עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM50322 לPM קיין. המחברים מודים לד&quot;ר ראג&#39;יני ראו, אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס למתן פלסמידים pHluorin שמרים ועצה על מדידות pH ratiometric, וד&quot;ר א &#39;גלוריה מרטינז מוניוס לעבודה מתוך פרוטוקולים אלה למעבדה שלנו.

1. מדידה של pH vacuolar In Vivo שימוש BCECF-AM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות נוזלית 50 מ&quot;ל של זן השמרים שיש למדוד במדיום הרצוי למשך הלילה. המטרה היא לקבל את תאים בשלב אמצע יומן (OD600 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר) מדידה של כ 0.8 להשעיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאי השמרים על ידי צנטריפוגה. Resuspend גלולה ב0.6 מ&quot;ל של מדיום הגידול וההעברה לצינור microcentrifuge שכבר שקל בעבר. גלולה התאים שוב בmicrocentrifuge XG ב 2000 עבור 60 שניות. הסר את supernatant מלא ככל האפשר, ולאחר מכן לשקול את התא גלולה. Resuspend גלולה לצפיפות סופית של 0.5 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​(w / v); תרבות של נפח זה תיתן לי תא גלולה של כ 200 מ&quot;ג, 200 וμl של חיץ תהיה הוסיפה לתת נפח סופי של 400 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף BCECF-AM להשעית התא בריכוז סופי של 50 מ&quot;מ ממניות 12 מ&quot;מ הערוך DMSO. מערבבים היטב ולאחר מכן incubate התאים על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. על פלטפורמת נדנדה או תוף גלגלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים דוגרים, להכין מאגרי כיול. חיץ הכיול מכיל 50 מ&quot;מ MES (2 - (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה), 50 HEPES מ&quot;מ (4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה), 50 מ&quot;מ KCl, 50 מ&quot;מ NaCl, 0.2 אמוניום אצטט M, 10 מ&quot;מ אזיד הנתרן, ו10 מ&quot;מ 2-deoxyglucose, ומותאם לרמת חומציות הערכים מתאימים לטווח הכיול שלך עם NaOH או HCl. (זהירות: אזיד הנתרן הוא רעילה ביותר ויש לטפל בזהירות.) למדידת חומציות בתאי הבר מסוג, היינו להכין כמה תערובות כיול ב-pH 5.5 ל 6.5, אבל למוטציות צפויות להיות pH vacuolar בסיסי יותר ( מוטציות VMA), היינו להכין תמיסות בופר נוספות, גבוהות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מיליליטר aliquot של חיץ כיול עבור כל pH ל15 צינורות חרוטי מ&quot;ל, ולהוסיף monensin (מלאי 15 מ&quot;מ) וnigericin (מניית 2 מ&quot;מ) כדי לתת ריכוזים סופיים של monensin מיקרומטר 110 ו -15 מיקרומטר nigericin, respectively. מערבבים היטב במיקסר מערבולת. (זהירות: שני monensin וnigericin הם רעילים ויש לטפל בזהירות.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר זמן הדגירה BCECF-AM הושלם, גלולה ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה למשך 30 שניות XG ב 2000 בmicrocentrifuge. Resuspend התאים הוא 1 מ&quot;ל של מדיום גידול חסר גלוקוז ו צנטריפוגות כאמורה לעיל. חזור על שלב זה לשטוף פעם אחת, ולאחר מכן resuspend גלולה ב200 μl של מדיום גידול ללא סוכר. מניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של ההשעיה תא צינור אחד כיול pH שהוכן לעיל. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. על תוף גלגלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את fluorimeter למדוד לסירוגין באורכי גל עירור 450 ננומטר ו 490 ננומטר, שני עם אורך גל של 535 ננומטר פליטה. הגדר את טמפרטורת תא הדגימה עד 30 ° C. לבצע את כל המדידות עם ערבוב רצוף של התערובת בקובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.96 מ&quot;ל של 1 מ&quot;מ MES (מותאם pH 5 או 7 תלוי ברמת החומציות של הצמיחה בינונית של התאיםND עיצוב ניסיוני). הוסף 20 μl של השעיה תא לתוך קובט. ליזום מדידות הקרינה. אנו אוספים גם הקינטית רציף ונתוני נקודת זמן בניסויים שונים. לנתונים קינטיים רציפים, אנחנו לוקחים את המדידות בכל 6 שניות במשך 5 דקות, ולאחר מכן להוסיף סוכר לריכוז הגלוקוז סופי של 50 מ&quot;מ, ולהמשיך מדידה למשך 5-10 דקות. למדידות בזמן נקודה אחת, אנחנו בדרך כלל לוקחים את המדידות ב1 ו -5 דקות. לאחר תוספת של תאים לקובט, להוסיף סוכר כמו במדידות הקינטית, ולאחר מכן לקחת דקות אחר מדידת 5. לאחר תוספת סוכר. יכולות להיות מגוונות תוספות אלה, וניתן גם להוסיף רכיבים נוספים (מעכבים, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידות הניסיוניות הן מוחלטת, הסר את הצינורות מכיול 30 מעלות צלזיוס הדגירה ולהעביר את כל נפח 2 מ&quot;ל לכל לקובט fluorimeter. למדוד הקרינה בבית באותן ההגדרות (ראה 1.8) כל 5 שניות על סך של 30 שניות לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">יצוא נתוני הקרינה ל-Microsoft Excel. (לfluorimeter שלנו, זה מחייב יצוא של הנתונים כטקסט בצורת טאבים ויבוא לתוך Excel.) לקבל עקומת כיול על ידי חישוב היחס של הקרינה ב 490 ננומטר ל -450 ננומטר עבור כל תערובת כיול. יחס הקרינה אז זמם לעומת pH כדי לקבל עקומת כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את נתוני ניסוי ליחס הקרינה ולחשב pH באמצעות עקומת הסטנדרט. לאחר מכן ה-pH vacuolar יכול זממה נגד זמן (קינטיקה של שינויי pH) או בהשוואה בתנאים שונים (איור 1), או בזנים מוטנטים שונים. </li></ol> 2. מדידה של pH Cytosolic In Vivo שימוש pHluorin שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את זן השמרים הרצויים עם pHluorin שמרי פלסמיד ידי פרוטוקולים סטנדרטיים, ובחר לtransformants על חסר אורציל מדיום מינימאלי בתוספת (SC-אורציל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות נוזלית 50 מ&quot;ל של תאים הפכו בSC-אורציל לשלב אמצע יומן (OD <sub&gt; 600 = 0.8 או נמוך יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תקני כיול כפי שתואר עבור pH vacuolar, אבל חיץ לטווח pH מתאים למדידות pH cytosolic, בדרך pH 6-8. Aliquot 2 מ&quot;ל של חיץ כיול מותאם לרמת החומציות הרצויה למספר 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל. הוסף monensin וnigericin כמתואר לעיל (1.4) ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי צנטריפוגה כפי שתואר לעיל, וresuspend גלולה ב600 μl של מדיום הגידול. העברה לשקל צינור microcentrifuge, ותאי גלולה ידי צנטריפוגה ב 5000 סל&quot;ד במשך 30 שניות. Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מדיום גידול ללא סוכר (SC-אורציל,-גלוקוז), תאים גלולה שוב וחוזר חליל. לאחר צנטריפוגה הסופית, להסיר את supernatant באופן יסודי ככל האפשר, ולשקול את התא גלולה. Resuspend תאים לצפיפות סופית של 0.5 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​בSC-אורציל ללא סוכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של השעיה תא צינור אחד של חיץ כיול ומערבבים היטב במיקסר מערבולת. לדגור על 30 ° C ב הרוטור תוף מסתובב במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת fluorimeter לעירור באורכי גל 405 ננומטר ו485 ואורך גל פליטה של ​​508 ננומטר. להמשיך עם נקודה אחת בזמן או מדידות קינטיים ותוספת של גלוקוז כמתואר לעיל למדידת BCECF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הקרינה של דגימות כיול, ולבנות עקומת כיול כלBCECF (ראה 1.10-1.11). עלילה של יחס לעומת pH הקרינה היא ליניארי על פני הטווח של רוב מדידות pH cytosolic (pH 6.0-8.0) 9, מומרות מדידות הקרינה יחס כל כך בקלות לניסוי ה-pH. </li></ol>

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

יש החוקרים אין ניגודי האינטרסים לחשוף.

