אנו רוצים להודות לכל עמיתינו שספקו עזרה, יעוץ וקלט קריטי בשלבים שונים של פרויקט זה. הפקה של מאמר וידאו זה הייתה נתמך בכספים IMIDIA <a href="http://www.imidia.org" target="_blank">(http://www.imidia.org),</a> המשרד הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF) למרכז הגרמני לחקר סוכרת (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de" target="_blank">http://www.dzd Ev.de-)</a> ובית החולים האוניברסיטאי בקרל גוסטב Carus באוניברסיטה הטכנולוגית של דרזדן. העבודה שהובילה לפרסום זה קבלה תמיכה מהתחייבות היוזמה המשותפת החדשנית התרופות תחת הסכם מענק n ° 155005 (IMIDIA), משאבים של אשר מורכבים של תרומה כספית מהתכנית השביעית של האיחוד האירופי Framework (FP7/2007-2013) וEFPIA חברות &#39;בתרומה נדיבה.

1. הקפאת רקמת לבלב אנושית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רקמת שומן, כלי דם, עצבים ורקמות שאינן parenchymal עם איזמל ופינצטה, ולחתוך את רקמת הלבלב לחתיכות (~ 0.5-1 קוביות סנטימטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חתיכת רקמת לבלב אחד במרכז Cryomold, ומכסה אותו לחלוטין עם מתחם קר רקמות-Tek אוקטובר שים Cryomold לתוך צנצנת שתחתיתו מכוסית ב2-Methylbutane מראש מקוררים ונצמדת הקפאה בחנקן נוזלי. אחסן מדגם הקפוא ב-80 ° C. </li></ol> 2. הכנת סעיפים קפואים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלבש כפפות לאורך כל הצעדים כדי למנוע denaturation של רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את סכין cryostat, בעל דגימה ומכחול עם אתנול קר 100% וRNase Away. הנח את הרקמה קפואה בתוך cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד הרקמות, הסכין והמברשת להגיע -20 ° C. תייג SuperFrost פלוס שקופיות ומראש להתקרר בתוך חדר cryostat בזמן ההמתנהלרקמה להגיע -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתחם רקמות-Tek אוקטובר על בעל הדגימה ולמקם את הרקמה קפואה על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמתחם אוקטובר רקמות-Tek הקפוא לקצץ cryoblock ולהסיר כל עודף של רקמות Tek מתחם אוקטובר בסכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כולל של 40 10 פרוסות מיקרומטר רצופות מגוש רקמת הלבלב. בנוסף אנו ממליצים לחתוך פרוסה ראשונה ואמצע ונשמר לציורי סקירה של סעיף הלבלב שיכול להקל על זיהוי של איונים בתוך הפרוסות במהלך תהליך microdissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת החלקים מלהב הסכין למרכז SuperFrost פלוס שקופית על ידי נגיעת הישבן של השקופית עם האצבע (מכוסה בכפפה) להתחמם רק באזור שאליו הסעיף, לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את סעיפי 1-2 דקות בתוך cryostat ב -20 ° C, אחרי שאתה מכניס אותם לשקופית תיבה מונחת על קרח יבש. אחסן את הסעיפיםב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, מנקה את להב הסכין עם נייר סופג ו100% אתנול קר. </li></ol> 3. התייבשות של מדורים קפואים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ריאגנטים: לשפוך 30 אתנול מוכן טרי 70%, מי 30 מ&quot;ל DEPC טופל, 100% אתנול 2x30 מ&quot;ל וקסילן 30 מ&quot;ל לתוך צינורות 50 מ&quot;ל Cellstar (פלקונס) מ&quot;ל; צינה ולשמור את כל החומרים כימיים (מלבד קסילן) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את מקום העבודה מתחת למכסת המנוע עם 100% אתנול וRNaseZAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 cryosections התהליך כדלקמן: לתקן באתנול 70% קרים כקרח למשך 30 שניות, לשטוף עם 5-6 מטבלים מהירים במים קרים כקרח DEPC טופלו, מייבש פעמים לדקות 1 באתנול 100% הקרח קר, דגירה במשך 4 דקות בקסילן בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס), ואוויר יבש במשך 3-5 דקות. חזור על שלב זה עם עוד זוג cryosections. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שתי cryosections מיובש גב אל גב לתוך צינור 50 מיליליטר Cellstar העטוף בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור ולחות. </li></ol> &lt;כיתת p = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Microdissection ליזר של תאי ביתא עם PALM Microbeam, Zeiss <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה מיקרוסקופ עם RNaseZAP ולעלות יתר הדבק בRoboMover. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ההגדרות הבאות: הגדרת מסנן 09 (עירור: 450-490 ננומטר, הפליטה&gt; 515 ננומטר), AutoLPC מצב, אנרגית ליזר 50%, מוקד ליזר 65%, מהירות ליזר 100%, מרחק 5 מיקרומטר בין יריות AutoLPC, מרחק 6 מיקרומטר לשורה, עובד גובה: -10100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שקף אחד לבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתר את תאי הבטא autofluorescent תחת הדמיה מיקרוסקופית (עדשת 5x או 10x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לעדשת 40X, בחר בתאים בטאו עם כלי הבחירה &quot;Freehand&quot; וmicrodissect באמצעות הליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם את הרקמה של ארבע cryosections המיובש לAdhesiveCap אחד. תגובה 1: את הזמן כדי לנתח את תאי הבטא של cryosection המיובש אחד לא צריך להיות יותר מ 10-20 דקות, כדי למנוע התייבשות של חלקי הרקמות אשר יגרום לכךRNA שפלה. תגובה 2: לוודא תהליך microdissection מוצלח על ידי בדיקה חזותית לאחר שעבר את השלב למחסום. </li></ol> 5. תמוגה של רקמות מועשרות תא בטא Microdissected <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את AdhesiveCap מRoboMover. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 חיץ Pipet μl חילוץ (XB, PicoPure רנ&quot;א בידוד הקיט, ארקטורוס) לתוך המכסה של AdhesiveCap ודגירתו במהופך על 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב10000 XG ולשים lysate בקרח יבש. לאחסן אותו ב-80 ° C עד מיצוי RNA הוא מבוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.) עד 5.) עם כל חלקים אחרים. </li></ol> 6. RNA חילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את כל 10 10 lysates μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בבידוד RNA על ידי העבודה בטמפרטורת חדר על פי הפרוטוקול של PicoPure רנ&quot;א בידוד הקיט, ארקטורוס, באמצעות הצפת חילוץ יחס 1:1 (XB) לאתנול 70% (כולל טיפול DNase). </li></ol> 7. רנ&quot;א ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 RNA μl לניתוח של איכות וכמות באמצעות 2100 Bioanalyser Agilent (PicoChip). הערכה כמותית נעשתה בהתייחסות לרנ&quot;א הסטנדרטי עמוס במקביל על השבב. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+single+cells+from+complex+tissues.">Laser capture microdissection of single cells from complex tissues.</a> Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).</li><li>Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection.">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li><li>B&#246;tticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Gr&#252;tzmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Islets+from+Partially+Pancreatectomized+Patients.">Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients.</a> J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).</li><li>Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+human+pancreatic+beta-cells+and+RNA+preparation+for+gene+expression+profiling.">Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).</li><li>Marselli, L., Thorne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+of+Purified+{beta}-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection.">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).