מחקר זה נתמך על ידי מענקים לYMS מהמכונים הלאומי לבריאות (CA148828), האוניברסיטה של ​​מרכז מישיגן העיכול פפטיד, ומחקר ג&#39;פרי א קולבי סרטן מעי גס ואת קרנות טום יו הזיכרון של המרכז לסרטן של אוניברסיטת מישיגן.

1. בידוד גידול במעי גס ודיסוציאציה הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול להיות מבודד מכל גידולים במעי מודל סרטן מעי גס או ספורדי מושרה טיפול. העכברים צריכים להיות מורדמים עם CO 2. נקודתיים נאספות אז, סמוקות קר מלוח פוספט שנאגרו (PBS) ונפתחו longitudinally. זהה את האזורים המכילים גידולים תוך שימוש בסטראו, לנתח עם זוג מספריים, ולשטוף עם PBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שברי מעיים המכילים גידולים במאגר קלאציה EDTA (2 מ&quot;מ EDTA, 5.6 mmol / L Na 2 HPO 4, 8.0 mmol / L KH 2 PO 4, 96.2 mmol / L NaCl, 1.6 mmol / L KCl, סוכרוז 43.4 mmol / L, 54.9 mmol / L-D סורביטול, 0.5 mmol / L DL-dithiothreitol במים מזוקקים) למשך 60 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כלצים, רוב תאי אפיתל במעי הנורמלי יהיה מנותק, ואילו תאים סרטניים יישארו מחוברים לmesenchyme. לשאוב את חיץ קלאציה המכיל תאי אפיתל נורמליםולשטוף את גידול השריד שברים עוד פעם אחת עם 5 חיץ קלאציה קר מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חיץ קלאציה, לשטוף ברים סרטניים עם 5 מ&quot;ל הקר 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את PBS 1X, דגירה ברים סרטניים בחיץ עיכול (2.5% בסרום שור עוברי, יחידה / 1 מ&quot;ל של פניצילין, מיקרוגרם / 1 מ&quot;ל של סטרפטומיצין, ו -2.5 ng / ml של amphotericin B, 200 U / מיליליטר הסוג IV collagenase, 125 מיקרוגרם / מיליליטר הסוג II dispase בשינוי הנשר בינוני של Dulbecco) במשך שעה 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר שבר הגידול להתיישב תחת כובד נורמלי דקות 1, ולאסוף את supernatant בצינור פלקון 15 מ&quot;ל. גלולה supernatant ההשעיה גידול התא הבודד על ידי centrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות ולשטוף פעם עם 5 מ&quot;ל PBS על ידי centrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות. </li></ol> 2. תרבות של גידול מעיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה גידול עם 500 PBS μl, לספור תאים סרטניים בודדים מבודדים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים סרטניים גלולה ידי סנטrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות, וresuspend אותם 5 מ&quot;ג / מיליליטר Matrigel על קרח וצלחת ב24 גם צלחות ב15,000 תאים לכל 50 μl של Matrigel בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו Matrigel פלמר במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף 500 מדיום תרבות μl / גם בסיס (יחידת 1 / מ&quot;ל ​​של פניצילין, מיקרוגרם / 1 מ&quot;ל של סטרפטומיצין, ו -2.5 ng / ml של amphotericin B, 10 HEPES mmol / L , 2 המ&quot;מ Glutamax, תוסף N2 1x, 1x תוסף B27, mmol / L N-acetylcysteine ​​1 בנשר Medium/F12 השינוי של מתקדם Dulbecco) המכיל 50 ng / EGF עכברי מ&quot;ל. </li></ol> 3. תחזוקה של Organoids הוקם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התרבות בינונית בסיסית המכילים EGF כל 2 ימים והמעבר organoids 01:05 פעם בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לpassaging, החלף את מדיום התרבות עם התרבות בינונית בסיסית טריות. מכאני לשבש organoids וMatrigel באמצעות פיפטה P1000 עם טיפים נותקו ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מ&quot;ל. ניתוק מכאני נוסף מושגת באמצעות אש מלוטש פסטר צינורטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף organoids ניתק עם 5 מ&quot;ל של מדיום התרבות הבסיסית וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend את הכדור עם Matrigel ולהוסיף מדיום התרבות כפי שתואר לעיל. </li></ol> 4. אחסון ושחזור של Organoids הוקם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אחסון לטווח ארוך, להקפיא organoids בנוזל N 2 שהם יציבים במשך לפחות 2 שנים. לorganoids המקפיא, לשבש באמצעות פיפטה P1000 עם הטיפים לחתוך ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף organoids ניתק עם 5 מ&quot;ל של מדיום התרבות הבסיסית וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend את הכדור עם השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 20% בסרום שור העובר (FBS) ו -10% sulfoxide דימתיל (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים להעביר לתוך 1.5 cryotubes מ&quot;ל, ואז לשים את הצינורות במכל Nalgene מר פרוסטי מקפיא ולאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס כדי להשיג קצב קירורשל -1 מעלות צלזיוס / דקה. לאחר דגירה הלילה, להעביר צינורות לנוזל N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאוששות, organoids הקפוא מופשר במהירות ב37 מעלות צלזיוס במים אמבטיה, לשטוף עם מדיום התרבות בסיסי, ספין למטה, resuspend בMatrigel והתרבות בתנאים שתוארו לעיל. </li></ol> 5. RNA מיצוי, מיצוי חלבון ואימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA הפקה: תאים נאספים כמתואר לעיל למעבר. רנ&quot;א הוא מבודד עם PicoPure TM-RNA בידוד ערכה לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיצוי חלבון: כדורי תא נאספים כמתואר לעיל וlysed במאגר 100 assay radioimmunoprecipitation μl (Ripa; 50 mmol / L טריס-HCl pH 7.5, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA, 1% NP-40, 0.1 % SDS) עם מעכב פרוטאז 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימונוהיסטוכימיה: לשאוב את מדיום תרבות תא, להעביר organoids הסרטניים עם P1000 פיפטה עם טיפים נחתכו לCryo-עובש ולהקפיא באופן מיידי בTISלתבוע את מדיום הקפאה (אוקטובר) עם קרח יבש. חלקים קפואים נחתכו ב -7 מיקרומטר ומוכתם כפי שתוארו לעיל 26. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Creamer, B., Shorter, R. G., Bamforth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+turnover+and+shedding+of+epithelial+cells.+I.+The+turnover+in+the+gastro-intestinal+tract.">The turnover and shedding of epithelial cells. I. The turnover in the gastro-intestinal tract.</a> Gut. 2, 110-118 (1961).</li><li>Crosnier, C., Stamataki, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+cell+renewal+in+the+intestine:+stem+cells,+signals+and+combinatorial+control.">Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control.</a> Nat. Rev. Genet. 7, 349-359 (2006).