע נ מניות פתרון<ol>
<li>בתוך בקבוק 500 מ"ל, להוסיף 100 מ ג של אבקת NR 200 מ של אצטון 100%.</li>
		<li>מכסה הבקבוק ברדיד אלומיניום, כדי למנוע כל חשיפה לאור.</li>
		<li>לפני השימוש, מוסיפים את הפתרון עבור 2 h בחושך.</li>
		<li>לשימוש לטווח ארוך, לאחסן את הפתרון ע נ מניות בבקבוק אטום בחוזקה ללא כל חשיפה קלה. סולם ע נ מניות פתרון בהתאם לצרכי מחקר. ודא כי הפתרון מניות אותו משמש לאורך מכתים NR ניסויים כדי להשיג תוצאות מכתים והדמיה עקבית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת הפתרון עובד ע נ<ol>
<li>עבור כל 1 מ"ל של 40% אלכוהול איזופרופיל (v/v), להוסיף µL 6 ע נ מניות פתרון.</li>
		<li>היכונו 600 µL של הפתרון עובד ע נ כל דגימה. הערה: ודא NR טריים עובד פתרון נכון לפני צביעת. בהתאם לצרכי ע נ מניות פתרון, השתמש 15 מ"ל או צינור חרוטי 50 מ ל סיים את לימודיו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של תולעים NR השומנים מכתים<ol>
<li>לגדול תולעים שלב מוקדם L4-20 מעלות צלזיוס על מדיום הגידול נמטודות (NGM) עם יומן מאוחר OP50 e. coli.</li>
		<li>לשטוף את התולעים מחוץ לצלחת עם 1 מ"ל של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח + 0.01% טריטון X-100 (PBST) פתרון ולשים את המתלים תולעת צינור microfuge 1.5 mL.</li>
		<li>צנטריפוגה שהתולעים ב 560 x גרם עבור מינימלית 1 הסר את תגובת שיקוע ואת חזור על שלב זה עד e. coli מנוקה ההשעיה.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של 40% אלכוהול איזופרופיל בגדר תולעת, דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.</li>
		<li>Centrifuge התולעים ב x 560 גרם עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר תולעת. הערה: שימוש גבוה יותר אמצעי אחסון של PBST לרחוץ את התולעים מהצלחות, אם באמצעות לוחות גדולים יותר או צביעת יותר תולעים לכל צלחת. לא לשטוף את התולעים ב PBST יותר מאשר 15 דקות לפני הקיבעון הדגימה. ביצוע שוטף נוספים אם תגובת שיקוע אינה נמחקת של חיידקים. לבצע את הדגירה ב- 40% אלכוהול איזופרופיל באמצעות nutator או נדנדה. תמיד לפקח על הצינורות כדי לוודא עצבנות מדגם מלאה מתרחשת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השומנים מכתים עם נאט ו<ol>
<li>בחושך, להוסיף µL 600 של הפתרון עובד ע נ כל דגימה. היפוך הצינורות שלוש פעמים ומערבבים באופן מלא את התולעים בפתרון NR.</li>
		<li>לסובב את הדגימה בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.</li>
		<li>בעקבות הדגירה, centrifuge את התולעים ב x 560 גרם עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>הוסף 600 µL של PBST, דגירה הדגימות בחושך למשך 30 דקות להסיר את הכתם NR עודף.</li>
		<li>Centrifuge את הדגימות ב x 560 גרם עבור 1 דקות ולהסיר והכל אבל µL כ-50 של תגובת שיקוע. הערה: הדגירה ע נ אינו דורש עצבנות. שיקוע של תולעים נפוץ במהלך שלב זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של שקופיות מיקרוסקופ הדמיה<ol>
<li>Resuspend בגדר תולעת ב תגובת שיקוע הנותרים.</li>
		<li>מקום 5 µL של תולעת השעיה בשקופית מיקרוסקופ ולשים coverslip בקפידה כדי למנוע השמנה בועות אוויר.</li>
		<li>חותם את coverslip עם לק לפני הדמיה תולעים.</li>
		<li>להכין רק כמה שקופיות בכל פעם. פעולה זו תבטיח NR הדמיה נשאר קבוע מדגמים. איכות התמונות שהוכתמו NR פוחתת לאחר 6-אייץ השומנים דיסקרטית טיפות שקשה לצפות ומגביר את הרקע פלורסצנטיות, אשר מפריע ע נ אות זיהוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה של תולעים שהוכתמו NR<ol>
<li>תמונה התולעים בהגדלה X 5 כדי ללכוד מספר בעלי חיים לכל שדה ראייה.</li>
		<li>לעבור 10 X הגדלה על כימות יותר של תולעים בודדים.</li>
		<li>השתמש FITC/GFP ערוץ תמונה צבעונית-NR תולעים ולנסות פעמים חשיפה שונים כדי לקבוע את התנאים אופטימליים עבור כימות.</li>
		<li>לשמור קבצים בפורמט TIF כדי למנוע איבוד נתונים עקב דחיסה. הערה: חשיפה טיפוסית הזמן נע בין גב' 100-1000 לאחר זמן של חשיפה אופטימלית, להשתמש בו עבור כל הדגימות כדי לשמור על עקביות הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כימות תמונה צביעת NR<ol>