</li><li>Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+human+islets+to+isolation+stress+and+the+effect+of+antioxidant+treatment.">Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment.</a> Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).</li><li>Abdelli, S., Ansite, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+stress+signaling+pathways+activated+during+human+islet+preparation+and+following+acute+cytokine+exposure.">Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure.</a> Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).</li><li>Negi, S., Jetha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+beta-cell+gene+expression+reveals+inflammatory+signaling+and+evidence+of+dedifferentiation+following+human+islet+isolation+and+culture.">Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture.</a> PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מתארים גישה אמינה לmicrodissection הליזר (LMD) של איי לבלב אנושיים מדגימה כירורגית. ובלבד שמיקרוסקופ LMD זמין, הליך זה יכול להיות מיושם בכל מוסד מחקר ביצוע pancreatectomies החלקי, וכך להגדיל את הגישה לחומר איון אנושי משני 2 חולי הסוכרת שאינם סוכרתיים וסוג. זה רלוונטי במיוחד לאור מיעוט pancreata הציע לבידוד איון. היבטי Favourable של LMD השוואה לבידוד איון על ידי עיכול collagenase הן הזמן המופחת בין explantation של הרקמה והעיבוד של האיים לרנ&quot;א 7 חילוץ, העשרת התאים בטאו 7, כמו גם הימנעות ממניפולציות מכאניות והאנזימטית קשות 8, 9,10, אשר יכול לשנות את פרופיל ביטוי הגנים. במקרה של חולים באופן חלקי pancreatectomized מידע קליני וחילוף חומרים יותר הוא בדרך כלל זמין יותר מאשר במקרה של איברתורמים. מצד השני, בידוד של איים על ידי תשואות פחות RNA LMD עם ערכים נמוכים רין בהשוואה לאלו שנצפו לאחר עיכול collagenase ואינו מספק איוני חיים ללימודים פונקציונליים. יתר על כן, מחלת הלבלב מובילה לניתוח עלולה להשפיע על פרופיל ביטוי האיון. הערכה מאוזנת של יתרונות וחסרונות אלו תהיה ניתנות להשגה באמצעות מחקרים השוואתיים בין מספר גדול של בידודי איון בוצע על ידי עיכול collagenase וLMD אחד מתורמי איברים או חולי pancreatectomized באופן חלקי, כמו אלה שהולכים על ביוזמה החדשנית לרפואת multicenter סוכרת (IMIDIA) במטרה &quot;שיפור תפקוד תא בטא וזיהוי של סמנים ביולוגיים לאבחון לניטור טיפול בסוכרת&quot; <a href="http://www.imidia.org" target="_blank">(http://www.imidia.org).</a>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 2-Methylbutane (isopentane) </td><td> רוט </td><td> 3927.1 </td><td></td></tr><tr><td> AdhesiveCap (אטום, 500 μl) </td><td> ZEISS </td><td> 415190-9201-000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellstar צינורות (50 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו 1 </td><td> 210 261 </td><td> עם חצאית תמיכה </td></tr><tr><td> Cellstar צינורות (50 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו 1 </td><td> 227.261 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> SIGMA </td><td> ד 5758 </td><td></td></tr><tr><td> קרח יבש </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אתנול מוחלט </td><td> VWR </td><td> 20821.310 </td><td></td></tr><tr><td> חנקן נוזלי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> לצייר מברשת </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PALM Microbeam </td><td> ZEISS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פיל-A-Way הטבעת תבניות (מקוצץ), 12 12 מ&quot;מ x </td><td> ProSciTech </td><td> RR12 </td><td> מ&quot;מ ראש העמוד פנימי 22x22, עומק 21 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ארקטורוס