</li><li>Medema, J. P., Vermeulen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+stem+cells+in+intestinal+homeostasis+and+cancer.">Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer.</a> Nature. 474, 318-326 (2011).</li><li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4.">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li><li>Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signals+are+essential+for+homeostasis+of+the+intestinal+epithelium.">Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium.</a> Genes Dev. 17, 1709-1713 (2003).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenic+influence+of+human+R-spondin1+on+the+intestinal+epithelium.">Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium.</a> Science. 309, 1256-1259 (2005).</li><li>Reya, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+stem+cells+and+cancer.">Wnt signalling in stem cells and cancer.</a> Nature. 434, 843-850 (2005).</li><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2012.">Cancer statistics, 2012.</a> CA Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).</li><li>Sesink, A. L., Termont, D. S., Kleibeuker, J. H., Vander Meer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+meat+and+colon+cancer:+the+cytotoxic+and+hyperproliferative+effects+of+dietary+heme.">Red meat and colon cancer: the cytotoxic and hyperproliferative effects of dietary heme.</a> Cancer Res. 59, 5704-5709 (1999).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 479-507 (2011).</li><li>Nishisho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+chromosome+5q21+genes+in+FAP+and+colorectal+cancer+patients.">Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients.</a> Science. 253, 665-669 (1991).</li><li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor-2alpha+activation+promotes+colorectal+cancer+progression+by+dysregulating+iron+homeostasis.">Hypoxia-inducible factor-2alpha activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis.</a> Cancer Res. 72, 2285-2293 (2012).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+AXIN2+cause+colorectal+cancer+with+defective+mismatch+repair+by+activating+beta-catenin/TCF+signalling.">Mutations in AXIN2 cause colorectal cancer with defective mismatch repair by activating beta-catenin/TCF signalling.</a> Nat. Genet. 26, 146-147 (2000).</li><li>Morin, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+beta-catenin-Tcf+signaling+in+colon+cancer+by+mutations+in+beta-catenin+or+APC.">Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC.</a> Science. 275, 1787-1790 (1997).</li><li>Brattain, M. G., Fine, W. D., Khaled, F. M., Thompson, J., Brattain, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+malignant+cells+from+a+human+colonic+carcinoma.">Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma.</a> Cancer Res. 41, 1751-1756 (1981).</li><li>Leibovitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+human+colorectal+adenocarcinoma+cell+lines.">Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Res. 36, 4562-4569 (1976).</li><li>Willson, J. K., Bittner, G. N., Oberley, T. D., Meisner, L. F., Weese, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+human+colon+adenomas+and+carcinomas.">Cell culture of human colon adenomas and carcinomas.</a> Cancer Res. 47, 2704-2713 (1987).</li><li>Brattain, M. G., Strobel-Stevens, J., Fine, D., Webb, M., Sarrif, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+mouse+colonic+carcinoma+cell+lines+with+different+metastatic+properties.">Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties.</a> Cancer Res. 40, 2142-2146 (1980).</li><li>Ikubo, A., Aoki, Y., Nagai, E., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+metastatic+variant+of+a+mouse+colon+carcinoma+cell+line,+LM17+and+its+response+to+GM-CSF+gene+therapy.">Highly metastatic variant of a mouse colon carcinoma cell line, LM17 and its response to GM-CSF gene therapy.</a> Clin. Exp. Metastasis. 17, 849-855 (1999).</li><li>Basant, S. K., Rinesh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+Of+Animal+Cell+Culture.">Principles Of Animal Cell Culture.</a> Student Compendium. Textbook Student Edition. 6, 61-96 (2008).</li><li>Vachon, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+state-selective+roles+of+p38+isoforms+in+human+intestinal+epithelial+cell+anoikis.">Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis.</a> Gastroenterology. 123, 1980-1991 (2002).</li><li>Darido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+claudin-7+regulation+by+Tcf-4+and+Sox-9+disrupts+the+polarity+and+increases+the+tumorigenicity+of+colorectal+cancer+cells.">Defective claudin-7 regulation by Tcf-4 and Sox-9 disrupts the polarity and increases the tumorigenicity of colorectal cancer cells.</a> Cancer Res. 68, 4258-4268 (2008).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+colon+epithelium+expanded+in+vitro+from+a+single+adult+Lgr5(+)+stem+cell.">Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell.</a> Nat. Med. 18, 618-623 (2012).</li><li>Anderson, E. R., Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+hypoxia-inducible+factor-2alpha+(HIF-2alpha)+is+critical+for+efficient+erythropoiesis.">Intestinal hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) is critical for efficient erythropoiesis.</a> J. Biol. Chem. 286, 19533-19540 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Kondo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retaining+cell-cell+contact+enables+preparation+and+culture+of+spheroids+composed+of+pure+primary+cancer+cells+from+colorectal+cancer.">Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 6235-6240 (2011).</li><li>Clevers, H., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+and+disease.">Wnt/beta-catenin signaling and disease.</a> Cell. 149, 1192-1205 (2012).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