יש לנו פרוטוקולים אלה מנוצלים כדי לטפל במספר היבטים של הומאוסטזיס-pH. לדוגמה, יש לנו לעומת תגובות cytosolic וה-pH של תאים שעברו מוטציה ופראי מסוג V-ATPase לקוי 4,5. גם אנחנו בדקנו את ההשפעות של תנאים שהשתנו צמיחה, במיוחד pH תאי, בתגובה לגלוקוז vacuolar pH 3. חשוב מכך, את התגובו...

הומאוסטזיס pH הוא תהליך דינמי ופיקוח הדוק בכל 1,2 אורגניזמים. תהליכים ביוכימיים מוסדרים היטב על ידי חומציות, וסביבות תאיות מכוונים לטווחי pH צרים כדי לאפשר פעילות אופטימלית של אנזימי התושב. עם זאת, ניתן יהיה לערער על הומאוסטזיס pH תאי על ידי שינויים מהירים בחומציות סביבתית, משמרות מטבוליים, ומסלולי איתות מסוימים. בנוסף, ה-pH תאי יכול עצמו לשמש כאות חשובה. לבסוף, אברונים רבים לשמור על ערכי pH lumenal הנבדלים מסביבת cytosol וחיוניים לתפקודי אברון ספציפיים. מניות cerevisiae Saccharomyces שמרי מספר מנגנוני הומאוסטזיס pH עם אאוקריוטים גבוהים יותר 2. באברונים חומציים של מסלול endocytic / lysosomal, pH נשלט בעיקר על ידי vacuolar פרוטון translocating-ATPase השמור ביותר (V-ATPase), הפועל במקביל עם רבים exchanGers תלויה בשיפוע PH. כל התאים אוקריוטים גם מנגנוני יצוא פרוטון. הוא האמינו בפטריות וצמחים, משאבת מימן שנייה, ברורה בקרום הפלזמה, Pma1, פרוטונים מטבוליות יצוא ולהיות הקובע העיקרי של ה-pH cytosolic ופוטנציאל קרום פלזמה. הגמישות הגנטית של ס &#39; cerevisiae והחשיבות המסחרית שלה, הפכו אותו למודל מאוד מעניין וחשוב ללימוד pH הומאוסטזיס 2. בנוסף להיותו מניעים העיקריים של החמצת אברון, V-ATPases מאוד מוסדר אנזימים והמעבדה שלנו היא מעוניינת בהבנת מנגנוני ויסות V-ATPase. למען מטרה זו, יש לנו כבר משתמשים במדידות pH vivo של pH vacuolar וcytosolic: 1) לעקוב אחר תגובות לתנאים תאיים משתנים, כגון גלוקוז וקיפוח readdition, 2) כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות שפשרת פעילות V-ATPase, ו 3) לחקור coordination של אברון ופלזמת משאבות פרוטונים בממברנה 3-5. ניסויים אלה התאפשרו רק באמצעות הפיתוח של אינדיקטורים pH ratiometric חזקים המתאימים לשימוש בתאי שמרים. . צמח ואח&#39; הראשון הראה כי BCECF (2&#39;7&#39;-Bis (2-carboxyethyl) -5 - (ו 6), carboxyfluorescein), שכבר בשימוש נרחב למדידת חומציות cytosolic בתאי יונקים, מצטבר בvacuole השמרים במקום 6 cytosol. הבדל זה בלוקליזציה BCECF יוחס לאנזימים הרבים hydrolytic בvacuole, אשר עשוי אחראים למחשוף של תיל אסטר acetoxy מBCECF-AM (אסתר acetoxymethyl של BCECF) וvacuolar שימור 6. עלי ואח&#39;. 7 מפותח יותר מדידת חומציות vacuolar באמצעות BCECF ומותאם מדידות אלה לפורמט קורא צלחת פלואורסצנטי. ברט ואח&#39;. הציג pHluorin שמרים כאמצעי למדידת חומציות cytosolic בשמרים בהבעת R פלסמיד שמקורןGFP atiometric pH רגיש 8 תחת שליטה של אמרגן שמרים ספציפי 9. ספקטרום העירור של שני BCECF ושמרי pHluorin רגיש לחומציות, ולכן הם משמשים כאינדיקטורים pH ratiometric שבה היחס של הקרינה בשני אורכי גל עירור, הנמדדים באורך גל פליטה יחידה, מספק מדד לרמת חומציות 8,10. חיישני pH vacuolar וcytosolic אלה שמרים שמשו במשך שתי מדידות התא בודדות ומבוססות אוכלוסייה. מדידות תא בודד 6,11 מבוצעות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח תמונה. הקרינה vacuolar או cytosolic בשני אורכי הגל נמדדת לכל תא. המדידות מבוססות אוכלוסייה מבוצעות בשני קורא microplate עם יכולות הקרינה מתאימות או בfluorimeter. בדרך כלל יש לנו לעשות מדידות שלנו בfluorimeter, משום שהיא מספקת גישה קלה לתוספת של רכיבים כגון גלוקוז בקוןמדידות הקינטית tinuous. פרוטוקולי המעבדה הנוכחיים שלנו למדידת חומציות vacuolar וcytosolic מפורטים להלן; הן מותאמים גם למבחנים בקלות microplate.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