<li>להעלות micrographs ImageJ. בתפריט הנפתח תוספים, השתמש בפונקציה ביו-תבניות אם קובץ התמונה לא מזוהה.</li>
		<li>בתפריט הנפתח ' התמונה, תחת הפונקציה ערימות, להשתמש בתמונות-כדי-מחסנית כדי ליצור אוסף תמונות כאשר micrographs מספר מושווים.</li>
		<li>התפריט הנפתח, התאם בהירות/חדות של אוסף התמונות, הפץ שינויים כל התמונות על ידי לחיצה על החל.</li>
		<li>מעסיקים הכלי בחירה מצולע ניסחו כל תולעת שבעורך ולהשתמש בפונקציה מידה תחת התפריט הנפתח ניתוח כדי לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הנפלטת ע נ.</li>
		<li>עבור כל תמונה, למדוד את מיקומי רקע חמש, לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע הממוצע.</li>
		<li>להפחית את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הרקע של כל תולעת הדמיה באמצעות הנוסחה N = G - (A x B), שבו N מייצג פלורסצנטיות נטו, G עבור קרינה פלואורסצנטית בוטה, A עבור אזור תולעת הכולל ו- B על רקע הממוצע זריחה.</li>
		<li>לנרמל את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לפי גודל התולעת, לחלק זריחה של התולעת כל נטו לפי אזור הכולל שלה. התוצאות מדווחות כמו עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ביחידות שרירותי (א"א), לפיקסל. הערה: להימנע ייצוא תמונות בתבנית JPEG. בזמן הדחיסה הופך קבצים יותר לניהול לאחסון, תקינות נתונים בסכנה על ידי תבנית זו. ודא כי כל התמונות הם שונו ולא מנותח באופן זהה. זכור כוללות סרגל קנה מידה כדי להעריך כראוי את גודל בהגדלות שונות. כדאי להמחיש את הבדלי עוצמת קרינה פלואורסצנטית באמצעות ImageJ, להחליף סוג תמונה מ- RGB ל- 8-bit ובחר אש ', מתפריט טבלאות (LUT) ' בדיקת מידע ' התמונה. זה יוצר תמונה חום-מפה באיזה צבע מוגברת בהירות בקורלציה עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מוגברת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. שמן אדום O צביעת (אורו) של ליפידים
<ol><li>הכנה של פתרון מניות אורו<ol>
<li>בבקבוק 250 מ ל, להוסיף 500 מ ג של אבקת אורו 100 מ של 100% אלכוהול איזופרופיל ומערבבים היטב.</li>
		<li>לאחר מוכן, אחסן את הפתרון בחוזקה חתום עם חשיפה קלה. לא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת הפתרון עובד אורו<ol>
<li>אורו הפתרון מניות במים (3:2) 60% אלכוהול איזופרופיל מדולל.</li>
		<li>לפני השימוש, לסנן את הפתרון אורו עובד דרך מסנן סטרילי מזרק 0.2 µm אצטט תאית. הערה: לקבלת איכות הפתרון הטוב ביותר, להכין הפתרון אורו עובד יום לפני, ולתת לו לערבב בין לילה. עם זאת, אם הפתרון הדרוש באותו יום, לדלל, לערבב פתרון אורו על כיסא נדנדה כבר לפחות שעתיים לפני השימוש. לפני נדנדה, לעטוף את צינור חרוטי פרפין הקלטת כדי למנוע דליפה של אורו פתרון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של תולעים אורו השומנים מכתים<ol>
<li>לגדל את התולעים ב 20 מעלות צלזיוס על מדיום הגידול נמטודות (NGM) עם יומן מאוחר OP50 e. coli לשלב החיים הרצויה.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של פתרון PBST לצלחת, מערבולת עד כל התולעים רלוונטי. להטות את הצלחת, לשטוף אותו עם 1 מ"ל של PBST. להעביר את המתלים תולעת צינור microfuge 1.5 mL.</li>
		<li>צנטריפוגה שהתולעים ב 560 x גרם עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע את גלולה ולא לחזור על השטיפה צעד עם 1 מ"ל של PBST שלוש פעמים. הסר את כל µL supernatant אבל 100.</li>
		<li>להוסיף 600 µL של 40% אלכוהול איזופרופיל בגדר תולעת, שחק אותה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.</li>
		<li>Centrifuge התולעים-560 x g עבור 30 s והסר כל supernatant אבל 100 µL מבלי לשבש את פעולת בגדר תולעת. הערה: השתמש כמויות גבוהות יותר של PBST לרחוץ תולעים את לוחות אם עושה מכתים תפוקה גבוהה. אנחנו לא שוטפים תולעים ב PBST יותר מאשר 15 דקות לפני קיבוע הדגימה. לעשות שוטף נוספים אם תגובת שיקוע אינה נמחקת של חיידקים. לבצע את הדגירה ב- 40% אלכוהול איזופרופיל באמצעות nutator או נדנדה. תמיד לפקח על צינורות כדי לוודא עצבנות מדגם מלאה מתרחשת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השומנים מכתים עם אורו<ol>