הפרוצדורות שתוארו בפרוטוקול זה תאפשר לבידוד והתרבות של גידולים במעי גס עכבריים ראשוניים. הפרוטוקול מותאם מעבודת הזרע נעשתה על ידי ד&quot;ר קבוצת Clevers 1,24,27. אנו מותאמים זמן העיכול וריכוז collagenase לקבל תשואה טובה יותר של organoids הסרטניים. השלבים הקריטיים כוללים עיכול תאים סרטני לתאים בודדים, resuspension Matrigel, ותרבות סלקטיבית. לעיכול של תאי גידול, על מנת לקבל ניתוק יעיל של גידולים במעי גס ולשמור על יכולת הקיום שלהם, את מערכת העיכול והריכוז של collagenase צריכים להיגזר באופן אמפירי ומותאמים. לדוגמה, כאשר משתמשים בcollagenase 75 זמן U / מ&quot;ל ​​ו דגירה של 30 דקות, אנחנו לא קבלנו השעיות תא סרטניים בודדות ואין organoids נוצרו תחת מצב זה בידיים שלנו. שמירה על קשר תאי תאים הוא דיווחה להיות קריטי לתאים סרטניים culturing 28, הנה בעת שימוש בcollagenase 300 U / מ&quot;ל ואינקובטוריםזמן n של שעות, זיהום תאי סטרומה 3 הוא ציין גם. באופן דומה, resuspension Matrigel, הריכוז, וזמן התמצקות צריכים גם להיקבע באופן אמפירי. את organoids לאפשר הערכה מדויקת של אפיתל הגידול. את organoids הוקם מגידולים במעי מסוגל תרבות לטווח הארוך. יש לנו להשתמש בקלות organoids הוקם לכמה חודשים, ללא הבדלים ניכר בריבוי והתמיינות. Organoid הוקם ניתן להשפיע מבחינה גנטית למציאה וביטוי יתר. יתר על כן, יכול להיות שנוצר בorganoids הסרטניים מדגימות ביופסיה סרטניים אנושיות, ולכן טכניקת culturing יכולה לשמש כדי לחקור את המנגנון בסיסי באופן ספציפי מטופל. מסלול Wnt הוא קריטי להתפתחות עוברית מעיים. במעי מבוגר Wnts הם קריטי לשגשוג של תאים הנורמלי מעבר-הגברה וdysregulation של מסלול Wnt הוא קריטי לגידול במעי גס 29. סלקטיבי התרבות wiה EGF מספיק לשמירה על צמיחת organoid גידול במעי גס. עם זאת, כאשר השלים עם Wnt3a, את organoids לגדול ביעילות רבה יותר. לכן, התאים מגיבים לצמיחת קידום השפעות של ligands Wnt, שלא כמו כמה שורות תאים שמקורם במעי גס. את organoids לחקות באופן הדוק יותר מאשר קווי אפיתל המעיים סרטן מעי גס שנקבעו נגזרים, ואנחנו מאמינים שנספק נתונים מדויקים יותר ורלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. כפי שתואר לעיל, הטכניקה זו שימושית לחקר מנגנוני הייזום והתקדמות לסרטן מעי גס. גם את organoids הסרטניים יספק נתונים מדויקים יותר בעת הערכת היעילות הטיפולית של טיפולים בסרטן מעי גס.

