המחברים מודים W. שמש וק Jansen לדיונים הביקורתיים, ומכירים תמיכה על ידי מעבדת ביומכניקה Nano באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. NAK מודה תמיכה על ידי מארי קירי IIF מלגה.

קציר 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג MD-MBA-231 תאים מ37 ° C, החממה 5% CO 2. ניתוק תאים מצלחת תרבית רקמה באמצעות 0.5% פתרון טריפסין- EDTA. השתמש 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA לתאים בתרבית בבקבוק T25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב × 200 גרם במשך 4 דקות, לשאוב supernatant, ותאי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור צפיפות תאים, ρ, באמצעות hemocytometer. הערה: כדי להכין את הג&#39;ל הפנימי התא-זרע, ההשעיה התא תהיה בהמשך להיות מדולל 10 × להגיע צפיפות זריעת תא הסופית. לכן, נדרש 10 × השעיה תא מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח הבינוני הנדרש כדי להשיג ריכוז 10 × תא: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> הערה: צפיפות זריעת תא סופית, ג סופי, של כ 215; 10 6 תאים / מיליליטר מומלץ לMD-MBA-231 תאים ומשמש בפרוטוקול זה. צפיפות זריעה אחרת גם יכולה להיות חוקרים לסוגי תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה עוד פעם אחת בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב × 200 גרם במשך 4 דקות, ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בכמות הנדרשת (מדיום V מחושבים בשלב 1.3) של מדיום תרבית תאים ללא סרום ביסודיות כדי למזער clumping תא. הערה: פנול אדום הוא auto-ניאון, ויכולים להפריע להדמית הקרינה / החזרה. שימוש במדיום ללא פנול אדום עשוי להיחשב להשגת איכות תמונה הטובה ביותר. </li></ol> 2. הכנת פתרונות קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את פתרון קולגן המניות, 10 × חיץ PBS, מילי-Q H 2 O, 0.1 M NaOH, וכמה צינורות microcentrifuge. שמור את כל על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם, ולשמור על מצב סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן זכוכית סטריליתצלחת תחתית על ידי ההתחממות מראש בחממת 37 ° C. הערה: כל הכרכים בפרוטוקול זה כבר מותאם למנת זכוכית תחתונה עם 12 מ&quot;מ גם. אם נעשה שימוש בסוג מנה אחר, להתאים את הכרכים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח הנדרש הדרוש כדי להכין 50 μl של 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון קולגן לג&#39;ל הפנימי (אני פתרון) המבוסס על מניית קולגן הריכוז. הערה: ניתן להשתמש גם בריכוזי קולגן אחרים לג&#39;ל הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי), להוסיף באיטיות 5 μl של 10 × חיץ PBS לכמות הנדרשת של מניות פתרון קולגן (מחושבת בשלב 2.3) עם מתערבל עדין. תשמור על עצמך, כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של התערובת ל -7.4 באמצעות 0.1 M NaOH באמצעות pH מטר מכויל. כמדריך גס, השתמש כ -5 μl להביא קרוב pH 7.4 (הסכום משתנה בהתאם לריכוז המניות וpH). הערה: שים לב שהכרכים מעורבים בזההצעד קטן מדי לשימוש במד pH סטנדרטי. השתמש באחד הטריקים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות קולגן לדוגמאות רבות. התאם את ה- pH בכמות גדולה באמצעות מד pH סטנדרטי ולהפיץ את פתרונות קולגן פני הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשנות את ה- pH של פתרון קולגן בנפח גדול יותר (i. דואר., נפח המאפשר שימוש במד pH סטנדרטי). שים לב לכמות של NaOH הדרוש כדי להביא את ה- pH ל pH הסופי. להקטין את הכמויות ולהשתמש בכמות המתאימה של NaOH לניסוי. אשר את ערך ה- pH משתמש בנייר לקמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרת, להשתמש אלקטרודת מיקרו כדי להתאים את ה- pH של כמויות קטנות באופן מדויק יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הפתרון להיקף של 45 μl באמצעות H 2 O. לבצע את כל הצעדים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם. </li></ol> 3. כינונה של קונצנטריים ג&#39;ל תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחת הזכוכית תחתונה המחוממת מראש (ראה שלב 2.2) מהחממת דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של ההשעיה 10 × המרוכז התא (מוכנה בשלב 1.5) לפתרון I. Resuspend ביסודיות. תשמור על עצמך, כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. התערובת עכשיו יש נפח של 50 μl ומכילה את הריכוז הסופי קולגן (2.4 מ&quot;ג / מיליליטר) וצפיפות תאים (c = 2 × 10 6 תאים / מיליליטר סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפתרון המכיל תאים שאני לאט לאט למרכז היטב, כך שהיא מהווה טיפה (איור 1 א) בצורה כיפה. תשמור על עצמך כדי למנוע היווצרות בועה בשלב זה. אם