עבודה זו נתמכה על ידי פול ד Wellstone השיתופי מרכז המחקר (AR052646).

כל הנהלים כבר נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה IACUC. 1. Dissection והכנה אדי (כ 30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכברים על מנת להבטיח שהם חווים ללא כאב או מצוקה במהלך ההליך, אבל שיישארו את שרירי חומצן היטב על ידי המחזור. אנו משתמשים באופן שגרתי קוקטייל קטמין / xylazine (מ&quot;ג 100/10 / ק&quot;ג) מוזרק באמצעות IP. מטוס כירורגית של הרדמה נקבע על עדר מוחלט של דוושה או רפלקסים גמילה palpedral, או חוסר תגובת עווית אוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את hindlimbs באמצעות קלטת רפואית, ולהסיר את העור של hindlimb הקדמי הנמוך לחשוף את השרירים של אזור זה. לשמור על השרירים לחים עם היישום של PBS במרווחי זמן קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ביתור, עושה חתך לרוחב בברך קטן במטרה לחשוף את הגיד הפרוקסימלי של שריר האד. ישנם שני גידים באזור זה, ושניהם צריכים להיות חתוכים כדי לאפשר מחדשmoval של אדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרסול המדיאלי, לחתוך את הגיד של שריר ת&quot;א לחשוף את הגידים הדיסטלי של אדי, שמשתרעים לאורך tarsals meta. הרם את שרירי ת&quot;א מהדרך, נזהר שלא לקצץ או לגעת במתחת האד. חזור אל הגידים הדיסטלי של אדי, מקצץ כל אחד ולמשוך אותם דרך הקרסול, ואז תופס את הגידים, משוך בעדינות את האד משאר האיברים. זה צריך לשחרר מקצה הפרוקסימלי בחופשיות, אבל אם לא, יחזור לחתך הרוחבי על מנת להבטיח שהגיד הוא לחתוך. הסר את השריר ומניח בצלחת מלאה בביתור Ringers חומץ מצונן. הצמד את השריר באמצעות הגידים באורך כ מנוחה, שהוא מצא באורך vivo. האורך קצר מדי כאשר השריר רפוי בצלחת, וארוך מדי, אם השריר מושך על פיני מנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באופן מיידי לאחר הסרת שריר על ידי נקע בצוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את התפרים ל10דונים, קרוב ככל האפשר לשריר, אבל לא נוגעים בשרירים. הצמד את השריר באורך כ מנוחה באמצעות התפרים. </li></ol> 2. Dissection סרעפת והכנה (כ 30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים לפני הליך זה על ידי עקירת צוואר רחם בהרדמה, אם אותו העכבר הוא נתון לשני הניתוחים, או על ידי CO 2 אחרי אישור עם נקע בצוואר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בעור כדי לחשוף את חלל בטן ובחזה. פתח את חלל הבטן, וחותך את קיר הגוף בדיוק מתחת לצלעות. בעזרת מספרי עצם, ומתחיל מעל לכניסת הסרעפת, עקפה את כל הצלעות בעקבות השורה של הצלעות, והחתך דרך עמוד שדרה. חותך כלי דם, שעובר במרכזה של הסרעפת, כך שניתן להסיר בקלות את הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרעפת מהעכבר, ומעביר לכלי ביתור המלאים Ringers חומץ. עדינות להתסיס diaphragm בצלחת על מנת לשטוף את הדם. רענן אצבעות פתרון לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך פס קטן של הסרעפת מהגיד המרכזי לצלעות לאורך הכיוון של הסיבים בחלק המרכזי של hemidiaphragms לרוחב. הרצועה צריכה להיות בין 2-4 מ&quot;מ רחב. בעזרת מספרי עצמות, לחתוך את הצלעות משני הצדדים של הרצועה, ומשאיר כ 1-2 סככת מ&quot;מ של צלעות בכל צד של רצועת הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את התפרים בגיד המרכזי. לקשור את תפר לכל אחד מקצות הצלעות רוחביות הבולטים, ואז לקשור אותם יחד כדי להפוך את לולאה גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי רצועות ניתן להשיג מכל סרעפת נתונה (אחד מכל צד). </li></ol> 3. שרירי הרכבה בבאת&#39; המכניקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את התפרים ולהשתמש אלה כדי לצרף שרירים להודעה נוקשה בקצה אחד, ולמתמר כוח בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את האורך כדי לוודא את השריר הוא לא רפוי, אבל לא מתוח. קירוב טוב הוא musc המנוחהאורך le כמו ב1.4-1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיה צריכה להיות מלאה בפתרון Ringers חומץ נשמר ב22 ° C כדי להאריך את שרירי יציבות לבדיקה. שרירים צריכים לנוח למשך 5 דקות באמבטיה זה לפני המבחן פונקציונלי, כך שטמפרטורת השריר היא מתאזנת עד 22 ° C. </li></ol> 4. התכווצויות איזומטרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע תנאי גירוי Supramaximal. לאחר שריר ממוקם באמבטיה, השתמש 0.5 פולסים msec גירוי בודדים כדי לייצר עווית, ולפקח על תפוקת כוח. הגדל בהדרגה את הזרם עד שהכח משיג רמה מקסימלי אך יציבה. הגדל נוכחי עד 10% יותר מרמה זו לניסויים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים אורך אופטימלי. באמצעות גירויים מפרכס איזומטרי, להתאים את האורך של השריר בהדרגה עד לכוח מקסימאלי מתקבל. הנח את השרירים ~ 10 שניות בין כל כיווץ. אורך שריר אופטימלי (L o) מושגת כאשר כוח העווית הוא מקסימאלי. אורך שריר רשום (האורך יהיהtween צומת myotendinous לאד, ובין צומת המרכזי גיד myotendinous והחדרת השריר לצלעות) באמצעות מחוגה Vernier. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיל Tetanic איזומטרי מרבי. לעורר שרירים להגדיר בL o לתקופה של 500 אלפיות שני, עם סדרה של פולסים 0.5 msec בגירוי supramaximal ובתדר היתוך (מהרמה של יחסי כוח תדר (למשל Ref:. 8) הרמה לשרירי אד היא הושג בדרך כלל עם 120 הרץ, ולשרירי סרעפת עם 100 הרץ. להמריץ 3 פעמים בתדירות המתאימה עם תקופות מנוחה של 5 דקות בין התקפי גירוי לכל שריר. </li></ol> 5. התכווצויות אקסצנטריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שרירים לנוח 5 דקות בין ביצוע התכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את השרירים באופן שווה ל80 הרץ הראשוני 500 אלפית השני, ואחריו 10% מתיחת L o בגירוי msec הסופי 200 (שיעור מתיחה של 0.5 הליטר o/ שני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על דפוס גירוי עם 5 דקות בין הפסקות למספר הרצוי של התכווצויות אקסצנטריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד כוח לכל התכווצות בפרק הזמן שלפני המתיחה. לחשב את הירידה בכוח בין הציר הראשון והאחרון. </li></ol> 6. הסרת שריר מהמנגנון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצר את אורך השריר, כדי לאפשר הסרה עדינה של השריר מהמתמר ולפרסם ולהחזיר אותו לצלחת לנתח באצבעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תפרים מהשרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשרירי אדי, למחוק את השריר פעמים, שוקל אותו, לפני עיבוד לאחר מכן (למשל הקפאה, תיקון, וכו &#39;). זה יהיה חשוב לחישוב שטח חתך צלב, וכוח מסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשריר הסרעפת, להשרות ב0.1% procion כתום, צבע impermeant קרום לדקות 15-20. זה יספק מדד לניזק לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנתחים את השרירים מההכנסה הגרמית, כמו גם את הסנאטגיד RAL. זה הכרחי כדי לספק משקל מדויק של השריר. תמחה כאמור לפני השקילה והכנה שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב לחצות איזור Sectional (CSA): CSA (מ&quot;מ 2) = מסה (מ&quot;ג) / [(L o מ&quot;מ) * (L / L O) * (1.06 / מ&quot;מ מ&quot;ג 3)], בי L / L o הוא הסיבים ליחס אורך שריר (0.45 עבור אד, 1.0 לסרעפת) 5 ב -1.06 הן הצפיפות של שריר. </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function.">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li><li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice.">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue.">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old.">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle.">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582 (2011).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle.">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li><li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות אורורה מדעית.