תאי אפיתל במעי להתרבות ולהתהפך בקצב בלתי רגיל, outpacing כל רקמות אחרות בגוף חוליות 2,3. את התאים המתחלקים, כולל תאי גזע מעיים (ISC) ותאי מעבר-הגברה להתמיין גם הפרשה (גביע, פנט וenteroendocrine) תאים או enterocytes 3. ISC ממוקם בבסיס קריפטה. תאי פנט לרדת לעומקו של מאורות והם האריכו ימים, ואילו משפחות אחרות להעביר כלפי מעלה לסיסים 3,4. כאן התאים נחשפים לתוכן המעיים, כולל חיידקים ולשפוך מהקצוות סיסי באמצעות מנגנון אפופטוטיים-Induced anoikis. אמנם חסר סיסי המעי הגס ותאי פנט, המנגנון לשמירה על הומאוסטזיס דומה 4. מסלול איתות Wnt היה מעורב במשחק תפקיד מכריע בהתפשטות מעיים וISC תחזוקה 4. מחיקה של הדואר גורם שעתוק TCF4, מפעיל במורד הזרם של איתות Wnt, מוביל לאובדן של תאי גזע במעי ולאחר מכן פירוק של הרקמה 5. בדומה לכך, ביטוי מהונדס של DKK1 מעכבי Wnt מפחית את התפשטות אפיתל וכלה את שושלות תאי הפרשה 6. לעומת זאת, ביטוי יתר של אגוניסט Wnt R-spondin-1 פרוליפרציה חזקה ומהירה של תאי הקריפטה מעיים 7. לאור החשיבות של איתות Wnt להומאוסטזיס מעיים, מוטציות מסלול Wnt הם נצפו לעתים קרובות בסרטן מעי גס 8. סרטן המעי הגס הוא הגורם שלישי למוות מהסרטן בארצות הברית 9. הצריכה תזונתית עודפת עם בשר אדום ואלכוהול, פעילות גופנית מופחתת, ועוברת בירושה ומוטציות סומטיות נחשבות לגורמי סיכון לסרטן מעי גס 10,11. Coli (APC) גן polyposis adenomatous, גורם איתות Wnt מפתח, הוא מוטציה ברוב של הרשות הפלסטיניתtients עם משפחתי, סדיר, וסרטן מעי גס קוליטיס הקשורים 12,13. מוטציות של גורמים אחרים שהיו מעורבים במסלול איתות Wnt כולל Axin2 וβ-catenin הם נצפו גם בסרטן מעי גס 14,15. עם זאת, המנגנון המדויק והטיפול יעיל לטיפול בסרטן המעי הגס הם עדיין חסרים. כדי להקל על החקירה של המנגנונים המולקולריים לסרטן מעי גס, שורות תאי סרטן מעי גס אנושיות המייצגות את השלבים השונים של התקדמות הסרטן שונים משפיר לסוג תא אגרסיבי כבר הוקם 16-18. שורות תאי סרטן מעי גס גרורתי עכבר עם מאפיינים שונים זמינות גם 19,20. עם זאת, תאים ראשוניים או תרבויות organoid עדיפים על שורות תאים שינו כי הם מחקים באופן הדוק במצב vivo ולייצר יותר רלוונטית מבחינה פיזיולוגית נתונים 21. רוב שורות תאים שמקורם מעי גס, סרטן לגדול כmonolayer מחוברת לצלחת או כהשעיות תא, lackinגרם של נטייה הפסגה-basolateral והדוקים צמתים בין תאים. כמו כן, תאי אפיתל במעי רגילים וגידול in vivo לעבור צורה ספונטנית של anoikis מכונה אפופטוזיס כמו התאים המובחנים להגיע לטיפים והסיסיים הם לשפוך 22. תכונות אלה קשה לסכם בשורות תאים, אבל הם חשובים בתהליך ההתפתחות של סרטן מעי גס 23. תכונות אלה נשמרות בorganoids הראשוני. בנוסף, תרבויות organoid הסרטניים לספק מערכת יעילה להערכת תפקודים אוטונומיים של גנים סרטניים בהשוואה במחקרי vivo. מניפולציה גנטית in vivo של המעי היא תהליך גוזל זמן בעיקר באמצעות יצירת מהונדס ו / או עכברים בנוקאאוט באמצעות נהגי מעי ספציפיים. עם זאת, את organoids הסרטניים הם בקלות נוחה למניפולציות גנטיות נגיפיות בתיווך ובכך כלי נהדר להערכת מנגנונים מולקולריים מדויקים. תרבויות hav organoid סרטניים במעי העיקרידואר הוכח כטכניקה אפשרית ורבת עוצמה. תרבית תאי מעי העיקרית יכולה להקים organoids מעיים פונקציונלי עם קבר ובעל מבנה סיסים במבחנה ממבוגר יחיד Lgr5 + תאי גזע 24. ניתן להשתיל organoids אלה וengrafted לרקמת מעי פגום להתחדשות 25. הסתגלות נוספת של תנאי התרבות עשתה organoids אפיתל דומה ממעי גס ובמעי הדק עכבר אנושי ומעי גס אפשרי 1. לתרבות העיקרית נורמלית מעי גס האפיתל, מדיום התרבות בסיסית, כמו גם גורמי גדילה כולל EGF, Noggin, R-spondin וWnt3a הם חיוניים, ואילו מדיום התרבות בסיסי וEGF מספיק לגידול organoids גידול במעי עכבר העיקרי 1. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד, תרבות, וליצור organoids גידול במעי הגס.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>375 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>1.8 U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF), Murine, Natural</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53003-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>100 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-079</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPureTM RNA Isolation Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro organoid culture of primary mouse colon tumors

