החוקרים מכירים במימון מהמועצה למחקר האוסטרלית והבריאות הלאומיות ומועצה למחקר הרפואי של אוסטרליה וגם רוצים להודות המתקן הלאומי באוסטרליה ייצור עבור SU-8 האב להדפסת microcontact. SHN נתמך על ידי משרד חינוך הגבוהה למלזיה וUniversiti Sains מלזיה.

1. פסיבציה של Coverslips זכוכית עם PLL-PEG-ביוטין צעד זה נועד passivate פני השטח כך שתאים לדבוק ונודדים אל אזורים ספציפיים על coverslip הזכוכית שנוצרים עם הדפסת microcontract (שלב 2-3 א) או לטבול יתוגרפיה העט (שלב 3 ב). לפסיבציה, שיתוף פולימר של פולי-L-ליזין (PLL) ופוליאתילן גליקול (PEG) משמש בו 20% ממולקולות PEG הם השתילו לביוטין (PLL-PEG-יוטין). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות coverslips הזכוכית (18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ), משקיע אותם במדף באתנול 100% ולהציב את המדף באמבטית sonicating למשך 30 דקות. ייבש את coverslips הזכוכית באוויר או מתחת לזרם של חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, sonicate את coverslips הזכוכית עבור 30 דקות בM NaOH 1. לאחר מכן יש לשטוף את משטחי זכוכית על ידי טבילת המדף בזהירות בכוס מלאה ב1.5 הליטר מילי-Q H 2 O. חזור על תהליך שטיפת שלוש פעמים באמצעות טרי מילי-Q H 2 O בכל פעם. ייבש את הזכוכית בcoverslipsתנור ב 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מחצית הזכוכית הנקיה coverslips בנפרד בתא לח, שעשוי מצלחת 24 גם מלאה חלקית עם H 2 O. ירידה של 15 μl של PLL-PEG-ביוטין (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ב PBS על כל coverslip זכוכית. קח את החצי השני של coverslips הזכוכית הנקיה שנותר ובזהירות כריך פתרון PEG. השאר את coverslips לשעה 1 בתא הלח. הסט את coverslips הדחוק בעדינות אחד מהשני ללא מגרד את פני השטח PEG המצופים ולשטוף אותם עם מילי-Q H 2 O. המים צריכים להחליק בקלות בצד PEG-טופל. במידת צורך, את coverslips אוויר היבש במגבת נייר הזכוכית עם פני שטח המטופלים פונה כלפי מעלה. אחסן את coverslips הזכוכית בתא ייבוש ואקום עד לשימוש נוסף. </li></ol> 2. המצאה של חותמות להדפסת microcontact אנו מתארים שני תהליכים למסלולי streptavidin דפוס על גבי זכוכית coverslips פסיבציה. הראשון, כניסת המיקרופוןהדפסת rocontact, בדרך כלל דורשת ייצור של אדון סיליקון שממנו חותמת PDMS נפלה. במקרה שלנו, הדפוס על בול PDMS הם 100 קווי רוחב מיקרומטר שהם מרווחים 290 מיקרומטר מרכז למרכז בגובה תכונה של 25 מיקרומטר. בהמשך, נתאר בקצרה כיצד לפברק אדון מתאים סיליקון (שלב 2.1-2.3) וחותמת PDMS (שלב 2.4). עם זאת, קיימים פרוטוקולים מרובים עבור הדפסת microcontact תוארו בספרות 19-23, אשר מתאימות להדפסת תבניות חלבון על coverslips זכוכית. מאסטרס יכול גם להיות מותאם אישית עשה ונרכש ממקורות מסחריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לנקות את פרוסות סיליקון (4 &quot;בקוטר) על ידי הדגרתו בפתרון Piranha (03:01 v: v של חומצה גופרתית ומי חמצן 30%). במשך 20 דקות יש לשטוף ביסודיות הרקיק 10 פעמים עם MilliQ H 2 O. ייבש את הפרוסות בתנור בחום של 150 מעלות CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הפרוסות נקיות ויבשות סיליקון עם אצטון 100%, ואחריו באלכוהול רפואי 100%. הבא2 מיליליטר ספין מעייל של GM1070 SU-8 photoresist (Gersteltec Sarl) על גבי פרוסות סיליקון ב3100 סל&quot;ד ל 40 שניות כדי ליצור שכבה עבה מיקרומטר 25. אז המדגם אפה על צלחת חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחרי 5 דקות נוספות ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את SU-8 photoresist לאור UV במשך 60 שניות תחת photomask עם התבנית הרצויה (לדוגמה באמצעות Quintel Q6000 מסכת aligner) וחזור על תהליך האפייה לתאר ב2.2. אז המדגם הוא פותח על ידי טבילה ברקיק SU-8 מפתח (Gersteltec Sarl) במשך 4 דקות, נשטפו באלכוהול רפואי 100% והתייבשו תחת זרימת חנקן. האזור של photoresist SU-8 שלא נחשף לקרינת UV ובכך הוסר, יצירת התבנית ההפוכה של בול PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא להטיל חותמת PDMS מן אדון סיליקון. ראשית, ביסודיות לערבב חלק 1 (w / w) של סוכן הריפוי עם 10 חלקי prepolymer אלסטומר (Sylgard 184). כדי להסיר