PicoPure קפוא רנ&quot;א בידוד קיט </td><td> אפלייד Biosystems </td><td> KIT 0204 </td><td></td></tr><tr><td> מהדק פלסטיק </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> תער </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNase-חופשי DNase סט </td><td> Qiagen </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseZAP </td><td> SIGMA </td><td> 2020 R </td><td></td></tr><tr><td> אזמל /להב כירורגים </td><td> טכנו חותך </td><td> 2800111 </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות מיקרוסקופ הידבקות Plus SuperFrost </td><td> Thermo Scientific </td><td> J1800AMNZ </td><td> 25x75x1.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מתחם רקמות-Tek אוקטובר </td><td> סאקורה </td><td> 4583 או 0807000022 </td><td></td></tr><tr><td> מלקט </td><td> BRAUN </td><td> BD168R </td><td></td></tr><tr><td> קסילן </td><td> VWR </td><td> 28975.291 </td><td></td></tr></table>

improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens

microdissection הליזר (LMD) הוא טכניקה המאפשרת ההתאוששות של תאים ורקמות שנבחרו מכמויות זעירות של parenchyma 1,2. התאים הגזורים יכולים לשמש למגוון רחב של חקירות, כגון מחקרי transcriptomic או proteomic, הערכה או ניתוח דנ&quot;א הכרומוזומלי 2,3. יישום מאתגר במיוחד של LMD הוא ניתוח transcriptome, אשר, בשל הרפיפות של רנ&quot;א 4, יכול להיות בולט במיוחד כאשר תאים גזורים מרקמות עשירות של RNases, כגון לבלב. פרוטוקול microdissection שמאפשר זיהוי ואיסוף מהיר של תאי היעד חיוני בהגדרה זו כדי לקצר את זמן הטיפול ברקמות וכתוצאה מכך, על מנת להבטיח שימור RNA. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת תאים בטאו בלבלב אנושי מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic 5. חתיכות קטנות של לבלב של ג כ 0.5-13 מ &#39;נחתכו מהשולים הבריאים המופיעים בדגימות לבלב resected, המשובצים ברקמות-Tek מתחם אוקטובר, הקפואים מייד ב2-Methylbutane מצונן, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שחתך. ארבעים קטעים סידוריים של עובי מיקרומטר 10 נחתכו בcryostat תחת -20 ° C הגדרה, הועברו באופן פרטני לשקופיות זכוכית, התייבשו בתוך cryostat ל1-2 דקות, ומאוחסנים ב-80 ° C. מייד לפני הליך microdissection הליזר, סעיפים תוקנו בקר כקרח, מוכן טרי אתנול 70% למשך 30 שניות, נשטפו על ידי 5-6 מטבלים במים קרים כקרח DEPC טופלו, ומיובש על ידי שתי incubations של דקה אחת ב100% קרים כקרח אתנול ואחריו קסילן (המשמש להתייבשות רקמות) עבור 4 דקות; חלקי רקמה היו אז אוויר יבשים לאחר מכן במשך 3-5 דקות. חשוב לציין, בכל הצעדים, למעט הדגירה בקסילן, בוצעו באמצעות ריאגנטים קרים כקרח - שינוי מעל 6 פרוטוקול שתואר לעיל. Utilization של ריאגנטים קרח קרים ביאה לעלייה בולטת של autofluorescence הפנימית של תאים בטאו, ואפשר זיהוי שלהם. לmicrodissection, ארבעה חלקים היו מיובשים בכל פעם: שתיים להציב לתוך צינור עטוף בנייר האלומיניום 50 מ&quot;ל, כדי להגן על הרקמות מפני רטיבות והלבנה; 2 נותרי microdissected באופן מיידי. הליך זה בוצע באמצעות מכשיר PALM Microbeam (Zeiss) העסקת לחץ הליזר האוטומטי catapulting מצב (AutoLPC). ההשלמה של תאי הבטא / נתיחת איון מהארבעה cryosections נדרש לא יותר מ40-60 דקות. תאים נאספו לAdhesiveCap אחד וlysed עם חיץ תמוגה 10 μl. כל דגימת RNA בודדה עבור ניתוח transcriptomic הושגה על ידי שילוב של 10 דגימות תאים microdissected, ואחרי מיצוי RNA באמצעות פיקו הטהור רנ&quot;א בידוד הקיט (ארקטורוס). פרוטוקול זה משפר autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל ההכרה וג המהיר והמדויקת שלהםollection. שיפור נוסף של הליך זה יכול לאפשר נתיחה של תאי הביתא phenotypically שונים, עם השלכות אפשריות להבנה טובה יותר של שינויים הקשורים בסוכרת מהסוג 2.