כמה שורות תאי סרטן מעי גס אנושיות ועכבריות כבר הוקמו, יושרה פיזיולוגית של גידולים במעי גס, כגון מספר שכבות של תאים הבזליים, קוטביות-apical, יכולת להבחין וanoikis אינה נשמרת בשורות תאים שמקורם בסרטן מעי גס. המחקר הנוכחי מדגים שיטה לorganoids culturing העיקרי עכבר הסרטניים במעי הגס המותאמים מסאטו T et al. 1, השומר על תכונות הפיזיולוגיות חשובות של גידולים במעי גס. שיטה זו מורכבת מאוסף עכבר מעי גס גידול רקמות, מעי גס הנורמלית הסמוכה האפיתל דיסוציאציה, מעי גס גידול עיכול תאים לתאים בודדים, הטבעת תאים סרטניים במעי הגס לmatrigel, והתרבות סלקטיבית המבוסס על העיקרון שתאים סרטניים לשמור על צמיחה בהגבלת תנאים תזונתיים בהשוואה למצב נורמלי תאי האפיתל. את organoids הגידול הראשוני אם בודדו מעכברים מהונדסים גנטי לספק מערכת שימושית מאוד להעריך funct אוטונומי גידוליון של גנים ספציפיים. יתר על כן, את organoids הסרטניים ניתן למניפולציה גנטית על ידי וירוס המדיטציה מסירת גן; מסלולי איתות ולכן מעורבים בגידול במעי הגס יכולים להיות גם נחקרו בהרחבה על ידי ביטוי יתר או מציאה. תרבות organoids גידול הראשונית מספקת אמצעי רלוונטי ואפשרי פיסיולוגיים ללמוד את המנגנונים ושיטות טיפוליות לגידול במעי גס.