כל בועות אוויר, דגת התערובת בתא ייבוש המצורף לקו ואקוםלשעה 1. בשלב הבא, שופך אלסטומר PDMS על אדון סיליקון בתוך צלחת הפטר לכ 1 סנטימטר בגובה ולרפא את התערובת ואדון PDMS בתנור בחום של 70 מעלות צלזיוס במשך השעה 1. לבסוף, חותמת PDMS יוסרה מאדון סיליקון ולחתוך לגודל. </li></ol> 3. Streptavidin דפוסים או רמזים דבקים על Coverslips הזכוכית פסיבציה לאחר passivating coverslips זכוכית, דפוסי חלבון מודפסים עם הדפסת microcontact (3a סטפ) או ליתוגרפיה מטבל עט (שלב 3 ב). במקרה שלנו, streptavidin מודפס כקווים, המהווים את הבסיס לשיפועי RGD (שלב 4). אותו הנוהל יכול לשמש גם להדפסת חלבוני מטריצה ​​ליצור דפוסים דבקים. שיטה חלופית להדפסת microcontact לדפוסים של ביומולקולות על משטחים היא לטבול יתוגרפיה עט. בטבילת יתוגרפיה העט, שלוחה משמשת להעברת נפח קטן של פתרון על פני השטח. גודל cantilevers, viscosity מהפתרון, פנה זמן של השלוחה על פני השטח, hydrophobicity של פני השטח והלחות בתא הדפוס לקבוע את הגודל של התכונות המודפסות. יתרונה של שיטה זו הוא שדפוסים שונים ניתן להדפיס עבור כל ניסוי, שכן אין צורך לפברק אדונים ובולים. החסרון הוא שזה לוקח יותר זמן להדפיס דפוס נתון ושטבילת יתוגרפיה העט דורשת מכשיר מומחה שלא יהיה זמין במעבדות רבות. מכשיר יתוגרפיה בעט שהשתמשנו היה NanoeNabler מBioforce הנם. כאן, אנו מודפסים נקודות קטנות שהיו &lt;10 מיקרומטר בקוטר, שעבורו השתמש SPT10 cantilevers. 3 א. Microcontact הדפסת טכניקה (μCP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ולהפוך את חותמת PDMS הידרופילי יותר, לטפל בצד הדוגמת מבולי PDMS בUV ואוזון (לדוגמא Procleaner, UV אוזון מBioforce הנני) עבור 1.5 שעות. לחלופין, השתמש בפלזמהמנקה לזמן קצר יותר לאותה המטרה. תהליך זה יוצר חמצון PDMS 24 פני שטח, אשר משפר את תהליך ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הטיפול באוזון או פלזמה, המקום והתפשטו 10 streptavidin μl (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS) על גבי בולי PDMS ולהשאיר לשעה 1 בתא לח (כגון צלחת 6-גם מלאה חלקית, ראה שלב 1.3) . אם רצועות צריכות להיות גלויות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי, השתמש streptavidin שהוא מצומדת לfluorophore כגון streptavidin-AlexaFluor350. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר streptavidin העודף מהבול ​​בממחטות נייר ואוויר ייבש את החותמת לכ 1 דקות. לחץ קל על חותמת coverslip הזכוכית PLL-ביוטין המצופה PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניאון streptavidin שמש ב3.a2 השלב, לבחון את דפוס שימוש תחת מיקרוסקופ epifluorescence. אחסן משטחים מודפסים בייבוש. </li></ol> ב 3. טובלי יתוגרפיה העט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לערבב חלק 1 של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​או streptavidin streptavidin-AlexaFluor350 עם 10 חלקים של גליצרול (v / v) ולטעון 5 μl של התערובת על השלוחה. ואז להתחיל בתהליך ההדפסה, כמתואר במדריך לפעולת מכשיר יתוגרפיה בעט. כדי להקטין את גודל המקום לכ 5 מיקרומטר, להתאים את מהירות הדפסה, לפנות זמן של השלוחה על פני שטח או אנכי המרחק של השלוחה אל פני השטח. בדוגמא שמוצגת באיור 2 ג, נקודות הודפסו בקנה אחד עם שורה ועמודת הפרדה המוגדרת 10-15 מיקרומטר. מרחק זה הוא מספיק כדי למנוע נקודות ממתמזגות זה בזה, אך מאפשר צפייה בנקודות מרובות בשדה אחד של נוף עם רוב ההגדרות המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן משטחים מודפסים בייבוש. </li></ol> 4. יצירת Gradients דבק על משטחי streptavidin-דפוס אנו יוצרים גרדיאנטים דבקים של ביוטין RGD-coverslips על הזכוכית כי הם מצופים בstreptavidin (3 איור) או שיתוףדפוסי ntain streptavidin על coverslips הזכוכית פסיבציה (איור 5). כדי ליצור שיפוע פני שטח, השתמש מכשיר microfluidic זמין מסחרי (הנקרא דביקה שקופיות Chemotaxis 3D מIbidi) שיוצר שיפוע פתרון יציב על ידי דיפוזיה פסיבית. להתחרות על אתרי הקישור streptavidin העסקנו 2 שיפועים מנוגדים של ביוטין-RGD וביוטין שלא היו מוצמד לRGD (ראה תרשים 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייה את coverslips הדוגמת או זכוכית streptavidin המצופים אל הצד הדביק של מכשיר 3D-Slide הדביק Chemotaxis. כדי לוודא שאין דליפה לכמה שעות, את הקצוות של המכשיר אטומים בשכבה דקה של וזלין התחמם ועם שכבה שנייה של תערובת של חלק 1 של וזלין לחלק 1 של שעוות פרפין (w / w). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא הערוץ של המכשיר עם 6 PBS μl בערוץ. ואז למלא את שני מאגרים עם 70 μl של 0.03 מיקרוגרם / μl ביוטין-4-fluorescein ב PBS ו70 &amp; mu; הליטר של 0.03 מיקרוגרם / μl ביוטין-RGD ב PBS, בהתאמה. דגירת הדגימות בRT בחושך לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרוני ביוטין ולשטוף את המשטח בזהירות תוך עדיין מחובר למכשיר microfluidic פעמים עם PBS. סמן את כיוון שיפוע הדבק ואם יש צורך, לאחסן את המכשיר מלא PBS ב 4 ° C לאך יש לוודא שהמכשיר לא יתייבש. במידת צורך, לנתח את שיפוע הדבק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 5. Labelling של תאים עם fluorophores להדמית תא חייה תאים מסומנים עם צבעי ניאון המסייעים מעקב תא מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקות נפוצות הן סמני אברון ניאון, כגון Syto 64 אדום, שמתייג את גרעין התא. לשם כך, תאים נשטפים 1 שלוש פעמים עם PBS, אז מודגרות עם 64 מיקרומטר אדומים 1 Syto בתקשורת התרבות עבור 45 דקות ולבסוף שטפו שלוש פעמים נוספות עם PBS. שים לב שתאים לא צריכים להיותהמשיך בPBS לתקופות זמן ארוכים. צבעים חלופיים למעקב תא הם סדרת CellTracker שכתם ציטופלסמה ונשמרים במהלך נדידת תאים וחטיבה. Transfection של תאים עם חלבון היתוך ניאון שימושי במיוחד כדי להקליט את הפצות subcellular של חלבון של עניין במהלך נדידה. עם זאת, בדרך כלל חלבוני ניאון צילום אקונומיקה מהר יותר מאשר צבעים אורגניים, כך שתצפיות ארוכות הטווח עשויים להיות בלתי אפשריים. 6. טעינה של תאים בצבע מסיס להתקני מיקרופלואידיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי fluorescently הכותרת והתפצל לשני צינורות של מספרים סלולריים שווים. שטוף וresuspend שפופרת אחת של תאים עם מדיה המכילה chemoattractant, כגון הנשר השתנה בינוני הנמוך של גלוקוז Dulbecco (DMEM) עם סרום שור עוברי (10% FBS). שטוף וresuspend צינור האחר של תאים בתקשורת בלי chemoattractant, כלומר DMEM עם 0% FBS. הריכוז הסופישל תאים בכל צינור צריך להיות 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הפתרונים ממכשיר microfluidic (משלב 4.3) ומניח אותו על במת מיקרוסקופ (ראה שלב 7). טען 70 μl של תאים (5 10 5 תאים / מ&quot;ל x ב 0% DMEM FBS) לתוך מאגר אחד ו70 μl של תאי הלה (5 ​​10 5 תאים / מ&quot;ל בx 10% DMEM FBS) לתוך אחר. רופף למקם סרט על המאגרים, כדי למנוע אידוי. אם תאים על פני השטח הם מראש מודגרות לפני ההדמיה, רצוי שהתאים נטענים למכשיר בתקשורת צמיחה ללא שיפוע. אז המכשיר מונח על במת מיקרוסקופ והתקשורת הוחלפה בשיפוע התקשורת כלומר ללא DMEM FBS באחד מאגרים וDMEM עם 10% FBS ביד השנייה. </li></ol> 7. חי הדמית תא וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המיקרוסקופ (ניקון TI-E) ולחמם את שלב שעות לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהערוץ של micrמכשיר ofluidic הוא בשדה הראייה ותאים נמצאים בפוקוס. בחר פרמטר רכישת תמונה כגון זמני חשיפה ומסנני ניאון, רצף תמונות של שדה ופלואורסצנטי הבהיר שלוכד תאים ומסלולים כמו גם נקודתי זמן ואורך הקלטה (למשל כל 15 דקות במשך 16 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים עם תוכנות מתאימות, כגון מעקב ImageJ הידני או Ibidi Chemotaxis וכלי להעברה. </li></ol>

<ol>
	<li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration.">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion:+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension.">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li><li>Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+sensing+through+focal+adhesions.">Environmental sensing through focal adhesions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).