המטרה של מאמר זה היא לספק הדרכה לביצוע תפקוד שרירים מבודד בשני שרירים מעכברים - edl והסרעפת. הערכה של שרירים אלה יכול לספק תובנה אם צנרת תרופות למחלת שרירים מועילות. לשני שרירים, הגורם המרכזי בקבלת נתונים חזקים הוא נתיחה נקיה. לכן, תרגול ושכלול צעד הבידוד הראשוני חיוני לפני שעבר על בדיקות פונקציונליות. בנוסף, הקמת אמות מידה פונקציונליות לשרירים נורמלים היא קריטית לפני ביצוע השוואות לשרירי dystrophic, או בין טיפולים. זה יבטיח כי תוצאות המחקר אינן כפופות להשתנות גבוהה שהקנתה את היכולת של האדם שבצע את הניסויים. השימוש בצבע impermeant קרום יכול לעזור בביצוע אופטימיזציה להכנת הנתיחה, לדגירה של כל שריר בתמיסה המכילה צבע כזה יציין סיבים פגומים ביותר, ויכול לשמש כמדד דהצלחת issection. צמצום מספרם של סיבי השריר שהניזוק ביעזור לייעל את המדידה. את הסיבים שניזוקו על ידי נתיחה לזרוח הרבה יותר בהירים מאלה נפגעו על ידי כיווץ אקסצנטרי, ולכן אם לצבוע הוא גם משמש בתהליך המכניקה, אפשר להשתמש בעוצמת הצבע כדי להבחין בין שני סוגים של ניזק. נתיחה של רצועות סרעפת כמעט תמיד יש ניזק סיבים, פשוט כי על ידי החיתוך לאורך הסיבים, חלק בלתי נמנע לקבל נהרס. ספיגת דאי היא חזקה בסיבים הפגומים האלה, ואלה בדרך כלל מוגבלים לשולים החיצוניים של ההכנה. בממוצע, אנו רואים להקה של סיבים שהניזוק שהם ~ 3 סיבים ברוחב (~ 120 מיקרומטר) משני צדי רצועת השריר. אם הלהקה הפגומה מונה יותר מ 15% של השרירים, אז הנתונים נמחקים. הכנת הסרעפת יש גם מגבלות על הגודל אופטימלי לפעולות פונקציונליות. אנחנו גילינו שחתיכות של דiaphragm שהם רחבים יותר מ 5 מ&quot;מ מתחיל לקפל בעצמם, כי עניבת הגיד המרכזית היא רק בנקודה אחת. התוצאה הוא הירידה בכוח מסוים בהכנה. גם אנחנו גילינו שרצועות צרות יותר יש גם כוח סגולי נמוך, אשר אנו מאמינים היא כי המספרים של סיבים שניזוקו במהלך הנתיחה מהווים חלק גדול יותר ממספר הסיבים הכוללים. לדוגמה, אם 0.1 מ&quot;מ בכל צד פגום, שעומד על 5% (2x0.1 מ&quot;מ / 4 רצועת מ&quot;מ) של הכנת השרירים שאינו תורמים לכוח, בעוד שאם הרצועה היא רק 1 מ&quot;מ, ולאחר מכן 20 % מהכנת השריר פגומים. לפיכך, גם את רוחבו של האזור הפגוע, כמו גם הרוחב של כל ההכנות הם גורמים חשובים כדי לשלוט. מדידות של מתח איזומטרי מרבי מחייבות שכל סיבי השריר בשריר המגורה. מכיוון שקיימות שונות עצומות ברכיבים של מנגנון לתפקד, זה צריך להיקבע לכל קבוצת פרטעד. לדוגמה, גודל אמבטיה או הסוג של גירוי יכול להשפיע על עוצמת הגירוי. גירוי עווית הוא דרך סבירה כדי לקבוע תנאי גירוי supramaximal. ברגע שזה הוקם להתקנה ושרירים ספציפיים, זה יכול להיות מנוצל עבור מחקרים עוקבים. לעומת זאת, האורך האופטימלי של כל שריר נתון צריך להימדד עבור כל הכנה באמצעות תהליך איטרטיבי שתואר לעיל. הדבר זה מבטיח שחפיפת נימה עבה ודקה היא אופטימלית וכושר הייצור הפוטנציאלי המקסימאלי כוח נמדד. הליכים חלופיים יכולים להסתמך על דפוסי התאבכות הקשורים לפסי השרירים, אבל זה דורש ציוד נוסף שלא תאר כאן. אנו משתמשים באופן שגרתי 500 משכי גירויי msec, אשר נופלים בטווח