מהלך הזמן של היווצרות organoid גידול במעי גס מדקות APC בן שלושת חודשים / + עכבר מוצג באיור 1. ביום 0, תאים בודדים יכולים להיבחן כמה שעות לאחר ציפוי (איור 1 א). ליום 1 ביום, שרדו תאי האפיתל גידול במעי הגס עם גרעינים עקשן יכול להיבחן. ביום 3, בגודל של תאים הוכפל. בשעה 6 ביום, בגודל של יותר מ organoid התרחב פי עשר והראה סימנים של אפופטוזיס באמצע. ביום 14, את orgnoids יגדל לתוך תאים חריגים (איור 1). כאן היו לנו 39.33 ± 22.05 organoids / בנוי היטב, בתנאי העיכול של collagenase 200 U / מ&quot;ל לשעה 2, בהשוואה לשום organoids נוצר בתנאי העיכול של collagenase 75 U / מ&quot;ל למשך 30 דקות במחקר זה (איור 1 ג). להראות מודל תרבות organoid זה יכול לשמש למחקר פונקציונלי, מכתים immunofluorescent של β-קייט<html> נין, מרכיב בלתי נפרד למסלול איתות Wnt מוצג באיור 2. התאים המוכתמים החיוביים עבור β-catenin נמצאים בשכבות מתוך organoid, אשר אישר את דפוס גדילה עם לומן מרכזי שהוצע על ידי הקבוצה &#39;ד&quot;ר Clevers 24. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50210/50210fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50210/50210fig1.jpg" /> איור 1. היווצרות organoid נציג נובעת מגידול במעי גס שנלקח מ/ + עכבר דקות APC בן שלושת חודשים הייתה לתרבית () 0, 1, 3, 6 ו (ב) 14 ימים מוצגים. (ג) השיעור המוצלח של היווצרות organoid תחת שני תנאי עיכול collagenase שונים. 50210fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50210/50210fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. מכתים Immunofluorescent של β-catenin לorganoids הנגזר מגידול במעי גס שנלקח מדקות APC בן שלושת חודשים / + עכבר מוצג. 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) שימש להכתים גרעינים.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors at JoVE.com