</li><li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+cancer.">Chemotaxis in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li><li>Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cells+make+decisions:+engineering+micro-+and+nanoenvironments+for+cell+migration.">How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration.</a> Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).</li><li>Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+fibronectin+matrix+mimetic+as+a+functional+growth-+and+migration-promoting+adhesive+substrate.">Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate.</a> Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+chemokine+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+Coupled+Receptor+(GPCR)-mediated+Signaling+Events+that+Control+Chemotaxis+of+Dictyostelium+Discoideum.">Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum.</a> J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).</li><li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gradient-generating+Microfluidic+Device+for+Cell+Biology.">A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).</li><li>Rhoads, D. S., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+directional+cell+migration+on+defined+FN+gradients:+role+of+intracellular+signaling+molecules.">Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules.</a> Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+haptotactic+gradient+generation+within+a+triangular+microfluidic+channel.">Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).</li><li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device.">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).</li><li>Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+eukaryotic+cell+chemotaxis.">Assays for eukaryotic cell chemotaxis.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).</li><li>Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+micropatterns+for+cells:+a+microcontact+printing+protocol.">Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology.">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+devices:+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration.">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).</li><li>Hillborg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinked+polydimethylsiloxane+exposed+to+oxygen+plasma+studied+by+neutron+reflectometry+and+other+surface+specific+techniques.">Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques.</a> Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).</li><li>Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin,+VEGF,+or+Both+Proteins.">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+a+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li><li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leukocyte+response+to+fluid.">The leukocyte response to fluid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).</li><li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator.">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).</li><li>Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing:+Limitations+and+Achievements.">Microcontact Printing: Limitations and Achievements.</a> Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+dip-pen+nanolithography.">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li><li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithography+and+nanochemistry:+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices.">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li><li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation.">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li><li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template.">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li></ol>

אין לנו אינטרסים מסחריים כדי לגלות.

