وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM50322 R01 لكين PM. الكتاب أشكر الدكتور راجيني راو، جامعة جونز هوبكنز لتوفير الخميرة البلازميدات pHluorin وللحصول على المشورة بشأن قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric، والدكتور غلوريا A. مارتينيز مونيوز على العمل بها هذه البروتوكولات لمختبرنا.

1. قياس درجة الحموضة في الجسم الحي باستخدام رغوي BCECF-AM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة السائل 50 مل من سلالة الخميرة إلى أن تقاس على المدى المتوسط ​​المطلوب بين عشية وضحاها. الهدف هو أن تكون الخلايا في مرحلة منتصف السجل (OD600 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر) قياس ما يقرب من 0.8 لتعليق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي الخميرة. Resuspend وبيليه في 0.6 مل من وسط النمو ونقل إلى أنبوب microcentrifuge التي تم وزنه سابقا. بيليه الخلايا مرة أخرى في microcentrifuge في 2،000 x ج لمدة 60 ثانية. إزالة طاف تماما بقدر الإمكان وثم وزن الخلية بيليه. resuspend الكرية إلى كثافة النهائي من 0.5 جم / مل (W / V)، وسوف ثقافة هذا الحجم يعطي الخلية بيليه من حوالي 200 ملغ، و 200 ميكرولتر من العازلة ستضاف إلى إعطاء الحجم النهائي من 400 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة BCECF-AM إلى تعليق خلية في تركيز النهائي من 50 مم من الأسهم 12 ملم أعدت في DMSO. تخلط جيدا ثم المؤتمر الوطني العراقيأوباتي الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. على منصة هزاز أو الأسطوانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تحتضن الخلايا، وإعداد مخازن المعايرة. المخزن المؤقت معايرة يحتوي على 50 ملي زارة التربية والعلم (2 - (N-morpholino) ethanesulfonic حامض)، 50 HEPES ملم (4 - (2-هيدروكسي إيثيل)-1-piperazineethanesulfonic حامض)، 50 ملي بوكل، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.2 M خلات الأمونيوم، 10 ملي أزيد الصوديوم، و 10 ملي 2-deoxyglucose، ويتم ضبط درجة الحموضة إلى القيم المناسبة لمجموعة معايرة مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك. (تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية، وينبغي التعامل معها بحذر.) لقياس درجة الحموضة في الخلايا من النوع البري، فإننا إعداد عدة مخاليط المعايرة في درجة الحموضة 5،5-6،5، ولكن لالمسوخ المتوقع أن يكون الرقم الهيدروجيني فجوي أكثر قلوية ( المسوخ الأهدل)، ونحن نستعد إضافية، مخازن درجة الحموضة أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 2 مل من العازلة معايرة لكل درجة الحموضة في أنابيب مخروطية 15 مل، وإضافة مونينسين (15 ملي الأسهم) وnigericin (الأسهم مم 2) لإعطاء تركيز النهائي من 110 ميكرومتر مونينسين و 15 ميكرومتر nigericin، صespectively. تخلط جيدا في خلاط دوامة. (تنبيه: كل مونينسين وnigericin سامة، وينبغي التعامل معها بحذر.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من فترة حضانة BCECF-AM، بيليه تعليق خلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 XG في microcentrifuge. resuspend الخلايا هي 1 مل من متوسط ​​النمو تفتقر الجلوكوز وأجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه. كرر هذه الخطوة يغسل مرة واحدة، ثم resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من متوسط ​​النمو دون الجلوكوز. مكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل أنبوب معايرة درجة الحموضة أعد أعلاه. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. على الأسطوانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مقياس التألق لقياس بالتناوب في موجات الإثارة 450 نانومتر و 490 نانومتر، على حد سواء مع الطول الموجي الانبعاثات من 535 نانومتر. ضبط درجة حرارة غرفة العينة إلى 30 درجة مئوية. تنفيذ جميع القياسات مع التقليب المستمر للخليط في كفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.96 مل من 1 ملم MES (تعديلها لدرجة الحموضة 5 أو 7 اعتمادا على درجة الحموضة من نمو الخلايا المتوسطة &#39;Aالثانية التصميم التجريبي). إضافة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كفيت. بدء قياسات مضان. نقوم بجمع كل البيانات نقطة زمنية في تجارب مختلفة الحركية المستمر و. بالنسبة للبيانات الحركية المستمرة، ونحن نأخذ القياسات كل 6 ثوانى لمدة 5 دقائق، ثم يضاف السكر إلى تركيز الجلوكوز النهائي من 50 ملم، ويستمر لمدة 5-10 دقيقة القياس. لقياسات نقطة زمنية واحدة، ونحن نأخذ القياسات عموما في 1 و 5 دقائق. بعد إضافة الخلايا لكفيت، إضافة الجلوكوز كما في القياسات الحركية، ومن ثم أخذ القياس آخر 5 دقائق. بعد إضافة السكر. يمكن أن تختلف هذه الإضافات، ويمكن أيضا مكونات إضافية (مثبطات، الخ) يمكن ان تضاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القياسات التجريبية كاملة، وإزالة أنابيب المعايرة من 30 ° C الحضانة ونقل كامل حجم مل 2 لكل لكفيت مقياس التألق. قياس مضان في نفس الإعدادات (انظر 1.8) كل 5 ثوانى على ما مجموعه 30 ثانية لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تصدير البيانات إلى Microsoft Excel مضان. (للحصول على مقياس التألق لدينا، وهذا يتطلب تصدير البيانات كنص في شكل المفصول والاستيراد إلى Excel.) الحصول على منحنى المعايرة عن طريق حساب نسبة من مضان في 490 نانومتر إلى 450 نانومتر لكل خليط المعايرة. ثم يتم رسم نسبة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني للحصول على منحنى المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل البيانات التجريبية إلى نسبة مضان وحساب الرقم الهيدروجيني باستخدام منحنى القياسية. يمكن درجة الحموضة فجوي ثم تآمر ضد الزمن (حركية التغييرات درجة الحموضة) أو مقارنة في ظل ظروف مختلفة (الشكل 1) أو في سلالات متحولة مختلفة. </li></ol> 2. قياس درجة الحموضة عصاري خلوي في الجسم الحي باستخدام الخميرة pHluorin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سلالة الخميرة المطلوب مع pHluorin الخميرة البلازميد بواسطة بروتوكولات موحدة، وحدد ل transformants على استكمال الحد الأدنى المتوسطة تفتقر اليوراسيل (SC-اليوراسيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة السائل 50 مل من الخلايا تحولت في SC-اليوراسيل إلى مرحلة منتصف السجل (OD <suب&gt; 600 = 0.8 أو أقل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معايير المعايرة كما هو موضح لدرجة الحموضة فجوي، ولكن المخزن المؤقت لمجموعة ودرجة الحموضة المناسبة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي، ودرجة الحموضة عموما 6-8. قسامة 2 مل من العازلة معايرة تعديلها لدرجة الحموضة المطلوبة إلى عدة أنابيب مخروطية 15 مل. إضافة مونينسين وnigericin كما هو موضح أعلاه (1.4) وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه، و resuspend بيليه في 600 ميكرولتر من متوسط ​​النمو. نقل إلى أنبوب microcentrifuge وزنه، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. Resuspend الكرية في 1 مل من متوسط ​​النمو دون الجلوكوز (SC-اليوراسيل، الجلوكوز)، وخلايا بيليه مرة أخرى وتكرار. بعد الطرد المركزي النهائي، وإزالة طاف على أكمل وجه ممكن، وتزن بيليه الخلية. Resuspend الخلايا إلى كثافة النهائي من 0.5 جم / مل في SC-اليوراسيل مع عدم وجود الجلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل أنبوب من المخزن المؤقت معايرة وتخلط جيدا في خلاط دوامة. احتضان عند 30 درجة مئوية على الدوار طبلة الغزل لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقياس التألق لإثارة عند أطوال موجية 405 و 485 نانومتر والطول الموجي الانبعاثات من 508 نانومتر. المضي قدما في نقطة واحدة مرة أو القياسات الحركية وبالإضافة إلى ذلك من الجلوكوز كما هو موضح أعلاه لقياس BCECF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان من عينات المعايرة، وبناء منحنى المعايرة كما لBCECF (انظر 1،10-1،11). قطعة من نسبة مضان مقابل الرقم الهيدروجيني هو الخطية على نطاق معظم قياسات درجة الحموضة عصاري خلوي (درجة الحموضة 6.0-8.0) 9، وتحويلها بسهولة تجريبية ولذلك قياسات نسبة مضان لدرجة الحموضة. </li></ol>