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

שיטה פשוטה להקמת organoid גידול במעי העכברי העיקרי מתוארת. שיטה זו מנצלת את התכונה שתאים סרטניים במעי הגס לשרוד ולגדול לתוך organoids בתקשורת המכילות גורמי צמיחה מוגבלים, ואילו מעי גס נורמלי אפיתל לא.

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

in-vitro-organoid-culture-of-primary-mouse-colon-tumors

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

34.9K Views.  University of Michigan. שיטה פשוטה להקמת organoid גידול במעי העכברי העיקרי מתוארת. שיטה זו מנצלת את התכונה שתאים סרטניים במעי הגס לשרוד ולגדול לתוך organoids בתקשורת המכילות גורמי צמיחה מוגבלים, ואילו מעי גס נורמלי אפיתל לא.

Video: In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

תרבות explant עור אגרוף ביופסיה לגזירה של fibroblasts אדם היסודי

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo טיפול תגובה של גידולים ראשוניים ו / או הקשורים גרורות לפרה קלינית וקליני של Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite of these eccentric hamstring actions are concentric quadriceps actions, where the larger and likely stronger quadriceps straighten the knee. Therefore, to stabilize the lower limbs during movement, the hamstrings must eccentrically combat against the strong knee-straightening torque of the quadriceps. As such, eccentric hamstring strength expressed relative to concentric quadricep strength is commonly referred to as the &#34;functional ratio&#34; as most movements in sports require simultaneous concentric knee extension and eccentric knee flexion. To increase the strength, resiliency, and functional performance of the hamstrings, it is necessary to test and train the hamstrings at different eccentric speeds. The main purpose of this work is to provide instructions for measuring and interpreting eccentric hamstring strength. Techniques for measuring the functional ratio using isokinetic dynamometry are provided and sample data will be compared. Additionally, we briefly describe how to address hamstring strength deficiencies or unilateral strength differences using exercises that specifically focus on increasing eccentric hamstring strength.

The hamstrings are a group of muscles that are sometimes problematic for athletes, resulting in soft tissue injury in the lower limbs. To prevent such injuries, functional training of the hamstrings requires intensive eccentric contractions. Additionally, hamstring function should be tested in relation to quadricep function at different contraction speeds.

איזון שרירים: בדיקות והדרכה כוח שריר הירך אקסצנטרי פונקציונלי באוכלוסיות אתלטי

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still in need. In recent years, mass spectrometry has become a method of choice for untargeted profiling of discriminatory compound as potential biomarkers of a disease. Biofluids are generally considered as preferable matrices given their accessibility and easier sample processing while direct tissue profiling provides more selective information about a given cancer. Preparation of tissues for the analysis via traditional methods is much more complex and time-consuming, and, therefore, not suitable for fast on-site analysis. The current work presents a protocol combining sample preparation and extraction of small molecules on-site, immediately after tumor resection. The sampling device, which is of the size of an acupuncture needle, can be inserted directly into the tissue and then transported to the nearby laboratory for instrumental analysis. The results of metabolomics and lipidomics analyses demonstrate the capability of the approach for the establishment of phenotypes of tumors related to the histological origin of the tumor, malignancy, and genetic mutations, as well as for the selection of discriminating compounds or potential biomarkers. The non-destructive nature of the technique permits subsequent performance of routinely used tests e.g., histological tests, on the same samples used for SPME analysis, thus enabling attainment of more comprehensive information to support personalized diagnostics.

The manuscript presents on-site sampling of human brain tumors with solid phase microextraction followed by their biochemical profiling towards the discovery of biomarkers.

באתר דגימה וחילוץ של גידולים במוח עבור מטבולומיקה וניתוח Lipidomics

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...