המחברים מודים משפחות של תורמים איברים הרכש ארגונים העוסקים במחקר זה ואמילי מונטגומרי, רוברט Pietras, אן פו, Mitali Agarwal, ו רושאן Agarwal לסיוע המומחה שלהם. עבודה זו מומנה על ידי Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) בתמיכה של רשת לעוגב תורמים הלבלב עם סוכרת.

1. Microtomy על סעיפים בלא כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת אמבט מים microtome באשר microtomy פרפין סטנדרטי. השתמש שקופיות בעלי מטען חשמלי חיובי ושל מראש תווית עם מספר התיק, באזור הלבלב (לדוגמה) ואת מספר שקופיות. פרפין במקום לחסום צ&#39;אק microtome עם תווית את הקלטת בצד שמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההליכים microtomy רגילים, סעיף לבלוק עד רקמת הוא נתקל באופן אחיד. לייצר סרט של חלקים סדרתיים (4 מיקרומטר עבים, 3-6, תלוי כמה כתמים הנדרשים הראשונים (ראה מקרה הגשת טופס, נספח 1)). חלקים נפרדים סרט, לקחת את זה לפי הסדר, ומניחים על שקופיות עם סדר ספורים בעיפרון. לציין אם סעיף זה מנוצל על ידי מספור הסעיפים לפי סדר מדויק. לשמור על הכיוון אותו בשקופית כמו למצוא קלטת עם תווית שקופיות בכיוון שמאלה. יבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להמשיך עם כתמים או הפצה החוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילמשטח EAL של גוש פרפין עם שכבה דקה של פרפין לשמר רקמות ארכיון בטמפרטורת החדר או -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור microtomy לאחר מכן, לשמור על מספור הסעיפים סדרתיים בכל רמה לעיל. קבל 1 שקופית נוספת על ידי כתם שקופיות H &amp; E עבור כל רמה ~ 100 מיקרומטר בתוך כל בלוק. </li></ol> 2. H &amp; E מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית הראשונה מחולק הסידורי של כל בלוק במעמד שקופית ואז במגש הראשון autostainer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התוכנית תקן H &amp; E כתם ולהמשיך כרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום מכתים, להסיר את השקופיות מן autostainer ומניחים מכסה המנוע של coverslipping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip באמצעות טכניקה סטנדרטית. לייבש היטב את התווית עם תווית מודפס (ראה סעיף 12). </li></ol> 3. IHC Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התוכנית Dako עבור כתמים כפולים ומספרים קלט של שקופיות. הכן TBST ו ציטראט מאגרים, נוגדנים, reag אחרלהורים על פי כרכים שצוין (טבלה 1). טען את מגש מגיב שקופיות. הסיבוב של קווים נקיים פסולת מתוכנתים על פי המלצות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מבצעים את מבחני ידני, להכין כרכים כ. דגירה שקופיות חדר humidified להימנע שקופיות ייבוש החוצה בשלב כלשהו. בצע את אותו תהליך עבור כל ריאגנטים כמו בעת שימוש עבור autostainer. </li></ol> 4. IHC Deparaffinization ואחזור Antigen <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות קסילן במשך 5 דקות. חזור פעם אחת. אל תאפשר השקופיות להתייבש בכל שלב שלאחר מכן עד כמצוין זה יביא ברקע מוגזם מכתים עניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות אתנול 100% במשך 2 דקות. חזור פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות מוכן טרי 3% H 2 O 2 ב מתנול במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות באתנול 90% ולאחר מכן למקם באתנול 90% במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיותאתנול 70% למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים שקופיות דה מיונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים הספינה ואת מאגר ציטראט על הספינה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שקופיות ציטראט חיץ קיטור ואדים במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר שקופיות מים ממושכת עד מחליק מצננים לטמפרטורת החדר (~ 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות מדפי autostainer Dako על פי כתם רצף (איור 1) ולהפעיל את תוכנית צביעה כפולה. הצעדים העיקריים של התוכנית autostainer מפורטים כך פועל ידניים יכול לשכפל. </li></ol> 5. נוגדנים הראשוניות (Ki-67, CD3, הלבלב פוליפפטיד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום שקופיות עם פתרון צלף במשך 15 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות הנוגדן העיקרי במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם עז Mach2 אנטי עכבר (Ki-67) או ארנבת אנטי (CD3, הלבלב פוליפפטיד) צנון סוס peroxidase (HRP) פולימר של 30 מ &#39;inutes. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) לשקופיות עבור 4 דקות. לשטוף פעמיים במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות מודגרות עם הלבלב פוליפפטיד מוחזקים על Dako בזמן הטיפול ושם ישקלו לו ויעריכו במקביל ו TBST המשמש את כל הצעדים הבאים תוך בשקופיות שנותרו מודגרת עם סט של 2 נוגדנים ראשוניים. לחלופין, עבור מבחני ידניים, המשך לסעיף 6. </li></ol> 6. נוגדנים ראשיים השני (אינסולין, גלוקגון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות דיב 20 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם סרום 10% עיזים רגיל חוסם avidin 20% TBST (אינסולין) או צלף (גלוקגון) ב TBST במשך 20 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם אינסולין או נוגדנים גלוקגון העיקרי במשך 15 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינסולין: שקופיות דגירה של חזיר biotinylated עז נגד גינאה בדילול 1:300 במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. דגירה עם יש תקןctor ABC-AP מגיב במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלוקגון: שקופיות דגירה של חיץ במהלך 30 דקות ואחריו נגד העכבר עז אלקליין phosphatase (AP) פולימרי במשך 30 דקות. שטפו פעמיים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד שקופיות מודגרת ב conjugates, לחמם את מאגר LPR לטמפרטורת החדר. הוסף 1 טיפה של נוזל אדום קבע (LPR) לכל מאגר מ&quot;ל 3 מיידית לפני השימוש במקום במעמד מגיב Dako. דגירה שקופיות LPC במשך 4 דקות. לשטוף פעמיים במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות hematoxylin דקה 1. יש לשטוף פעמיים במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות כפות pH 7.6 דקה 1. יש לשטוף פעמיים במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוק שקופיות מ DAKO Autostainer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד מייבשים שקופיות מוכתמים על הלבלב פוליפפטיד. עבור כל השקופיות מוכתמים כפולות, יבש לפחות שעה 1 ואז מייבשים. </li></ol> 7. התייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום שקופיות באתנול 80% למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות באתנול 95%. </lאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק שקופיות באתנול 95% למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות אתנול 100% והחזק 1 דקה. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק שקופיות קסילן דקה 1. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לעלות coverslips בשקופיות באמצעות cytoseal. </li></ol> 8. Slide סימון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את זיהוי המקרה המידע כולל מספר איברים אבן, כתם, ותאריך ולהדפיס. בסעיף מספר סידורי הוא אופציונלי על הכתמים השקופית הראשונה של כל בלוק. רמות הבאים מסומנים על ידי מספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים תוויות בשקופיות. </li></ol> 9. שקופיות סריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים במגש שקופיות צבעונית, סורק לסרוק פי מכשור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארגן שקופיות לפי סוג התורם ורקמות (ראש הלבלב, גוף, זנב, טחול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות ארכיון מוכתמים בטמפרטורת החדר וכל שקופיות בלא כתם הנותרים ב -20 ° C עד בשימוש. </li></ol> 10. Representative תוצאות נהלים אלה צביעה פותחו עבור רשת JDRF לעוגב תורמים הלבלב עם סוכרת (nPOD) כדי לספק אפיון בסיסי של פרפין בלוקים קפואים טריים. תורם לכל אחד מהם יש אפיון המחקר ביצע מורכב מכתים 2 בלוקים כל אזור הלבלב (ראש, גוף, זנב) ואת הטחול (איור 1, ראו גם טופס הגשת התיק, נספח 1). צביעת H &amp; E נעשה באמצעות autostainer מתוכנת כמו מתקן קלינית קליני כיתה פתרונות המשמשים לאורך כל הדרך. כמו אבני התורמות נוספים הם מחולק, לכל שקופית מובנת H &amp; E להראות מורפולוגיה רקמות. כאשר הם אבני מחולק שוב, כמו להפצה החוקרים, רמות עמוקות יותר יהיה גם שקופיות שצולמו עבור נציג H &amp; שקופיות ה לתעד את המורפולוגיה של הרקמה בלוק שלם כמו גם מספור הסעיפים סדרתיים בכל רמה. שקופיות ויטראז מסומנים עםזיהוי מקרה, באזור הלבלב, מספר בלוק, כתם ותאריך (איור 2) וסקר את מערכת ניהול מידע באינטרנט הפתולוגיה. תמונות מייצגות מתורם השליטה מוצגות באיור 3 בשני בהגדלה נמוך וגבוה להראות התוצאות הצפויות בעקבות הליך זה. מוכתם שקופית עם הלבלב פוליפפטיד (D, H) ושם ישקלו לו ויעריכו היה ביום אחר עם assay באופן ידני ומראה עוצמת מכתים מופחת של counterstain hematoxylin. הבדלים מכתים עוצמת נוגדנים ראשוניים או counterstain בין מבחני יש להימנע במיוחד אם באמצעות ניתוח תמונה אחרת עם מחליק דורשים תיקון צבע הפרט כדי להשיג את אותו התא או אזורים ספירות. כל מעבדה צריך לצפות כדי לייעל את ריכוזי הנוגדנים כמו הרבה אל הווריאציה הרבה חומרים כימיים אחרים ותנאים יכול להשפיע בעוצמה מכתים וספציפיות. עם הרכישה של ניו ריאהרבותי, נהלים מכתים מאומתים עם דגימות הידועות בקרה חיוביים ושליליים כדי להשיג את אותה מידה של עוצמת הכתם כמו ריאגנטים לשעבר. נוגדנים נוספים אופטימיזציה בליבת nPOD הפתולוגיה ניתנים בטבלה 2 כמקור התייחסות שימשו במשך multilabeling מבחני immunofluorescence עבור מיקרוסקופיה confocal. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. רשת Dako מכתים. סכמטית זה מתאר ניתוח שגרתי מהלבלב התורם nPOD שבוצעה על autostainer Dako. התורמים nPOD מוצפנים עם מספר בן 4 ספרות זיהוי. שני מגשי שקופיות מוצגים עם שקופיות מאורגנות על ידי כתם. תצורות חלופיות שקופיות צפויים תלוי במספר שקופיות התורמות. בקרות חיוביות כוללים הכללת תורם חיובית ידוע על שני כתמים כפולים הטחול התורם עבור Ki-67 ו CD3. בקרות שליליות הן כפולה וכוללים 2 SLIדה מבלוק אחד תורם הלבלב מודגרות עם אימונוגלובולינים (איג) מן המין המארחות של נוגדנים ראשוניים שתי שקופיות של הטחול התורם עבור אינסולין גלוקגון. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. נציג שקופית צבעונית כפולה. שקופיות המוגמר טיפוסי מוצג עם תיוג פרמטרים שקופיות השמה רקמות לפני סריקה דיגיטלית מבוצעת. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. נציג H &amp; E וכתמים IHC בסעיפים הלבלב. סעיפים מהלבלב של תורם האיבר הנשי הבוגר (6096-04 PanHead) היו מוכתמות סריקות דיגיטליות שבוצעו כמפורט בפרוטוקול. התמונות התקבלו באמצעות תוכנית ImageScope ההצגה של סעיף שלם (AD) ומ איון 1 (EH). את עוצמות איון צפוי כתם של אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד הםציין עבור חלקים BD כמו משרטטת פרק ד &#39;, כי זה בלוק בראש הלבלב מכיל חלק קטן של האזור אונקלי או באונה הלבלב הגחון כמו איים כולם מכילים בעיקר פוליפפטיד חיובי בתאי הלבלב. שים לב counterstain hematoxylin בלוח D הוא קל מדי בזמן hematoxylin counterstain עוצמות ב B ו-C הם אופטימליים. לוחות EH להראות איון מהאונה הגב עם ההפצה מצופה מתאי בטא ו α-תאים. התאים בלבלב כמה פוליפפטיד נמצאים בחלק השמאלי התחתון של איון (H). , E-H &amp;E; B, F-Ki67 + אינסולין, C, G-CD3 + גלוקגון, D, H-הלבלב פוליפפטיד. לספירה, 0.2X, EH-12.8x.