בפרוטוקול זה, אנו משמשים מכשיר microfluidic זמין מסחרי (דביקת שקופיות Chemotaxis 3D מIbidi) כדי לחקור את ההשפעות של משטחי שינוי כימי והדרגות chemoattractant על ​​נדידת תאים. התקנת microfluidic זה אינה דורשת זרימה בגלל השיפוע הוא הוקם על ידי דיפוזיה לאורך הערוץ. זה חשוב כי תזרים יכול להשפיע באופן דיפרנציאלי תאים נודדים לאט כגון פיברובלסטים שיוצרים הידבקויות מוקד יציבות ותאים נודדים מהירים כמו רוב leukocytes שיוצרים מתחמי מוקד קטנים וסינפסות 26. מאמץ גזירה מהזרימה למינרית עשוי להשפיע על היציבות של הידבקות תא לרמזים דבקים וChemotaxis הסלולרי כלפי רמזים מסיסים 27,28. מצאנו הבדלים בהתנהגות נדידה בין תאי אטי הלה וJ774 תאים שנעים במהירות ובכך שהראו כי התקנת microfluidic היא ישימה עבור שני סוגי תאי החסיד וחסיד פחות. השוואות כאלה גם ביהבדל מעניין בין סוגי התאים ד בתגובות הידבקות והגירה לדפוסי משטח שהכילו שני רמזים דבקים (פפטידים או פיברונקטין RGD) ואזורים אנטי עכירות (אזורי PEG). דפוסי משטח נוצרו עם הדפסת microcontact 29 ויתוגרפיה מטבל עט 30,31. הדפסת microcontact היא תהליך פשוט ומהיר יחסית, לשעתק דפוסים. עם זאת, העיצוב והייצור של חותמת PDMS, אשר מושגים על ידי photolithography, הוא יותר מעורב וזמן רב. הוא גם מציג מגבלות משלו בכך שתכונות הקטנות (&lt;5 מיקרומטר) קשה להשיג ותלוי ביחסו של הדפוס. בקיצור, הדפסת microcontact היא אידיאלית עבור דפוסים גדולים עד מאה גודל מיקרון ובניסויים, שבו אותם דפוסים צריכים נוצרו פעמים רבות. מצד השני, לטבול יתוגרפיה הסיכה יכולה לשמש כדי ליצור מיקרון לדפוסי nanoscaled. זה מתאים יותר לנקודתי דפוסמקווים, אם כי קווים יכולים להיות מפוברקים. טובלי יתוגרפיה הסיכה מעניקה חופש גדול יותר בעיצובי דפוס, שכן אין צורך במראש מפוברקים-מסכות, אדונים או בולים. עם זאת, המהירות של תהליך הדפוסים היא איטית, מה שהופך את הדפסתם של אזורים מסורבלים וגישה למכשיר מיוחד גדולים היא קריטית. שתי שיטות הדפוסים רלוונטיות לשיקול בגלל הגודל והצורה של דפוסי קיו דבקים להשפיע על הארגון וההפצה של machineries יומכניים המווסת את נדידת תאים 32,33. בנוסף, ההגבלה של מכשיר microfluidic המסחרי מועסק כאן היא שאורך הערוץ (1 מיקרומטר) אינו ניתן לשינוי ולכן לא ניתן לשלוט בתלילות המרבית של השיפועים הדבקים ומסיסים. אם שיפועים תלולים יותר נחוצים, אחד היה צריך להמציא מכשיר microfluidic עם ערוץ קצר בין שני המאגרים. יתרון מרכזי של הפרוטוקול המתואר כאן הוא עיצוב מודולרי, כך שsu השונהrfaces, chemistries משטח, גישות ודפוסי מכשירי microfluidic יכולים להיות משולב עבור מגוון רחב של ניסויי הדמית תא חיים.