<ol>
	<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensors+and+regulators+of+intracellular+pH.">Sensors and regulators of intracellular pH.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).</li><li>Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+is+a+tightly+controlled+signal+in+yeast.">Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).</li><li>Diakov, T. T., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+activity+and+assembly+by+extracellular+pH.">Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH.</a> J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).</li><li>Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+and+plasma+membrane+proton+pumps+collaborate+to+achieve+cytosolic+pH+homeostasis+in+yeast.">Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast.</a> J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).</li><li>Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+loss+of+Vph1+protein-containing+vacuolar+ATPases+(V-ATPases)+for+overall+cellular+pH+homeostasis.">Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).</li><li>Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+vacuolar+acidification+in+H(+)-ATPase-deficient+yeast.">Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast.</a> J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).</li><li>Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+sodium/proton+exchange+by+a+Rab-GTPase-activating+protein+regulates+endosomal+traffic+in+yeast.">Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast.</a> J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endosomal+Na+K+/H++exchanger+Nhx1+regulates+cellular+pH+to+control+vesicle+trafficking.">The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).</li><li>Owen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+spectrum-shifting+intracellular+pH+probes+5'(and+6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7,+1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one+and+2',7'-biscarboxyethyl-5(and+6)-carboxyfluorescein.">Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5'(and 6')-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-one and 2',7'-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein.</a> Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).</li><li>Dechant, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+pH+is+a+second+messenger+for+glucose+and+regulates+the+PKA+pathway+through+V-ATPase.">Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase.</a> Embo J. 29, 2515-2526 (2010).</li><li>Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+of+monensin+sensitivity+in+yeast:+implications+for+post-Golgi+traffic+and+vacuolar+H+-ATPase+function.">Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function.</a> Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).</li><li>Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionophores+and+intact+cells.+I.+Valinomycin+and+nigericin+act+preferentially+on+mitochondria+and+not+on+the+plasma+membrane+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).</li><li>Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CLC+protein+counteracts+vesicular+acidification+during+iron+starvation.">The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation.</a> J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).</li><li>Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+cytosolic+and+mitochondrial+pH+using+a+pH-sensitive+GFP+derivative+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+relation+between+intracellular+pH+and+growth.">In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth.</a> Microbiology. 155, 268-278 (2009).</li><li>Zhang, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+ergosterol+in+V-ATPase+function+underlies+antifungal+activity+of+azole+drugs.">Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).</li><li>Brett, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+the+vacuolar+pH-stat+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 6, e17619 (2011).</li><li>Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+yeast+vacuole.">Methods for studying the yeast vacuole.</a> Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).</li><li>Chan, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+V-ATPase+proton+transport+reveal+uncoupling+functions+of+tether+linking+cytosolic+and+membrane+domains+of+V0+subunit+a+(Vph1p).">Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p).</a> J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).</li><li>Johnson, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+inhibitors+of+vacuolar+proton-translocating+ATPase+pumps+in+yeast+by+high-throughput+screening+flow+cytometry.">Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry.</a> Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

لقد استخدمت هذه البروتوكولات لمعالجة عدد من جوانب التوازن الرقم الهيدروجيني. على سبيل المثال، لدينا مقارنة الاستجابات عصاري خلوي ودرجة الحموضة من النوع البري وV-أتباز التي تعاني من نقص خلايا متحولة 4،5. لقد درست أيضا آثار تغير ظروف النمو، ودرجة الحموضة خارج الخ...