<ol>
	<li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans.">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li><li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset.">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).</li><li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex,+obesity,+and+presence+of+type-2+diabetes.">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li><li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+intraepithelial+neoplasia:+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions.">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li><li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells,+without+alterations+in+fractional+insulin+area.">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li><li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li><li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+in+human+type+1+diabetes.">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li><li>Veld, I. n. '. t., P, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulitis+in+human+type+1+diabetes:+The+quest+for+an+elusive+lesion.">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li><li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+etiology,+immunology,+and+therapeutic+strategies.">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

סטנדרטיזציה של תהליכי IHC הוא קריטי לניתוח תמונה, במיוחד בעת שימוש במחשב מבוסס אלגוריתמים על פני מספר גדול של שקופיות לאורך זמן. הליך מכתים IHC המתואר בדוח זה יאפשר ניתוח סדרה של דגימות של תורמים ניתן באמצעות autostainer תוך יום 8 שעות עבודה משתנים מן הדו&quot;ח הקודם 5. דיג...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מי חמצן 30% (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> Peroxidase אנדוגני חסימת </td></tr><tr><td> ABC-phosphatase אלקליין (AP) </td><td> וקטור </td><td> AK-5000 </td><td> AP המצומד </td></tr><tr><td> נוגדנים diluent </td><td> Invitrogen </td><td> 003218 </td><td> ראשי נוגדן </td></tr><tr><td> Avidin חוסם </td><td> וקטור </td><td> SP-2001 </td><td> חסום ביוטין אנדוגני </td></tr><tr><td> עיזים Biotinylated נגד חזיר ים </td><td> וקטור </td><td> BA-7000 </td><td> משני הנוגדנים </td></tr><tr><td> Bluing מגיב </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> לייקה autostainer </td></tr><tr><td> מאגר ציטראט, ה-pH 6.0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> Antigen אחזור </td></tr><tr><td> Clarifier 1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> לייקה autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Coverslip mountant </td></tr><tr><td> DAB </td><td> וקטור </td><td> SK-4100 </td><td> HRP אב צבע </td></tr><tr><td> דיב </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> AP אנדוגני חסימת מגיב </td></tr><tr><td> Eosin אלכוהולי Y </td><td> FisherScientific </td><td> 71204 </td><td> לייקה autostainer </td></tr><tr><td> Ethanols-100%, 95%, 90%, 70% </td><td> FisherScientific </td><td> שונים </td><td> Deparaffinization ו coverslipping </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako autostainer </td></tr><tr><td> Hematoxylin 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> לייקה autostainer </td></tr><tr><td> IgG (כל המינים המארחות של נוגדנים ראשוניים) </td><td> שונים </td><td> שונים </td><td> בקרות שליליות על הפריימריז </td></tr><tr><td> אדום קבע נוזלי (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP אב צבע </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare רפואי </td><td> MALP521L </td><td> אנטי עכבר עיזים AP המצומד </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare רפואי </td><td> MHRP520L </td><td> אנטי עכבר עיזים HRP המצומד </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare רפואי </td><td> RHRP520L </td><td> אנטי עכבר עיזים HRP המצומד </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> FisherScientific </td><td> שונים </td><td> H 2 O 2 diluent </td></tr><tr><td> עז רגיל סרום </td><td> וקטור </td><td> S-1000 </td><td> IHC מגיב חסימת </td></tr><tr><td> צלף </td><td> Biocare רפואי </td><td> BS966M </td><td> IHC מגיב חסימת </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> מדד ת&quot;א 999-TT </td><td> IHC חיץ </td></tr><tr><td> Triology 20x </td><td> תא Marque </td><td> 920P-06 </td><td> Antigen אחזור </td></tr><tr><td> קסילן </td><td> FisherScientific </td><td> שונים </td><td> Deparaffinization ו coverslipping </td></tr></tbody></table> טבלה 1. חומרים כימיים ספציפיים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ראשי נוגדן </td><td> המארחות מינים </td><td> מוכר </td><td> החתול. # </td><td> תגובות ואחזור Antigen </td></tr><tr><td> פרפין </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> עמילאז </td><td> עכבר </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-46657 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> עכבר </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> פחמתית anhydrase 19.9 </td><td> עכבר </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3, ביקע </td><td> ארנב </td><td> התא איתות </td><td> 9961 </td><td> ציטראט או הטרילוגיה </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> ציטראט או הטרילוגיה </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> ארנב </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> עכבר </td><td> התא איתות </td><td> 3569 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> ציטראט </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> CD45 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> Chromogranin </td><td> ארנב </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> C-peptide </td><td> ארנב </td><td> התא איתות </td><td> 4593 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> עכברוש </td><td> Bioscience דואר </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> ציטראט </td></tr><tr><td> גרלין </td><td> עז </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> גרלין </td><td> ארנב </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקגון </td><td> ארנב </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקגון </td><td> עכבר </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> גלוקגון </td><td> חזיר ים </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> שפע-1 </td><td> עכבר </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> טרילוגיה </td></tr><tr><td> שפע-2 </td><td> ארנב </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-9117 </td><td> לא באה לידי ביטוי איים אדם </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> חזיר ים </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Ki-67 </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> Mafa </td><td> ארנב </td><td> נובוס ביולוגית </td><td> NB400-137A </td><td> טרילוגיה </td></tr><tr><td> פוליפפטיד הלבלב </td><td> ארנב </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td> חזיר ים </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> ציטראט או הטרילוגיה </td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> עכבר </td><td> Novocastra </td><td> NCL-proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> עכבר </td><td> התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק </td><td> GS-9A8 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> ארנב </td><td> סיגמא </td><td> HPA 006641 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> שריר חלק אקטין </td><td> ארנב </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> ארנב </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> ציטראט </td></tr><tr><td> טרי קפוא </td><td> המארחות מינים </td><td> מוכר </td><td> החתול. # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> עכברוש </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> תקן עם PF 4% </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> ארנב </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> עכבר </td><td> נובוס ביולוגית </td><td> נ.ב. 600-564 </td><td> השתמש הדגירה לילה עבור חלקים פרפין </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> עכבר </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> תקן עם אצטון </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> עכבר </td><td> סנטה קרוז </td><td> SC-130569 </td><td> תקן עם PF 4% </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> עכבר </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> תקן עם אצטון או PF 4% </td></tr></tbody></table> טבלה 2. נוגדנים ראשיים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> שקופית סורק דיגיטלי </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer פלוס </td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC כתמים </td></tr><tr><td> מטריקס לייבל הדפסה תוכנה </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> התווית שקופיות תוכנה </td></tr><tr><td> לייקה XL Autostainer </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E כתמים </td></tr><tr><td> פרימיום Coverglass </td><td> FisherScientific </td><td> 12-548-5j </td><td> Coverslip </td></tr><tr><td> מידע קשת Manager </td><td> Aperio </td><td></td><td> סורק תוכנות </td></tr><tr><td> Superfrost פלוס מחליק </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> מטען חשמלי חיובי שקופיות </td></tr><tr><td> ירקות קיטור </td><td> שחור דקר </td><td> שונים </td><td> Antigen אחזור </td></tr><tr><td> Zebra TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> התווית שקופיות מדפסת </td></tr></tbody></table> לוח 3. אספקה ​​וציוד ספציפיים.