<li>להוסיף הפתרון עובד אורו µL 600 כל דגימה. היפוך הצינור שלוש פעמים ומערבבים את התולעים היטב אורו.</li>
		<li>לסובב את הדגימות-סל ד 30 עבור 2 h בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>Centrifuge את הדגימות ב x 560 גרם עבור 1 דקות, לחסל את כל µL supernatant אבל 100.</li>
		<li>Resuspend את הדגימות ב 600 µL של PBST, לסובב את הצינורות-30 סל"ד למשך 30 דקות להסיר את הכתם אורו עודף.</li>
		<li>צנטריפוגה דגימות ב x 560 גרם עבור 1 דקות, לחסל את כולם חוץ µL 50 של תגובת שיקוע.</li>
		<li>להבחין טוב יותר את המיקום של החיה germline ואת תאי המעי, כתם גרעינים על-ידי הוספת 1 µL של (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-אינדול-6-carboxamidine) (דאפי) עבור כל 1 מ"ל של הפתרון עובד אורו. לבצע את אורו צביעת עבור 2 h עם הוספת דאפי לפני הרכבה שקופיות עבור הדמיה. הגרעינים מעיים גדולה, בלוטת המין מאופיינת תאי נבט המתפתח. הערה: לאחר אורו מכתים, תולעים עלול לדבוק צידי הצינור microfuge, להיכשל בצורת גלולה מורגש. במקרה כזה, centrifuge את התולעים שוב או לאפשר תולעים להתפשר על ידי הכבידה לפחות 10 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של השקופיות תולעת הדמיה<ol>
<li>Resuspend התולעים, תגובת שיקוע הנותרים ומערבבים היטב את הפתרון.</li>
		<li>לשים 5 µL של תולעת השעיה בשקופית מיקרוסקופ ומניחים coverslip בזהירות, המבטיח כי אין אוויר בועות טופס.</li>
		<li>חותם את coverslip עם לק ותולעים התמונה. הערה: לאחר תיקון מכתים, תולעים יכולה להיות מאוד נוקשה וקשה פיפטה. כדי לעקוף את זה, להפוך רחב נשא פיפטות שתורידו את העצות שלהם.</li>
		<li>אחסן את השקופיות במעמד מיקרו-צנטריפוגה ב 4 ° C עבור עד 24 שעות אם לא הדמיה מיד לאחר צביעת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה של תולעים שהוכתמו אורו<ol>
<li>השתמש מצלמה צבע בעל יכולת כדי התמונה שהוכתמו אורו תולעים.</li>
		<li>להשתמש 5 X הגדלה התמונה תולעים מספר אחד שדה ראייה.</li>
		<li>לעבור 10 X הגדלה יותר בחינת תולעים בודדים.</li>
		<li>לייצא תמונות בפורמט TIF כדי למנוע אובדן נתונים עקב דחיסה. הערה: אם מכתים עם אורו + דאפי, לעבור את המצלמה תומך-צבע אחד זה יכול ללכוד זריחה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח תמונות של תולעים שהוכתמו אורו<ol>
<li>להעלות micrograph(s) ImageJ. בתפריט הנפתח תוספים, השתמש בפונקציה ביו-תבניות אם קובץ התמונה לא מזוהה.</li>
		<li>בתפריט הנפתח ' התמונה, תחת הפונקציה ערימות, להשתמש בתמונות-כדי-מחסנית כדי ליצור אוסף תמונות כאשר micrographs מספר מושווים.</li>
		<li>התאם בהירות/חדות תחת התפריט הנפתח כדי לשפר את הנראות של השומנים טיפות.</li>
		<li>לסווג את התמונות לפי הצטברות שומנים בדם לאורך כל גוף החיה או ברקמות מסוימות.</li>
		<li>עבור הערכה טובה יותר של השומנים לוקליזציה ועבור זיהוי חפצים שאינם ספציפיים התמונה באמצעות ImageJ, בחר בפונקציה צבע תחת התפריט הנפתח התמונה ולחץ על מחסנית ל- RGB כדי להראות את הסימנים של כל רכיב RGB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis.">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li><li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li><li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation.">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism.">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li><li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+lipidome:+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li><li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods.">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810 (2010).</li><li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).</li><li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+(CARS)+and+Stimulated+Raman+Scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li><li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans.">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