נדידת תאי בימוי היא מאפיין בסיסי של תאים רבים והיא היבט מרכזי של תהליכים פיסיולוגיים רבים נורמלים, כולל התפתחות עוברית, הגנה מפני זיהומים וריפוי פצעים. בנוסף, נדידת תאים גם ממלאת תפקיד מרכזי במחלות רבות כגון מחלות לב וכלי דם, גרורות של תאים סרטניים ו1,2 דלקת כרונית. בעוד המדינות הקלסיות של נדידת תאים - הקיטוב, מאריך בליטה, היווצרות הידבקות, דור כוח והנסיגה אחורית - מתקבלות בדרך 3,4, הבהרת מנגנוני חלל ובזמן שבו שילוב האות תואם כבר יותר מאתגר. מטריקס (ECM) משמש כמצע להדבקת תא, ובכימי גלומים 5 ו 6 גיוון פיזי, מספק רמזים כיוונית לתא ניווט 7,8. בנוסף לרמזים האלה דבקים 9, גורמים מסיסים 10-12 &lt;/ Sup&gt; כגון כמוקינים וגורמי גדילה יכולה לגרום לנדידת תאים נוהל באמצעות קולטנים chemoattractant ואיתות motogenic מורד הזרם שלהם. נכון לעכשיו, לא ידוע האם התקשרות ואיתות דרך הקולטנים הידבקות (כלומר integrins) או קולטנים chemoattractant, כגון טירוזין קינאז רצפטור (RTK), הן דומיננטית. זה גם לא ידוע אם היררכיות של מערכות רצפטור הן ספציפיות סוג תא. מיקרוסקופיה תא חייה מעניקה שפע של מידע שאינו נגיש במבחנים בתפזורת וניתן בשילוב עם מכשירי microfluidic לייצר גרדיאנטים של רמזים משותקים 13,14 ומסיסים 15 16. השיטה המתוארת כאן מנצלת סדרה של צעדים פשוטים ומקובלים לשינוי פני שטח בשיתוף עם קאמרי microfluidic זמינה מסחרי כדי ליצור assay הדמיה לנדידת תאים שיכול בקלות להיות מיושמים במעבדת ביולוגיה של תא (איור 1). התאסףמכשיר microfluidic יש איכויות אופטיות הניתנות להשוואה לזכוכית 17 והשיפועים של מולקולות diffusible הם יציבים במשך לפחות 16 שעות. המערכת יכולה לשמש לשיטות מיקרוסקופיה epifluorescence ומתקדמות. בניגוד setups Chemotaxis האחר 18, מערכת זו היא מתאימה להקלטה נודדת לאט תאים, נדבק. חשוב לציין, המערכת היא מודולרית, ומאפשרת בקלות את ההקדמה של דבק חלופי או רמזי הגירה מסיסים ובחינה של סוגי תאים שונים.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

תאים יכולים לחוש ולהעביר לריכוזים גבוהים יותר של רמזים דבקים כגון גליקופרוטאינים של מטריקס ורמזים מסיסים כגון גורמי גדילה. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת שיפועים מנוגדים של רמזים דבקים ומסיסים בתא microfluidic, אשר תואם עם הדמית תא חייה. קופולימר של פולי-L-ליזין ופוליאתילן גליקול (PLL-PEG) הוא מועסק passivate coverslips זכוכית ולמנוע ספיחה הלא ספציפית של ביומולקולות ותאים. , הדפסת microcontact הבאה או לטבול יתוגרפיה עט המשמשת ליצירת רצועות של streptavidin על משטחי פסיבציה לשמש כעיגון נקודות לפפטיד החומצה ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD) biotinylated כמקל דבק. מכשיר microfluidic ממוקם על פני השטח השונים ומשמש ליצירה הדרגתית של רמזים דבקים (100% RGD לRGD 0%) על מסילות streptavidin. לבסוף, באותו המכשיר microfluidic משמש ליצירת שיפוע suc chemoattractantח כסרום עוברי שור (FBS), כאות המסיסה בכיוון ההפוך של השיפוע של רמזים דבקים.

כדי להבין כיצד תא לשלב אותות נודדים 25, פתח שיטה לתמונת תאים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי שנודדים בסביבה עם שיפועים דבקים ומסיסים מתחרים (איור 1). רצועות דבקות שהכילו streptavidin ניאון וRGD biotinylated נוצרו עם רצועות microcontact המודפסות ולטבול יתוגרפיה העט (איור 2). הדפסת microcontact מוצלחת מצוינת על ידי קו הפרופיל של עוצמת הקרינה שבו חוצה את מסילת פסי דבק ואזורים אנטי עכירות יכולים בבירור ניתן להבדיל (האיור 2b). הנקודות מודפסות עם מטבל יתוגרפיה העט להיראות עגול, לא לקרוע צורה, המציין תהליך הדפסה מוצלחת. כימיה של פני שטח ולחות משפיעות על התוצאות של תהליך