ביניים של פרמטר זה בשימוש על ידי חוקרים אחרים בתחום זה. למרות שזה עלול לגרום לעייפות מסוימת של השריר במהלך ההתכווצות, אשר באו לידי ביטויעל ידי &quot;סאג&quot; בהפקת הכח המרבית, זה בעצמו יכול להיות אינפורמטיבי. לדוגמה, הבדל בעייפות יכול להיות מושגת על ידי סוגים שונים של טיפולים כוללים אלה שטיפול סיד היעד, ומכאן לשקוע בתוקף במהלך ההתכווצות פעילה יכול לשמש כמדד לשיפור. לחלופין, אובדן הכח יכול להצביע על כך שהתפרים בגידים הם לא מספיק חזקים, ושהם החליקו במהלך ההתכווצות. השרירים יש להסיר מן האמבטיה והתפרים יש קשר באם זה קורה. אנו משתמשים גם בסדרה של 3 התכווצויות tetanic, שעוזרת להעריך את היציבות של ההכנה. שוב, תלושי תפר יובילו לאובדן של כוח בין צירים, הדורשים תפירה מחדש קשירה-. שרירים גדולים יכולים גם לייצר ליבות anoxic, שיוביל להפסדים בכח בפרוטוקול. גודל שריר הוא גורם מגביל לביצוע בדיקות תפקוד שרירים מבודדות, שבו שרירי אד עם מסה גדולה מ 20 מ&quot;ג מאבדים כוח עם כל Contraction, ולא יכול להיות נתמך על ידי superfusion באמבטיה. רצועות סרעפת לא סובלות מאותם סיבוכים כי הם דקים מספיק כדי להיות כדאיות ממושכת באמבטיה. שרירים אחרים יכולים להיות מנוצלים לתפקוד שרירים מבודד, לרבות שריר soleus, המשמש בדרך כלל, אבל לא תארו כאן. רבים מאותם הנהלים יכולים להיות מאומצים על soleus במונחים של ההכנה והבדיקה הפונקציונלית. עם זאת, ההבדלים העיקריים הם בתדר הגירוי, ואת הפרמטרים להתכווצויות אקסצנטריות. השתמש של soleus לפונקציה שמשלים את שני שרירים האחרים, ולכן הוא צריך להיחשב כחלק מחבילה &quot;סטנדרטית&quot; להערכת עכברי dystrophic 4, 7. כיווץ אקסצנטרי מספק מדד השבריריות התכווצות, וזה חשוב להשתמש בפרוטוקול שגורם לאובדן צנוע של כוח בשרירים מחי wildtype ואובדן משמעותי של כוח בשרירי dystrophic לא טופלו, כך שיש טווח דינמי רחב להשוואות. חוסר כל אובדן כוח בשרירים נורמלים מרמז כי הכיווץ האקסצנטרי הוא קל מדי, ולא יהיה מספיק כדי להבחין בין טיפולים שאינם יעילים ואת אלו שהם באמת מועילים. עם זאת, הפסד דרמטי בכוח בשרירים נורמלים הנתון לכיווץ אקסצנטרי עלול להיות גדול מדי כדי להקניט את הבדלים הקשורים במחלה. הפרוטוקול שלנו לedl והסרעפת משתמש בשיעור 0.5 Lo / שנייה למתוח כדי לייצר 10% שינוי אורך. אנחנו בדרך כלל לבצע 5 התכווצויות אקסצנטריות, שתוצאה בהפסד קטן של כוח בשרירים נורמלים ואובדן משמעותי של כוח בשרירי dystrophic. אין ספק, כל הפרמטרים הללו יכול להיות מגוונים כדי להגדיל את אורך השינוי הכולל, בשיעור של מתיחה, או במספר ההתכווצויות אקסצנטריות כדי להבחין בהבדלים בין שריר חולה ובריא, כמו גם על השפעת סוג מסוים של מוטציה או לאreatment אחד לא לומד. כל עוד יש הבדל ניכר בין שרירים בריאים וחולים, אז יש תקן זהב להגיע למונחים של טיפולים. לסיכום, פרוטוקול זה מקובע הנחיות לביצוע התכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, ואני מקווה שמזהה את המלכודות הפוטנציאליות להימנע בעת הגדרת טכניקה זו במעבדה שלך.

מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכת טיפולים פוטנציאליים לשרירי פתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. למחלת שרירים, השימוש במודלים של עכברים הפך למרכיב מרכזי להבנת הקשר בין גנוטיפ ופנוטיפ, ולהעמקת ידע שלתכנון והבדיקה של תרופות פוטנציאליות. את ניוון השרירים, בפרט, יש לסמוך על עכברים כדי להעריך הסוכנים הללו וליצור נתונים טרום קליניים הנדרשים להתקדם לניסויים בחולים. מדד תוצאה תכופה משתמש בתפקוד שרירים מבודדים כדי לקבוע כוח, אשר חל על מגוון רחב של מחקרים. מדד נוסף הוא השימוש באקסצנטרי, או התארכות, התכווצויות לקבוע שינויים בשלמות קרום שריר, שהוא לוקה במחלת ניוון שרירים דושנה, ומודל עכברי למחלה זו (MDX). לכן, זה הכרחי עבור אלו סוגים של measuremמציג להיות רגיש לשחזור. Longus עכבר extensor digitorum (אדי) השריר כבר בשימוש נרחב לתפקוד שרירים מבודד בשל הגיאומטריה שלו אידיאלית והגודל, כולל נטייה אחידה סיבים וגידים מוחלטים 2, 5, 6, 10, 12. שיטות לשרירי אדי מדידות פונקציונליות איזומטרי תוארו בפרסום קודם יופיטר 8, כמו גם ב1 SOP טריט-NMD. הרחבנו את התיאור של שיטות אלה כדי לכלול את שני צירים איזומטרי ואקסצנטריים. סימני היכר של מחלה ניכרים באד, לרבות מחזורי heighted של ניוון / התחדשות ותפוקת כוח מצומצמת. סרעפת העכבר מציגה את ההתקדמות פתולוגית המהירה ביותר של ניוון שרירים בהשוואה לשרירים אחרים בעכבר 11. בגיל 6 חודשים, סיסטיק המצטבר מהווה כ 50% מהשריר. כתוצאה מכך באופן משמעותי impaireפלט ד כוח 11. לכן, סוכנים טיפוליים שיכול למנוע חדירת fibrotic ניתן להעריך ביעילות בסרעפת. אובדן הדיסטרופין בשריר גורם לשבירות מוגברת וניזק מוגבר בכל התכווצות השרירים 9. לכן טיפולים רבים למחלת ניוון שרירים דושן מיועדים להחלפת הדיסטרופין. ככזה, assay שהפך חיונית להערכת אסטרטגיות אלה הוא כיווץ אקסצנטרי, שיכול להבחין בין השרירים נורמלים וdystrophic, כמו גם לקבוע מה התועלת באסטרטגיה מסוימת יש להגנה על שריר dystrophic מניזק כויץ 2, 3, 4, 12. הליך זה מחייב גם סרוו מנוע כפול במצב שיכול להשפיע על אורך / ושיא כוח, או בשיטה של ​​התאמת אורך מהירות נפרד ממתמר כוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> בבדיקת מערכת שריר מבחנה </td><td> אורורה מדעית </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td> ליקה </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> מקור אור ACE </td><td> שוט-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מבתרים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מבתרים זווית </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> ידית אזמל </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 10003-12 </td><td> כלי לנתח חלופי </td></tr><tr><td> להבים מעוגלים אזמל # 12 </td><td> מדע פייןכלי עבודה </td><td> 10012-00 </td><td> כלי לנתח חלופי </td></tr><tr><td> מספרי עצם </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T תפר קשירת מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> דומון מלקחי אס - זוויתי </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> גודל