עליית השמנת יתר, מחלות מטבוליות המחירים גורם C. elegans מודל מתאים ללמוד את המנגנונים המווסתים הצטברות שומן ב תאים ורקמות. ממצאים אחרונים מעידים כי השינויים ברמות השומנים נמצאים בקורלציה עם תהליכים תאיים החל אינסולין איתות8, ההפעלה של הורמון קולטנים2, פלט הרבייה...

שומנים חיוניים לחיים. הם חלק בלתי נפרד מרכיבי ממברנות, לשמש שליחים משניים, אות מתמרים, ויש פונקציות מכריע באחסון אנרגיה. כאשר מטבולי dysregulated, זה מוביל מחלות כמו השמנת יתר, סוכרת סוג II, אשר לוחץ על בריאות הציבור חששות9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל מצוין שבו ללמוד מטבולי כי יש מחזור חיים קצר יחסית, גוף שקוף, שושלת תא ידוע ו גנום מלא ברצף. בעיקר אנדרוגינוס, C. elegans מאפשר לחוקרים להעלות מספר גדול של חיות isogenic בקיצור פרקי זמן למסכים carryout תפוקה גבוהה העברה גנטית ללמוד מגוון רחב של גנים מסלולים מטבוליים4. גישה זו חשפה רמה גבוהה של שימור גנים מטבוליזם השומנים של C. elegans 273 בין בני אדם, עכברים, חולדות, דרוזופילה. יתר על כן, הגנים השומנים מעל 300 C . elegans יש orthologues האנושי המשויכות עם מחלות שאינן קשורות תסמונת מטבולית11. באופן מסורתי, בחינת השומנים אחסון C . elegans הסתמכה בעיקר על מבחני התווית על-ידי צבע, המספקות מידע חזקה על הצטברות שומנים בדם. פחות נפוץ הוא תיאור של איפה לשפה ליפידים ההבדלים נמדד בשפע השומנים מעבר רקמות. עם זאת, העבודה האחרונה חשף כי השומנים הפצה יכול להיות חשוב כמו הצטברות השומנים6.
לאחרונה, מחקרים החלו שילוב שיטות כמו ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה מסות (HPLC-MS), גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS), ולא קוהרנטי אנטי-סטוקס ראמאן מיקרוסקופ פיזור (מכוניות) לכתובת החסרונות של גישות כתם על-ידי ישירות ניתוח התוכן של השומנים תמציות השומנים ספציפי שברים, השומנים פיקדונות, בהתאמה10,11. יתר על כן, מיקרוסקופיה מכוניות חשף כי הנילוס אדום יכול לשמש רק proxy עבור הצטברות שומן כאשר הוא משמש צבע מקבע, עבור השימוש כמו כתם חיוני שמוביל רחוק ממסלול הנחיתה-צביעת של auto-פלורסנט organelles10. עם זאת, נדרשת מומחיות טכנית של עלויות המשויכות גזים אלה ולעשות מיקרוסקופ שיטות השימוש שלהם רופף עבור שאלות מחקר רבות. במאמר זה נדון שיטה נוח ואמין שמלמדות, כתם משקעי השומנים נייטרלי C. elegans באמצעות הנילוס אדום, שמן אדום O להבחין שפע השומנים בבעלי חיים שלם, ברקמות מסוימות.
הנילוס אדום, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, הוא צבע benzophenoxazone ברצון מתמוסס בממיסים אורגניים שונים, אך בעיקר הוא מסיס במים. . זה צבע lysochrome מעולה נהגה כתם נייטרלי שומנים כגון טריגליצרידים או האסטרים כולסטרול כי הוא כולל צבע חזק, solubilizes גם שומנים, יש זניח אינטראקציה עם הרקמות הסובבות, והוא פחות מסיס הממס יותר ב שומנים. יש של maxima עירור, פליטה של 450-500 ו 520 ננומטר, בהתאמה1. כאשר הנילוס C. elegans המוכתמות באדום מוצג עבור קרינה פלואורסצנטית ירוק, גופים השומנים דיסקרטית ניתן נצפתה לאורך כל המעי לרקמות אחרות או אשכולות בתוך או באופן שווה התפזרו, בהתאם של החיה גנוטיפ או טיפול ניסיוני 7.
שמן אדום O היא lysochrome, צבע מסיס בשומן נהגה כתם lipoproteins טריגליצרידים. זה נקרא של צבע אזו כי המבנה הכימי שלו מכיל שתי קבוצות אזו המצורפת שלוש טבעות ארומטיות. זה קשה ionize, אשר הופך את מסיס מאוד שומנים. צבעה כתם אדום והוא קליטת האור שלה המרבי 518 nm 3. C. elegans מוכתם עם שמן אדום O להראות טיפות השומנים אדום אשר בולטות נגד גוף שקוף החיה, אשר מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות שונות6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל יוצא דופן שבו ללמוד השומנים ומטבוליזם אנרגיה הומאוסטזיס. רבים מבין הגנים השומנים שלו נשמרים אצל בני אדם, קשורים עם תסמונת מטבולית או מחלות אחרות. בחינה של הצטברות השומנים בתוך האורגניזם יכול להתבצע על ידי צבעי לשבועיים או שיטות ללא תווית. מקבע כתמים כמו הנילוס אדום, שמן אדום O דרכים זול, אמין למדוד באופן כמותי את רמות השומנים בדם, איכותית. מהניסוי לצפות השומנים הפצה ברחבי רקמות, בהתאמה. יתר על כן, הכתמים האלה מאפשרות תפוקה גבוהה הקרנת גנים מטבוליזם השומנים מסלולים שונים. בנוסף, הידרופוביות טבען מקלה על מסיסות השומנים, מפחית את האינטראקציה עם הרקמות הסובבות, ומונעת דיסוציאציה לתוך הממס. למרות ששיטות אלה יעילים בחינת תוכן שומני כללי, הם לא מספקים מידע מפורט אודות ההרכב הכימי ואת הרב-גוניות של משקעי השומנים. עבור מטרות אלה, ללא תווית שיטות כמו מיקרוסקופ GC-MS ומכוניות הם יותר מתאימים, שלהם עולה על אף האמור.