כפי שניתן לראות בתרשים 1, פרוטוקול dehydrating השונה הוביל לשיפור של תאי הבטא autofluorescence לעומת 6 הפרוטוקול שפורסם הקודם. יישום הפרוטוקול המתואר, כל אחד 39 דגימות לבלב ניתוחיות שמש ליצירת 40 cryosections סדרתי עבור ממוצע של דגימת רקמה / לבלב 31&#39;544&#39;704 מיקרומטר 3 (טווח: 8&#39;742&#39;390 - 81&#39;522&#39;153 מיקרומטר 3) כפי שמוצג בטבלה 1. זה מייצג את הנפח של כ 18 איי לבלב בקוטר 150 מיקרומטר, או של 35,000 β-תאים. הרקמה שמקורה בממוצע של 38 איים שונים / דגימת לבלב (טווח: 19-80 איים), כל אחד מהם נצפתה בדרך כלל בשניים או יותר מסעיפים ברציפות. השונות הגדולות בתשואה של איונים בין דגימות שונות משקפות את ההטרוגניות של רקמת המקור, או את הראש או זנב לבלב, כמו גם השיפור המתקדם למפעילים בזיהוייון של האיים בתוך זמן 10 דקות שהוקדש לבדיקה של כל מקטע. רנ&quot;א מוחלט מכל רקמת microdissected וlysed טוהר עם קיט ארקטורוס PicoPure הקפוא רנ&quot;א הבידוד של יישומים ומערכות ביולוגיות eluted ב11 μl, על פי הפרוטוקול של היצרן. לאחר מכן 1 RNA μl של כל מדגם נותח על ידי 2100 Bioanalyser Agilent. השגנו בממוצע 42 ng-RNA / דגימה (טווח: 5-229 ng / דגימה) עם מספר ממוצע רנ&quot;א יושרה (רין) של 5.8 (טווח: 3.4-7.2). תרשים 2 מציג דוגמה לניתוח רנ&quot;א. משנה איזה ערך רין כל דגימות RNA נתחו שמשו בהצלחה ללימודי transcriptomic. לא מצאו קשר ישיר בין כמות רקמת microdissected ותשואת רנ&quot;א. הבדלים במרווח הזמן בין הקצירה על ידי מנתחים ועל הקפאת דגימות הלבלב לאחר הבדיקה ושחרורו על ידי פתולוג יכולים להסביר בעמ<html> אמנות לאיכות והכמות המשתנות של רנ&quot;א התאושש. גורמים מרכזיים נוספים שיש לשקול הם אנרגית הליזר בקש microdissection, עם האנרגיה הנמוכה מניבה יושרת RNA הגבוהה יותר, כמו גם התמקדות בליזר ואת המרחק מנקודתי LPC. המוקד ממוקם באופן אידיאלי, כאשר &quot;השפעה&quot; קלה של הליזר על משטח הזכוכית של השקופית, ויוצרת נקודה שחורה קטנה, שניתן לראות. בידינו את התוצאות הטובות ביותר המושגות עם אנרגית ליזר של 50%, מוקד ליזר של 65%, אם כי הותאמה כדי לפצות על הבדלים בעובי של הסעיפים, ובמרחק של של 5 נקודתי LPC מיקרומטר. בנוסף, כמות הרנ&quot;א יכולה להיות מותאמת על ידי שמירה על גובה העבודה של RoboMover, כלומר את המרחק בין מכסה הדבק והסעיף, הנמוך ככל האפשר, כדי למנוע אובדן של רקמת microdissected במהלך התהליך הלכיד. עד הגובה עובד בקבוצה שלנו הוא ב-10,100 יחידות PALM שרירותיות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr>ll &quot;&gt; דגימה </td><td class="jove_content_small"> מספר האיונים / הדגימה </td><td class="jove_content_small"> נפח נאסף רקמה / דגימה [מיקרומטר 3] </td><td class="jove_content_small"> רין </td><td class="jove_content_small"> ריכוז [ng / μl] </td><td class="jove_content_small"> סך רנ&quot;א [ng] </td></tr><tr><td> DP002 </td><td> 34 </td><td> 24&#39;947&#39;696 </td><td> 5.2 </td><td> 1.149 </td><td> 10.34 </td></tr><tr><td> DP003 </td><td> 30 </td><td> 41&#39;141&#39;488 </td><td> 5.5 </td><td> 1.677 </td><td> 15.09 </td></tr><tr><td> DP005 </td><td> 23 </td><td> 27&#39;024&#39;264 </td><td> 3.5 </td><td> 8.259 </td><td> 66.07 </td></tr><tr><td> DP006 </td><td> 25 </td><td> 45&#39;900&#39;848 </td><td> 3.4 </td><td> 7.399 </td><td> 59.19 </td></tr><tr><td> DP007 </td> &lt;td&gt; 30 </td><td> 23&#39;936&#39;048 </td><td> 6.5 </td><td> 0.595 </td><td> 4.76 </td></tr><tr><td> DP008 </td><td> 22 </td><td> 68&#39;248&#39;432 </td><td> 6.2 </td><td> 1.559 </td><td> 14.03 </td></tr><tr><td> DP010 </td><td> 34 </td><td> 33&#39;156&#39;752 </td><td> 5.6 </td><td> 1.750 </td><td> 19.25 </td></tr><tr><td> DP011 </td><td> 29 </td><td> 31&#39;339&#39;152 </td><td> 6.0 </td><td> 1.365 </td><td> 15.02 </td></tr><tr><td> DP012 </td><td> 34 </td><td> 57&#39;594&#39;360 </td><td> 6.3 </td><td> 3.025 </td><td> 33.28 </td></tr><tr><td> DP017 </td><td> 35 </td><td> 28&#39;212&#39;256 </td><td> 6.0 </td><td> 1.292 </td><td> 14.21 </td></tr><tr><td> DP030 </td><td> 35 </td><td> 48&#39;007&#39;530 </td><td> 5.6 </td><td> 2.180 </td><td> 23.98 </td></tr><tr><td> DP013 </td><td> 36 </td><td> 34&#39;371&#39;045 </td><td> 6.9 </td><td> 1.350 </td><td> 14.85 </td></tr><tr><td> DP014 </td><td> 35 </td><td> 21&#39;360&#39;060 </td><td> 7.2 </td><td> 1.270 </td><td> 13.97 </td></tr><tr><td> DP015 </td><td> 33 </td><td> 20&#39;923&#39;488 </td><td> 4.1 </td><td> 4.000 </td><td> 44.00 </td></tr><tr><td> DP019 </td><td> 40 </td><td> 35&#39;431&#39;704 </td><td> 7.0 </td><td> 1.670 </td><td> 18.37 </td></tr><tr><td> DP025 </td><td> 19 </td><td> 15&#39;329&#39;844 </td><td> 6.6 </td><td> 0.496 </td><td> 5.46 </td></tr><tr><td> DP034 </td><td> 19 </td><td> 81&#39;522&#39;153 </td><td> 6.4 </td><td> 4.260 </td><td> 46.86 </td></tr><tr><td> DP039 </td><td> 32 </td><td> 19&#39;074&#39;410 </td><td> 6.5 </td><td> 1.270 </td><td> 13.97 </td></tr><tr><td> DP040 </td><td> 44 </td><td> 31&#39;565&#39;630 </td><td> 5.4 </td><td> 2.300 </td><td> 25.30 </td></tr><tr><td> DP042 </td><td> 52 </td><td> 40&#39;333&#39;840 </td><td> 7.0 </td><td> 2.510 </td&gt; <td> 27.61 </td></tr><tr><td> DP021 </td><td> 65 </td><td> 33&#39;996&#39;260 </td><td> 6.3 </td><td> 2.830 </td><td> 31.13 </td></tr><tr><td> DP023 </td><td> 19 </td><td> 19&#39;513&#39;310 </td><td> 5.6 </td><td> 8.250 </td><td> 90.75 </td></tr><tr><td> DP024 </td><td> 32 </td><td> 24&#39;125&#39;140 </td><td> 6.3 </td><td> 20.780 </td><td> 228.58 </td></tr><tr><td> DP038 </td><td> 23 </td><td> 18&#39;306&#39;040 </td><td> 6.6 </td><td> 11.700 </td><td> 128.70 </td></tr><tr><td> DP045 </td><td> 35 </td><td> 36&#39;345&#39;620 </td><td> 6.3 </td><td> 1.100 </td><td> 12.10 </td></tr><tr><td> DP033 </td><td> 42 </td><td> 26&#39;078&#39;550 </td><td> 6.5 </td><td> 15.380 </td><td> 169.18 </td></tr><tr><td> DP022 </td><td> 49 </td><td> 33&#39;535&#39;460 </td><td> 6.8 </td><td> 7.590 </td><td> 83.49 </td></tr><tr><td> DP041 </td><td> 56 </td><td> 34&#39;899&#39;830</td><td> 5.7 </td><td> 3.350 </td><td> 36.85 </td></tr><tr><td> DP049 </td><td> 38 </td><td> 18&#39;521&#39;230 </td><td> 6.8 </td><td> 1.020 </td><td> 11.22 </td></tr><tr><td> DP028 </td><td> 32 </td><td> 