staining protocols for human pancreatic islets

אומדני השטח מספרים איון ותא האנדוקרינית הרכב בלבלב אדם מבוגר נע בין כמה מאות אלפים על טווחים המונים כמה מיליוני ובטא מ 500 עד 1500 מ&quot;ג 1-3. עם ההטרוגניות זה ידוע, עיבוד רגיל הליך מכתים פותחה על כך אזורים הלבלב הוגדרו בצורה ברורה איים מאופיין באמצעות אנליזה פתולוגית בכליה קפדני בדיקות immunolocalization. נהלים אחידים לעיבוד הלבלב האנושי התאושש תורמים איברים מתוארים בחלק זה של סדרה 1. הלבלב מעובד ל 3 אזורים עיקריים (ראש, גוף, זנב) ואחריו חלקים רוחביים. חלקים רוחביים של ראש הלבלב מחולקים עוד יותר, כפי שמצוין על פי גודל, ממוספרות לפי סדר אלפביתי לציון קטנים. סטנדרטיזציה זו מאפשרת ניתוח מלא חתך רוחב של אזור הראש כולל אזור אונקלי המכיל איים המורכביםבעיקר של תאים בלבלב פוליפפטיד לאזור הזנב. הדו&quot;ח הנוכחי מהווה חלק 2 מתוך סדרה זו ומתאר את הנהלים המשמשים חתך סדרתי ואפיון histopathological של פרפין סעיפים הלבלב עם דגש על תאים אנדוקריניים איון, שכפול, T-cell המחלחל. פתולוגיה של הלבלב סעיפים נועד לאפיין גם אקסוקרינית, ductular, ורכיבים אנדוקריניות. תא אקסוקרינית מוערך נוכחות של דלקת הלבלב (פעיל או כרוני), ניוון, סיסטיק, שומן, כמו גם מערכת צינורות, בעיקר ביחס לנוכחות של neoplasia הלבלב intraductal 4. איי מוערכים על מורפולוגיה, גודל, צפיפות, תאים אנדוקריניים, דלקת, פיברוזיס, עמילואיד, ואת הנוכחות של תאים אפופטוטיים משכפלים או באמצעות H &amp; E ו-IHC כתמים. המרכיב האחרון המתואר חלק 2 הוא מתן שקופית צבעוניתכמו דיגיטציה של תמונות שקופיות שלמים. השקופיות דיגיטציה מסודרים לפי המקרה באזור הלבלב במסד נתונים של הפתולוגיה מקוון ליצירת biobank וירטואלי. גישה לאוסף מקוון זה מספק כיום יותר מ -200 רופאים ומדענים העוסקים במחקר סוכרת מסוג 1. מסד הנתונים המקוון מספק אמצעי לשיתוף נתונים מהירה מלאה לחוקרים בחר אבני פרפין או חלקים סדרתיים קפואים.

Watch this Scientific Journal Video about Staining Protocols for Human Pancreatic Islets at JoVE.com

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H &amp; E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H &amp; E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלחל דלקתיות (H &amp; E, CD3). האזור אונקלי הוא מקומי באמצעות IHC של הלבלב פוליפפטיד.

הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

staining-protocols-for-human-pancreatic-islets

Research

JoVE Journal

Medicine

26.7K Views.  University of Florida. סרט הווידאו הזה מדגים נהלים ואפיון של איים הלבלב אדם באמצעות hematoxylin ו eosin (H & E) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC). סעיפים הלבלב מן הראש, הגוף, באזורים הזנב מוכתמות על ידי שני H & E ו-IHC לקבוע הרכב האנדוקרינית איון (אינסולין, גלוקגון, והלבלב פוליפפטיד), שכפול תאים (Ki67), וכן מחלח?...

Video: Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

Immunohistochemical המכתים של B7-H1 (PD-L1) בפרפין מוטבע-שקופיות של רקמת לבלב אדנוקרצינומה

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

מכרסם איי הערכת שכפול של התא פונקציה בטא Adenovirally-transduced מבודדים

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

דגם orthotopic bioluminescent של התקדמות סרטן הלבלב

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an extended perfusion period is challenging. We have added the kidney to our previous ex vivo perfused liver experiment model to reproduce a more accurate physiological state for prolonged experiments without using live animals. Five intact livers and kidneys were retrieved post-mortem from sacrificed pigs on different days and perfused for a minimum of 6 hr. Hourly arterial blood gases were obtained to analyze pH, lactate, glucose and renal parameters. The primary endpoint was to investigate the effect of adding one kidney to the model on the acid base balance, glucose, and electrolyte levels. The result of this liver-kidney experiment was compared to the results of five previous liver only perfusion models. In summary, with the addition of one kidney to the ex vivo liver circuit, hyperglycemia and metabolic acidosis were improved. In addition this model reproduces the physiological and metabolic responses of the liver sufficiently accurately to obviate the need for the use of live animals. The ex vivo liver-kidney perfusion model can be used as an alternative method in organ specific studies. It provides a disconnection from numerous systemic influences and allows specific and accurate adjustments of arterial and venous pressures and flow.

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Study of the animal organ physiology can be achieved by performing an experimental ex vivo perfusion system. The addition of a porcine kidney, as a homeostatic organ to our previously developed ex vivo liver perfusion model can be a principal step to achieve a better physiological environment.

צעדים לעצמיים ב<em&gt; Ex vivo</emניסוי כבד וכליה&gt; perfused בשר חזירים

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...