ההדפסה. באופן כללי, יותר הידרופובי על פני השטח הם, טוב יותר את תוצאות ההדפסה. שיפוע של רמזים דבקיםעל המסלול המודפס נוצרו עם מכשיר מיקרופלואידיקה פשוטה על ידי טעינת ביוטין-4-fluorescein וביוטין RGD-לצד השני של תא microfluidic (3 איור). מכיוון ששתי המולקולות נקשרות תחרותית למסלול streptavidin על משטח הזכוכית, שיפוע משותק של ligands RGD שנוצר. לאחר הסרת פתרון RGD יוטין ביוטין /, באותו חדר יכול לשמש כדי להציג את שיפוע מסיס, שהוא יציב בתוך ערוץ microfluidic עבור לפחות 16 שעות (איור 4). אנחנו הצגנו תאי הלה לקאמרי עם שיפוע chemoattractant, שעבורו FBS היה בשימוש. בצפיפויות נמוכות, תאי הלה דבקו מעדיפים ולנדדו על פסי streptavidin / RGD (תאי N = 50) ונמנעו מאזורי PEG אנטי העכירות (תאי N = 19). העמדה של תאים בודדים נרשמה מעל 16 שעות ונתחה עם תוכנת מעקב סלולרי. בניסוי שבו דבק וsoluשיפועי ble מתנגדים זה לזה (איור 5), את המסלולים של תאים בודדים הראו כי יותר תאי הלה נדדו לכיוון המקור של (העקבות האדומות באיור 5c, N = עקבות 36) chemoattractant מכיוון ריכוזים גבוהים יותר של RGD חסיד (שחור עקבות באיור 5c, N = 14) עקבות. המרחק הממוצע שתאים נדדו נגד (עקבות שחורות) או ב( עקבות אדומות) לכיוון שיפוע FBS (x-מרכיב של עקירה ממוצעת של כל מסלול) היו 0.1700 ± 0.1172 0.2278 ו± 0.1280, בהתאמה (p &lt;0.0001, סטודנטים מבחן t) למרות שלא היה הבדל משמעותי סטטיסטי בתזוזה ממוצעת בין העקבות השחורות (56.18 ± 32.27 מיקרומטר) ואת העקבות האדומות (72.86 ± 45.05 מיקרומטר, P&gt; 0.05, סטודנטי מבחן t). תאי הלה נודדים עם מהירות ממוצעת של 17.47 ± 4.72 מיקרומטר / שעה בנוכחות שניהם השיפוע של דבקרמז רמז (כלומר RGD) ומסיס (כלומר FBS). הנתונים מצביעים על כך שכן לתאי הלה, שיפוע FBS מקובע את הכיוון של הגירה ואילו תאים לשמור על מהירות הגירה פנימית על פסי הדבק. גם הערכנו את ההגירה של שורת תאי macrophage J774. בהעדר שיפועים דבקים ומסיסים, תאים אלו נודדים במהירות גבוהה בהרבה (38.55 ± 17.88 מיקרומטר / שעה) מאשר תאי הלה (16.47 ± 4.28 מיקרומטר / שעה) אבל עם התמדה פחות כלומר כיוון שינוי התאים J774 (הכיווניות של 0.059 ± 0.091 ), נמדד כיחס של עקירה כדי לעקוב אחר אורך לעתים קרובות יותר מאשר תאי הלה (0.57 ± 0.12) על פסי פיברונקטין microcontact מודפסת. J774 תאים גם פחות תלוי קשר מתאי הלה. התזוזה של J774 תאים הייתה גבוהה יותר באזורי PEG (102.20 ± 54.73 מיקרומטר) מאשר במסלולי פיברונקטין (42.95 ± 39.90 מיקרומטר). בנוסף, תאים של J774ppeared להסתגל לכימיה של פני שטח שונה על ידי שינוי המנגנון של הגירה מmesenchymal לamoeboid. לסיכום, רמזים דבקים הם לא חשובים כמו לJ774 תאים כפי שהם עבור תאי הלה. שני סוגי התאים נדדו מעדיפים לכיוון של המקל המסיס. <img alt="איור 1" fo:content-src="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50310/50310fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50310/50310fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של תהליך הייצור של התקנת microfluidic המאפשר הדמיה של תאים נודדים להגיב לשיפועים מנוגדים של רמזים דבקים לעומת מסיסים.. Coverslips מזכוכית עם פסיבציה biotinylated PLL-PEG. ב. דפוסי דבקים המכילים streptavidin ניאון מודפסים על biotinylated משטח או כשורות באמצעות הדפסת microcontact (ב) או נקודות באמצעות טבילת יתוגרפיה העט (ב &#39;). ג. </sטרונג&gt; המשטח השונה מחובר לחלקו התחתון של מכשיר microfluidic. הדרגתיים של משותק ביוטין-RGD נוצרים באמצעות המאגר I ו-II. ד. תאים ושיפוע chemoattractant מסיס של 0-10% FBS נטען לתוך מכשיר microfluidic. לאחר תאים לדבוק פני השטח, לחיות נדידת תאים מעל שיפועי RGD על פסי streptavidin