Vacuolar וcytosolic pH הם מאוד מוסדר בתאי שמרים ותופס תפקיד מרכזי באיזון חומציות בכללותה. אנו מתארים פרוטוקולים למדידת ratiometric של pH in vivo באמצעות pH רגיש fluorophores המקומי לvacuole או cytosol. pH vacuolar נמדד באמצעות BCECF, שlocalizes לvacuole בשמרים כאשר הוכנסו לתאים בצורת אסתר acetoxymethyl שלה. pH cytosolic נמדד עם GFP pH רגיש הביע תחת שליטה של ​​אמרגן שמרים, שמרי pHluorin. שיטות למדידת יחס הקרינה בהשעיות תא שמרים בfluorimeter מתוארות. באמצעות פרוטוקולים אלה, מדידות נקודת זמן יחידה של ה-pH בתנאים שונים או בשמרי מוטנטים שונים כבר השוואה ושינויים ב-pH לאורך הזמן היו במעקב. שיטות אלה גם הותאמו לפורמט קורא צלחת הקרינה לניסויי תפוקה גבוהה. יתרונות של מדידות pH ratiometric מעל AP האחרproaches כיום בשימוש, בעיות פוטנציאליות ניסיוניות ופתרונות, וסיכויים לשימוש עתידי של טכניקות אלה גם תאר.

איור 1 מציג את הנתונים המתקבלים על pH vacuolar wild-type תאי שמרים גודלו במדיום עשיר (שמרי תמצית-peptone-dextran; YEPD) נאגרו לחומציות 5 עם 50 מ&quot;מ MES. לעתים קרובות אנו מגדלים את התאים במדיום שנאגרו בגלל החומציות של המדיום יכולה לשנות באופן דרמטי למדי במהלך צמיחה בין לילה, במיוחד ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

pH vacuolar וcytosolic ניתן למדוד בשמרי חיים (<em&gt; ס cerevisiae</em&gt;) תאים באמצעות צבעי ניאון ratiometric המקומיים לתאים סלולריים מסוימים. אנו מתארים נהלים למדידת חומציות vacuolar עם BCECF-AM, שlocalizes לvacuole בשמרים, וה-pH cytosolic עם GFP pH רגיש ratiometric cytosolic (שמרי pHluorin).

מדידה של pH vacuolar וCytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; בהשעיות תא שמרים

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

measurement-vacuolar-cytosolic-ph-vivo-yeast-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

19.7K Views.  SUNY Upstate Medical University. pH vacuolar וcytosolic ניתן למדוד בשמרי חיים ( ס cerevisiae) תאים באמצעות צבעי ניאון ratiometric המקומיים לתאים סלולריים מסוימים. אנו מתארים נהלים למדידת חומציות vacuolar עם BCECF-AM, שlocalizes לvacuole בשמרים, וה-pH cytosolic עם GFP pH רגיש ratiometric cytosolic (שמרי pHluorin).

Video: Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D מיקרוסקופ של שמרים

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...