توازن درجة الحموضة هي عملية ديناميكية ودرجة عالية من التنظيم في جميع الكائنات الحية 1،2. العمليات البيوكيميائية وينظم بإحكام بواسطة الرقم الهيدروجيني، ويتم ضبطها البيئات داخل الخلايا إلى نطاقات ضيقة الرقم الهيدروجيني للسماح النشاط الأمثل للأنزيمات المقيمين. ومع ذلك، الخلايا التوازن درجة الحموضة يمكن الطعن من قبل التغيرات السريعة في درجة الحموضة البيئة، والتحولات الأيضية، وبعض مسارات الإشارات. وبالإضافة إلى ذلك، ودرجة الحموضة داخل الخلايا نفسها يمكن أن تكون بمثابة إشارة هامة. وأخيرا، العديد من العضيات الحفاظ على قيم درجة الحموضة lumenal التي تختلف من العصارة الخلوية المحيطة وأساسية لوظائف عضية محددة. الخميرة خميرة الخباز أسهم عدد من آليات التوازن درجة الحموضة مع ارتفاع حقيقيات النوى 2. في العضيات الحامضية للمسار التقامي / الليزوزومية، ويتم التحكم في المقام الأول درجة الحموضة من قبل فجوي البروتون translocating أتباز حفظها للغاية (V-أتباز)، تعمل جنبا إلى جنب مع العديد من exchanالخيام تعتمد على التدرج درجة الحموضة. لديهم كل الخلايا حقيقية النواة أيضا آليات التصدير البروتون. في الفطريات والنباتات، والثانية، مضخة البروتون متميزة في غشاء البلازما، Pma1، صادرات البروتونات التمثيل الغذائي، ويعتقد أن يكون محددا رئيسيا من درجة الحموضة عصاري خلوي والمحتملة غشاء البلازما. المرونة الجينية من S. الخباز وأهميتها التجارية، جعلت من نموذج مثيرة جدا للاهتمام ومهم لدراسة توازن درجة الحموضة 2. بالإضافة إلى كونها السبب الأساسي في عضية تحمض، وV-ATPases درجة عالية من التنظيم الانزيمات، وتهتم مختبرنا في فهم آليات التنظيم V-أتباز. وتحقيقا لهذا الهدف، لقد تم استخدام في قياس الأس الهيدروجيني pH الجسم الحي من درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي: 1) لرصد الاستجابات لتغير الظروف خارج الخلية، مثل الحرمان من الجلوكوز وreaddition، 2) لدراسة آثار الطفرات التي سطا النشاط V-أتباز، و 3) لاستكشاف COORdination من عضية والبلازما مضخات البروتون غشاء 3-5. أصبحت هذه التجارب فقط ممكن من خلال وضع مؤشرات قوية درجة الحموضة ratiometric قابلة للاستخدام في خلايا الخميرة. وأظهرت محطة وآخرون الأولى التي BCECF (2&#39;7&#39;-مكرر (2-carboxyethyl) -5 - (و 6)-carboxyfluorescein).، والتي تم استخدامها على نطاق واسع لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في خلايا الثدييات، يتراكم في فجوة الخميرة بدلا من العصارة الخلوية 6. ويعزى هذا الاختلاف في BCECF توطين للعديد من الإنزيمات حلمهي في فجوة، والتي من المرجح المسؤولة عن الانقسام من استر الميثيل acetoxy من BCECF-AM (استر acetoxymethyl من BCECF) والاحتفاظ فجوي 6. علي وآخرون. 7 تطويرها قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF وتكييفها هذه القياسات إلى تنسيق قارئ لوحة مضان. بريت وآخرون. عرض pHluorin الخميرة كوسيلة لقياس درجة الحموضة عصاري خلوي في الخميرة بالإعراب عن R-المنقولة البلازميدatiometric GFP حساسة الرقم الهيدروجيني 8 تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة محددة 9. أطياف الإثارة من كلا BCECF والخميرة pHluorin حساسة لدرجة الحموضة، بحيث يتم استخدامها كمؤشرات درجة الحموضة ratiometric فيه نسبة من مضان على اثنين من موجات الإثارة، ويقاس عند طول موجي واحد الانبعاثات، ويوفر قدرا من درجة الحموضة 8،10. وقد استخدمت هذه المجسات الخميرة درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي لكلا القياسات أحادية الخلية ومرتكزة على السكان. القياسات وحيدة الخلية 6،11 يتم تنفيذها بواسطة الفحص المجهري مضان وتحليل الصور. يتم قياس مضان فجوي أو عصاري خلوي في موجات اثنين لكل خلية. يتم تنفيذ القياسات المأخوذة من السكان في أي قارئ صفيحة ميكروسكوبية مع قدرات مضان المناسبة أو في مقياس التألق. قمنا به عموما قياسات لدينا في مقياس التألق، لأنه يوفر سهولة الوصول لإضافة مكونات مثل الجلوكوز خلال يخدعالقياسات الحركية المستمرين. يتم سرد لدينا بروتوكولات مختبر الحالية لقياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي أدناه، ويتم أيضا تكييفها بسهولة على حد سواء لفحوصات صفيحة ميكروسكوبية.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spectrofluorometer</td>
 <td>Horiba Jobin Yvon</td>
 <td>Model Fluoromax-4</td>
 <td>Temperature control and stirring capability are desirable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCECF-AM</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>B1150</td>
 <td>Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 &deg;C </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>monensin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M5273</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>nigericin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>N7143</td>
 <td>Toxic. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M8250</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measurement of vacuolar and cytosolic ph in vivo in yeast cell suspensions