ובנוכחות הדרגתית FBS ניתן הדמיה בערוץ המחבר בין שני מאגרים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50310/50310fig2.jpg" /> איור 2. דפוסים דבקים סלולריים (קווים ונקודות) יכולים להיות שנוצרו עם שתי טכניקות הדפסה שונות תמונה של פלורסנט microcontact מודפסת AlexaFluor350 streptavidin מסלולים (ABS: 346 ננומטר, ארן: 442 ננומטר, אפור).. על coverslips זכוכית-PEG המצופה PLL. מסכת הדפסת microcontract תוכננה כקווים שהיו ברוחב של 100 מיקרומטר עם 290 מיקרומטר מרכז ללסה&quot;נnter חלל. ב. עוצמת הניאון הממוצעת של microcontact מודפסת מסלולי streptavidin, כפי שמוצגים ב, מחמישה משטחים נפרדים כחתכים מלמעלה עד למטה. רוחבו הממוצע של המסלול הוא 90 ± 6 מיקרומטר ואת המרווח הממוצע מרכז למרכז הוא 293 ± 2 מיקרומטר. ג. תמונת brightfield של נקודתי streptavidin המכילים נוצרו עם מטבל יתוגרפיה העט. בקטרים ​​של הנקודות נעים 6-9 מיקרומטר עם 15 מיקרומטר חלל מרכז למרכז. ברי היקף וב ג הם 100 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50310/50310fig3.jpg" /> איור 3. ביוטין-4-fluorescein שיפוע (0 מיקרוגרם / μl - 0.03 מיקרוגרם / μl). חברה במשטחי זכוכית מצופים באופן אחיד עם streptavidin ביוטין-4-fluorescein וביוטין-RGD הועמסו בשני המאגר של מכשיר microfluidic (-Slide הדביק Chemotaxis 3D , Ibidi) שהםמחובר בתעלה ארוכה 1 מ&quot;מ. לאחר דגירת 1 שעות, המכשיר נשטף עם PBS ומילא עם PBS.. 60 תמונות פסיפס נלקחו באורך כולל תמונה 3072 מיקרומטר וב עוצמת הקרינה נמדדה על פני האורך של כל הפסיפס. קווי מגמה לינארית הותאמו לעוצמת קרינה כדי לציין את שיפוע RGD בערוץ. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50310/50310fig4.jpg" /> איור 4. עוצמת הקרינה של fluorescein שיפוע (0 - 1 מיקרומטר מיקרומטר) בערוץ microfluidic מייד לאחר התקנה (ט = 0 שעות) ולאחר דגירה ב 16 שעות PBS בלי ועם 1 מיקרומטר fluorescein נטען מימין ומהשמאל. מאגר של מכשיר microfluidic (דביקת שקופיות Chemotaxis 3D, Ibidi), בהתאמה. ערוץ microfluidic הוא 1 מ&quot;מ באורך ובהוא נמצא בעמדה 50 עד 1050 מיקרומטר. השיפוע היה יציב במשך לפחות 16 שעות. <img alt="איור 5" fo:content-src="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50310/50310fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50310/50310fig5.jpg" /> איור 5. הגירת הלה תא במיקרופלואידיקה קאמרית (דביקה שקופיות Chemotaxis 3D, Ibidi) עם התנגדות שיפוע דבק (משותק RGD על פסי streptavidin) ושיפוע מסיס (0-10% FBS).. תמונה מייצגת של תאים בתא עם מיקרופלואידיקה התנגדות הדרגתית. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. b תמונות זמן לשגות של תא נלקח עם מיקרוסקופ epifluorescence (ניקון TI-E). תמונות צולמו במרווחים של 15 דקות ל20 שעות ומסלול תא (קו כחול) שהושג באמצעות מיצוב centroid תא (תוסף מעקב הידני ImageJ). סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. ג מסלול. סלולרי מתמונות כפי שמוצג בב. התא trajectories שהגר לריכוז הגבוה יותר של FBS המסיס מוצגים באדום (עקבות N = 36); מסלולים סלולריים שהגרו לריכוזים גבוהים יותר של RGD חסיד מוצגים בשחור (עקבות n = 14). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50310/50310fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Views.  The University of New South Wales. שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

Video: Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

החדרת גמישה עצביות בדיקות באמצעות אלמנטים קשיחות קשיחים מצורפים עם Biodissolvable דבק

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...