תפר משי קלוע 6-0 </td><td> Teleflex רפואי </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> קלטת רפואית </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> קטמין הידרוכלוריד 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> מינון סופי הוא 80 מ&quot;ג / ק&quot;ג </td></tr><tr><td> הזרקת TranquiVed (xylazine 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> מינון סופי הוא 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג </td></tr><tr><td> ריאקטיבי כתום 14 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> אצבעות מרכיבי פתרון </td><td></td><td></td><td> פתרון הוא גז מתאזן עם 95% O 2 ו 5% CO 2, PH סופי 7.4 </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S7653 </td><td> ריכוז סופי: 118 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> P217-3 </td><td> ריכוז סופי: 4.7 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> dihydrate סידן כלוריד </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> C79-500 </td><td> ריכוז סופי: 2.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אשלגן זרח monobasic </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> P-285 </td><td> ריכוז סופי: 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט </td><td> JT בייקר </td><td> 2500-01 </td><td> ריכוז סופי: 0.57 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4 - (2-Hydroxyethyl) הצינורrazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP310-500 </td><td> ריכוז סופי: 5.95 גר &#39;/ ל&#39; </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G8270 </td><td> ריכוז סופי: 5.5 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

קריטי להערכה של תרופות פוטנציאליות למחלת שרירים הם הערכות פיסיולוגיות רגישות ולשעתק של תפקוד שרירים. בגלל ניסויים טרום קליניים רבים מסתמכים על מודלי עכבר למחלות אלה, תפקוד שרירים מבודד הפך לאחד את הסטנדרטים להחלטות Go / NoGo בהעברת סמי מועמדים קדימה לחולים. נדגים הכנת longus extensor digitorum (אדי) ושרירי סרעפת לבדיקות פונקציונליות, שהם השרירים הבולטים מנוצלים ללימודים אלה. גיאומטרית שריר האד היא אידיאלית להכנות שרירים מבודדות, עם שני גידים נגיש בקלות, וגודל קטן שיכול להיות נתמך על ידי superfusion באמבטיה. הסרעפת מציגה הפתולוגיה מתקדמת עמוקה בחי dystrophic, ויכולה לשמש כפלטפורמה להערכת טיפולים פוטנציאליים רבים מאבק בסיסטיק, וקידום יציבות myofiber. פרוטוקולים לבדיקה שגרתית, כולל איזומטרי וeccenהתכווצויות tric, יוצגו. כוח איזומטרי מספק הערכה של כוח, והתכווצויות אקסצנטריות לעזור להעריך יציבות sarcolemma, ששבשה בסוגים רבים של ניוון שרירים. השוואות של התוצאות הצפויות בין שרירים משרירי wildtype וdystrophic גם תהיינה מסופקת. אמצעים אלה יכולים להשלים מדידות מורפולוגיות וביוכימיים של הומאוסטזיס רקמות, כמו גם הערכות של בעלי חיים שלמות של תפקוד שרירים.