فجوي ودرجة الحموضة عصاري خلوي درجة عالية من التنظيم في خلايا الخميرة، وتحتل دورا مركزيا في توازن درجة الحموضة بشكل عام. نحن تصف بروتوكولات لقياس الرقم الهيدروجيني ratiometric في الجسم الحي باستخدام درجة الحموضة حساسة fluorophores مترجمة إلى فجوة أو العصارة الخلوية. يتم قياس درجة الحموضة فجوي باستخدام BCECF، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة عندما أدخلت الخلايا في شكله استر acetoxymethyl. يتم قياس درجة الحموضة عصاري خلوي مع GFP حساسة درجة الحموضة أعرب تحت سيطرة أحد المروجين الخميرة، الخميرة pHluorin. وصفت وسائل لقياس نسب مضان في تعليق خلية الخميرة في مقياس التألق. من خلال هذه البروتوكولات، وقد تم مقارنة وقت واحد نقطة قياسات الحموضة في ظل ظروف مختلفة أو في المسوخ الخميرة مختلفة، ولقد تم رصد تغيرات في درجة الحموضة على مر الزمن. كما تم تكييف هذه الأساليب إلى لوحة مضان قارئ شكل لإجراء التجارب الإنتاجية العالية. مزايا قياس الأس الهيدروجيني pH ratiometric أكثر من AP أخرىموصوفة أيضا مقاربات قيد الاستخدام حاليا، المشاكل المحتملة التجريبية والحلول، وآفاق استخدامها في المستقبل من هذه التقنيات.

ويبين الشكل 1 البيانات الحموضة فجوي الحصول على خلايا الخميرة البرية من نوع نمت في المتوسط ​​الغني (خلاصة الخميرة، ببتون-ديكستران؛ YEPD) مخزنة لدرجة الحموضة 5 مع 50 ملي زارة التربية والعلم. ونحن غالبا ما تنمو الخلايا في متوسطة مخزنة لأن الرقم الهيدروجيني للمتوس...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions at JoVE.com

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

ويمكن قياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي في الخميرة الحية (<em&gt; S. الخباز</em&gt;) الخلايا باستخدام الأصباغ الفلورية ratiometric مترجمة إلى مقصورات الخلوية محددة. وصفنا إجراءات لقياس درجة الحموضة فجوي مع BCECF-AM، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة، ودرجة الحموضة عصاري خلوي مع ratiometric GFP حساسة للدرجة الحموضة عصاري خلوي (الخميرة pHluorin).

قياس درجة الحموضة رغوي وعصاري خلوي<em&gt; في فيفو</em&gt; في تعليق خلية الخميرة

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

measurement-vacuolar-cytosolic-ph-vivo-yeast-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

19.7K Views.  SUNY Upstate Medical University. ويمكن قياس درجة الحموضة فجوي وعصاري خلوي في الخميرة الحية ( S. الخباز) الخلايا باستخدام الأصباغ الفلورية ratiometric مترجمة إلى مقصورات الخلوية محددة. وصفنا إجراءات لقياس درجة الحموضة فجوي مع BCECF-AM، الذي يموضع إلى فجوة في الخميرة، ودرجة الحموضة عصاري خلوي مع rat...

Video: Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

في القياس الصغير تداول المجراة في الهيكل العظمي والعضلات التي البينية الحيوية الميكروسكوب

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

في وقت واحد قياس درجة الحموضة في التقامي وعصاري خلوي المقصورات في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D مجهرية الخميرة

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

تأثير البروتينات الفلورية على الشركاء الانصهار باستخدام فحوصات السمية Polyglutamine في الخميرة

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...