SKN-1 הוא bZip, גורם שעתוק cytoprotective מניות הומולוגיה עם NRF2 יונקים, הוכח לתווך חמצון חומצות שומן. בהתאם ריכוז הגלוקוז בתזונה שלהם, להראות תולעים עם אלל צורונים מופעל skn-1 רמות השומנים בדם שונה כשהוא מוכתם הנילוס אדום7. איור 1A -C מראה מופעל ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining at JoVE.com

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

הנילוס אדום צביעה של קבוע Caenorhabditis elegans הוא שיטה למדידה כמותית של משקעי השומנים נייטרלי, בעוד שמן אדום O צביעת מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.0K Views.  University of Southern California. הנילוס אדום צביעה של קבוע Caenorhabditis elegans הוא שיטה למדידה כמותית של משקעי השומנים נייטרלי, בעוד שמן אדום O צביעת מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות.

Video: Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The carotid bodies (CB), a key organ of peripheral hypoxic sensitivity, express the long functional isoform of leptin receptor (LepRb) but the role of leptin signaling in control of breathing has not been fully elucidated. We examined the hypoxic ventilatory response (HVR) (1) in C57BL/6J mice before and after leptin infusion at baseline and after CB denervation; (2) in LepRb-deficient obese db/db mice at baseline and after LepRb overexpression in CBs. In C57BL/6J mice, leptin increased HVR and effects of leptin on HVR were abolished by CB denervation. In db/db mice, LepRb expression in CB augmented the HVR. Therefore, we conclude that leptin acts in CB to augment responses to hypoxia.

Our study focuses on the effects of leptin signaling in carotid body (CB) on the hypoxic ventilatory response (HVR). We performed &#39;loss of function&#39; experiments measuring the effect of leptin on HVR after CB denervation and &#39;gain of function&#39; experiments measuring HVR after overexpression of the leptin receptor in CB.

גישה ניסויית לבדיקת איתות לפטין בגוף העורק והשפעותיו על השליטה בנשימה

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...