ערכים צפויים לכוחות איזומטרי של שרירי edl מ 12 בעלי חיים בשבוע ישנים שמוצגים באיור 1. משום ששרירים של MDX מפגינים גידול יתר, כוח tetanic סך הכל יכול להיות גבוה יותר בהשוואה לשריר MDX גיל פקדי wildtype מתאימים. עם זאת, מדד מתאים יותר מתפוקה הפונקציונלית הוא כוח ספציפי (איור 2), שבו כוח מנורמל לשטח חתך כדי לחשב את הערך הזה. כוח ספציפי תלוי ביכולת העצמית התפקודית של השרירים, שבו החולשה בשרירי dystrophic היא ברורה יותר כשהן בכוח מוחלט ושטח חתך צלב מטופלות. בידות שלנו, שרירי edl מ עכברי MDX להפיק כ 20 - כוחות ייחודיים 25% נמוכים יותר מאלה של גיל המתאימים עכברי wildtype 10-26 שבועות של גיל. לסרעפת, כוח ספציפי רק הוא רלוונטי להשוואות, כי ההכנה היא פיסה של השריר תלויה dissection. השוואה של כוח ספציפי בין שרירי סרעפת MDX wildtype ומשקפת את הפתולוגיה המתקדמת ברקמה זו. תפוקת הכח איזומטרי פוחתת עם גיל (איור 3), כך שעד הגיל 6 חודשים, שרירי סרעפת מעכברי MDX לייצר לא יותר מחצי מהתפוקה התפקודית של רצועות סרעפת מגיל מתאים פקדי wildtype. דוגמה להתכווצויות אקסצנטריות מבדיקות סרעפת מוצגת באיור 4. עם כל כיווץ אקסצנטרי שלאחר מכן, תפוקת כוח פוחתת ברצועות סרעפת משני wildtype (עכברי C57) ועכברי MDX. עם זאת, אובדן הכח הוא דרמטי יותר בדגימות שריר מעכבר MDX, ככל הנראה מהעדר הדיסטרופין והחלבונים הקשורים אליו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> איור 1. כוח tetanic איזומטרי בwildtype ו f שרירי אדי MDX<html> 12 עכברים זקנים בשבוע ROM. כוח מוחלט יכול להיות גבוה יותר בשרירי הגיל מתאים-MDX אד בשל גידול יתר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> איור 2. כוח tetanic איזומטרי נירמול של אזור חתך צלב שרירים הוא כוח סגולי, ומגלה יכולת תפקודית של שרירי אדי מדוכא מעכברי MDX בהשוואה לאלו של עכברי wildtype. עקבות הן מאותם עכברים כמו באיור 1. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> איור 3. האובדן ההדרגתי של יכולת יצירת כוח מוערך על ידי כוח מסוים הוא בולט ביותר בסרעפת של עכברי MDX (קווים אדומים) בהשוואה לwildtype (עכברי C57 בקו כחול). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4. אובדן הכח כפונקציה של מספר כיווץ אקסצנטרי לשרירי סרעפת מ 12 שבוע ישן עכברים C57 ועכברי MDX. נתוני ממוצע ± SEM עבור N = 4 שרירים לגנוטיפ.

Watch this Scientific Journal Video about Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies at JoVE.com

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכה של השרירים רפויים פוטנציאלי לפתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. נדגים הכנת longus extensor digitorum שרירי סרעפת ובדיקה פונקציונלית. יוצגו פרוטוקולים להתכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, כמו גם הבדלים בתוצאות בין שרירי dystrophic, המייצגים מצב פתולוגי, ושרירי wildtype.

הערכת דור חיל איזומטרי והאקסצנטרית של שרירי שלד מבודד ממודלים עכבריים של ניוון שרירים

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

32.6K Views.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכה של השרירים רפויים פוטנציאלי לפתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. נדגים הכנת longus extensor digitorum שרירי סרעפת ובדיקה פונקציונלית. יוצגו פרוטוקולים להתכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, כמו גם הבדלים בתוצאות בין...

Video: Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...