16&#39;410&#39;670 </td><td> 5.6 </td><td> 1.720 </td><td> 18.92 </td></tr><tr><td> DP056 </td><td> 36 </td><td> 19&#39;737&#39;580 </td><td> 5.7 </td><td> 1.130 </td><td> 12.43 </td></tr><tr><td> DP059 </td><td> 52 </td><td> 23&#39;376&#39;180 </td><td> 3.6 </td><td> 7.880 </td><td> 86.68 </td></tr><tr><td> DP047 </td><td> 41 </td><td> 20&#39;658&#39;370 </td><td> 6.4 </td><td> 1.040 </td><td> 11.44 </td></tr><tr><td> DP036 </td><td> 23 </td><td> 8&#39;742&#39;390 </td><td> 3.5 </td><td> 0.950 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> DP027 </td><td> 42 </td><td> 29&#39;150&#39;480 </td><td> 5.1 </td><td> 3.410 </td><td> 37.51 </td></tr><tr><td> DP046 </td><td> 54 </td><td> 16&#39;800&#39;070 </td><td> 5.3 </td><td> 8.210 </td><td> 90.31 </td></tr><tr><td> DP055 </td><td> 57 </td><td> 32&#39;340&#39;270 </td><td> 6.2 </td><td> 1.280 </td><td> 14.08 </td></tr><tr><td> DP064 </td><td> 74 </td><td> 41&#39;896&#39;460 </td><td> 6.5 </td><td> 2.440 </td><td> 26.84 </td></tr><tr><td> DP067 </td><td> 80 </td><td> 46&#39;388&#39;540 </td><td> 6.3 </td><td> 5.200 </td><td> 57.20 </td></tr><tr><td> ממוצע </td><td> 38 </td><td> 31&#39;544&#39;704 </td><td> 5.8 </td><td> 3.965 </td><td> 42.14 </td></tr><tr><td colspan="6"></td></tr><tr><td></td><td></td><td class="jove_content_small"> מספר האיונים / הדגימה </td><td class="jove_content_small"> נפח נאסף רקמה / דגימה [מיקרומטר 3] </td><td class="jove_content_small"> רין </td><td class="jove_content_small"> סך רנ&quot;א [ng] </td></tr><tr><td></td><td> רכס </td><td> 19-80 </td><td> 8&#39;742&#39;390 - 81&#39;522&#39;153 </td><td> 3.4-7.2 </td><td> 4.76-228.58 </td></tr><tr><td></td><td> ממוצע </td><td> 38 </td><td> 31&#39;544&#39;704 </td><td> 5.8 </td><td> 42.14 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. סקירה כללית של כמות רקמת microdissected ואת האיכות והכמות של RNA חולץ. את הדגימות מוצגת בסדר כרונולוגית. נפח הרקמה שנאסף מחושב כדלקמן: עובי cryosection (10 מיקרומטר) x שטח microdissected [מיקרומטר 2]. 1 RNA μl של כל מדגם נותח על PicoChip Bioanalyser Agilent 2100. <img src="/files/ftp_upload/50231/50231fig1.jpg" aLT = &quot;איור 1&quot; fo: תוכן רוחב = &quot;4.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50231/50231fig1highres.jpg&quot; /&gt; איור 1. autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם autofluorescence של תאים בטאו לאחר התייבשות של cryosections לבלב עם ריאגנטים שנשמרו גם בטמפרטורת חדר (), או קר כקרח (ב) (העירור 450-490 ננומטר, הפליטה&gt; 515 ננומטר;. 400 x גדלה). תאי הביתא מופיעים צהובים, ואילו צינורות לבלב, כלי קולגן ולהציג צבע ירוק. סרגל קנה מידה: 75 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/50231/50231fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50231/50231fig2highres.jpg" /> איור 2. איכות וכמות של איון רנ&quot;א. פרופיל חילוץ של מדגם RNA איון של אדם שנלקח עם LMD פרוטוקול זה (ב &#39;) בהשוואה למדגם RNA סטנדרטי (). 1 RNA μl של כל דגימה יושם על PicoChip ונותח לquantity ואיכותי עם 2100 Bioanalyser Agilent. (): רין (מספר שלמות RNA) 7.7 [rRNA יחס (28S/18S): 1.3)]; (ב &#39;): רין 7.2 [יחס rRNA (28S/18S): 1.1)]. הריכוז של האיון רנ&quot;א היה 1.3 ng / μl, בסכום כולל של 10.3 ננוגרם מרקמת לבלב 21&#39;360&#39;060 מיקרומטר 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50231/50231fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens at JoVE.com

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

improved-protocol-for-laser-microdissection-human-pancreatic-islets

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

14.3K Views.  Paul Langerhans Institute Dresden. microdissection הליזר הוא טכניקה המאפשרת התאוששות של תאים נבחרים מכמויות זעירות של parenchyma. כאן אנו מתארים פרוטוקול לרכישת איי לבלב אנושיים מדגימות ניתוחיות שתשמש למחקרי transcriptomic. הפרוטוקול שלנו משפר את autofluorescence הפנימית של תאי הביתא אדם, ובכך להקל האוסף שלהם.

Video: Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

ניתוחים למודל חולדה של השתלה כבדה orthotopic חלקית עם שחזור עורקית כבדיה

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon dioxide and waste products. The impairment of microvascular vasomotion might be a crucial step in the development of microcirculation-related diseases. In addition, the highly vascularized pancreatic islet is adapted to support endocrine function. In this respect, it seems possible to infer that the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion might affect pancreatic islet function. Analyzing the pathological changes of the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion may be a feasible strategy to determine contributions that pancreatic islet microcirculation makes to related diseases, such as diabetes mellitus, pancreatitis, etc. Therefore, this protocol describes using a laser Doppler blood flow monitor to determine the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion, and to establish parameters (including average blood perfusion, amplitude, frequency, and relative velocity of pancreatic islet microvascular vasomotion) for evaluation of the microcirculatory functional status. In a streptozotocin-induced diabetic mouse model, we observed an impaired functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion. In conclusion, this approach for assessing pancreatic islet microvascular vasomotion in vivo may reveal mechanisms relating to pancreatic islet diseases.

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Pancreatic islet microvascular vasomotion regulates islet blood distribution and maintains the physiological function of islet &#946; cells. This protocol describes using a laser Doppler monitor to determine the functional status of pancreatic islet microvascular vasomotion in vivo and to assess the contributions of pancreatic islet microcirculation to pancreatic-related diseases.

לייזר דופלר: כלי למדידת הלבלב איון Microvascular Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...