צורות בועה, בזהירות אבל במהירות מנסה גם לפגוע בו או למצוץ אותו החוצה באמצעות קצה פיפטה. מניח בעדינות את הצלחת בחזרה בחממה כדי לאפשר את הג&#39;ל הפנימי פלמר במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן O פתרון (לג&#39;ל קולגן החיצוני, acellular) כ -15 דקות לפני תום שלב דגירה זה. הערה: מצב ג&#39;ל החיצוני יכול להיות מגוון במונחים של ריכוז קולגן וpH פילמור ללהשיג ברשתות עם microstructures שונה 10. בפרוטוקול זה, יתמקד ב1.5-4.0 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;ל קולגן polymerized בpH של 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על מניית קולגן הריכוז, לחשב את הנפח הנדרש הדרוש כדי להכין 200 μl של O פתרון קולגן בריכוז הסופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 10 × PBS חיץ לאט את הכמות הנדרשת של מניות פתרון קולגן (מחושב בשלב 3.4) עם מתערבל עדין. התאם את ה- pH של התערובת לpH הסופי באמצעות 0.1 M NaOH עם השימוש של pH מטר מכויל. ראה הערה לצעד 2.5 לגבי התאמת pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הפתרון לנפח סופי של 200 μl באמצעות H 2 O. לבצע את כל הצעדים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה לאחר 45 דקות של פילמור ג&#39;ל הפנימי (ראה שלב 3.3). בעדינות להוסיף 180 μl של O פתרון על גבי ג&#39;ל הפנימי, כך שהפתרון מכסה לחלוטין פנימיג &#39;ומתמלא היטב (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שלב זה בזהירות מבלי ערבוב הפתרון, אשר יכול להוביל לכיווני סיבים לא אחידים בג&#39;ל החיצוני. תשמור על עצמך כדי להימנע מלגעת בג&#39;ל הפנימי עם קצה פיפטה, וכדי למנוע את היווצרותן של בועות או כיסי אוויר. אם צורות בועה, בזהירות אבל במהירות מנסה גם לפגוע בו או למצוץ אותו החוצה באמצעות קצה פיפטה. מניח בעדינות את הצלחת בחזרה בחממה כדי לאפשר לפלמר ג&#39;ל החיצוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה לאחר 45 דקות של פילמור. ג&#39;ל צריך להיות כבר התגבש למדי בשלב זה, למרות שהוא עדיין יכול להתנתק מהמשטח התחתון אם טופל בגסות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות יוצק 2 מיליליטר של מדיום תרבית תאים חימם לצלחת (איור 1 ג). לוודא כי ג&#39;ל הוא שקוע לחלוטין בטווח הבינוני. רענן הבינוני כל 2-3 ימים לכל אורכה של התרבות. </li></ol></li></ol> 4. Live- תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצוידים ביכולת Live- תא הדמיה לטווח ארוך. כולל מובנה בתא דגירה עם טמפרטורה (37 ° C) ובקרת CO 2 (5%). לעבור על המיקרוסקופ ולחמם את הבמה שעה לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. הערה: עדשה אובייקטיבית שימוש עם מרחק עבודה ארוך כדי לייעל את התצפית ולוקליזציה של תאים בג&#39;לים 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;ל במדיום המכיל 5 μl של צבע גשש תא ניאון למשך 30 דקות כדי לאפשר לוקליזציה מדויקת של התאים במערכת 3D. בהמשך לכך, להסיר צבע מאוגד על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 1 × PBS. לאחר מכן, להוסיף בינוני תרבות תאים לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ (1D איור). הערה: הדמיה תא חי יכולה להתחיל בעיקרון מייד לאחר פילמור של ג&#39;ל החיצוני. עם זאת, בשלב זה, התאים in ג&#39;ל הפנימי לא התפשט עדיין. כדי לבחון את ההגירה של התאים הראשונים שפלשו ג&#39;ל החיצוני, Live- תא הדמיה יכולה להתחיל 24 שעות (תלוי בסוג התא) לאחר תחילתה של התרבות. כמדריך גס, סביב 12 - 14 ימים של התרבות יש צורך ברוב של התאים בג&#39;ל הפנימי להיכנס לג&#39;ל החיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרכים נבחרים של צפה (vov של) באזורים בג&#39;ל החיצוני המקיף את הג&#39;ל הפנימי. לאחר 24 שעות של דגירה, אוכלוסיית התא התפשטה, חצה את הממשק בין ג&#39;לי הפנימי וחיצוני, והתחיל לפלוש ג&#39;ל החיצוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לvov של, כוללים אזורי ג&#39;ל מייד ליד ממשק ג&#39;ל, אזורי ביניים, והאזורים הקרובים לoutskirt של ג&#39;ל החיצוני 7. לא לכלול אזורים קרובים מ -50 מיקרומטר מהמשטחים התחתון וצד, כמו גם מהחלק העליון של ג&#39;ל, כדי למנוע תופעות קצה אפשריות. כל vov בדרך כלל מודד 647 × 647 × 100 מיקרומטר 3 (בx, Y, z וכיוונים, בהתאמה), עם מרווח של 5 מיקרומטר -stack z. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו מצבי הדמיה, ערוצים / מסננים, זמני חשיפה, והחלטות תמונה נבחרות בצורה נכונה. עבור הדמיה ללא תווית של רשת קולגן, להשתמש במיקרוסקופ ההחזרה confocal בו-זמנית בLive- תא ההדמיה הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות לדוגמא, העלילה היסטוגרמות העצמה, ולהתאים את הרווחים וקיזוזים להתבונן אות מספיק ולמנוע הרוויה על ידי הבטחה כי היסטוגרמה נמצאת בין אפס והעוצמה מקסימלית. אין לשנות הגדרות אלה יותר לאורך כל תקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של vov של נבחר זמן לשגות, עם מרווח זמן, t Δ, של 10 דקות במשך 8 שעות (או יותר במידת צורך). </li></ol> 5. מעקב סלולארי וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע לאחר עיבוד תמונה כמותי מתמונות -stack z באמצעות appropria<html> תוכנת עיבוד תמונת te. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע הזמן לשגות תמונות כדי לבחור את עמדות תא 3D ב( x, y, z, t) באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מסגרת, לבדוק באופן ידני את דיוק הלוקליזציה ולהסיר חיוביים שגוי בשל פסולת תא ובליטות סלולריות שעשויים להיחשב בטעות לתאים. הסרת תאי שגשוג מהניתוח והתאים חופפים או קשורים פיצול לאובייקטים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מסלולי תא הזמן לשגות 3D מקואורדינטות התא (x, y, z, t) שהושגו בשלב הקודם על ידי קישור למיקום של כל תא ברצף הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את הרעש אקראי ומערכת על ידי הסרת מסלולים קצרים יותר מאורך מסלול סף (בדרך כלל 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את סחיפת מדגם על ידי הפחתת ההתקות נטו הכולל מהמסלולים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תזוזת תא,Iles / ftp_upload / 52,735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, ומרחק נדידת תאים, <img alt="משוואה 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> , ממסלולי התא הנצפים, שבו הוא וקטור המייצג את מיקום 3D של תא בזמן והוא המספר הכולל של נקודות זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מהירות תא כS = ד / (t Δ • n), כאשר t Δ הוא את מרווח הזמן בין מסגרות. לחשב יווני נדידת תאים (או התמדה) באמצעות P = Δd / ד. מדד פשוט זה של התמדה מרמז כי לP = 0 העקירה נטו היא אפס ולP = 1 המסלול הוא קו ישר כיוונית. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration.">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been largely limited to 2D assays14, while at the same time observing the behavior of the individual cell within the population. For cells that do not naturally migrate in groups or clusters, the assay offers a way to analyze the migratory properties in detail from a large number of cells with diverse local microenvironment, which can provide important insights into the biophysical origins of migration efficiency and directional persistence7,15.
Second, by modifying the gel conditions of the inner and outer gels, one can directly study the effect of matrix mechanics and microstructure on 3D cell migration behavior10. This is especially important, as it is known that cell migration and cancer invasion are highly influenced by matrix mechanics and porosity16,17, and that soft tissues in our body have a very diverse topology18. Moreover, the method is readily adaptable for matrices other than collagen. This is advantageous, as not all cell lines can spread and migrate in collagen-based matrices. A critical step that must be noted is that, to ensure physical connectivity of the gel interface, the formation of the outer gel must be initiated before complete polymerization of the inner gel. Since this is strongly dependent on the specific polymerization kinetics of the gels (also for collagen prepared under different conditions, e.g., concentration, polymerization pH, temperature, cross-linking8), an optimal polymerization duration should first be systematically identified. Imperfections in the interfacial connectivity between the inner and outer gel usually results in a gap and collection of the spreading cell population in the interface. Note, however, that perfect interfacial connectivity can introduce a practical problem: the boundary between the inner and outer gels becomes less obvious when imaging. If necessary, sparse fiducial markers, such as inert beads, can be used to distinguish the inner and outer gels.
Third, the possibility of long-term 3D culture (up to 3 weeks in our laboratory) and live-cell imaging allows a wide application of the assay. It is now possible to obtain spatially-resolved viscoelastic measurements of the local matrices surrounding the cells using microrheological approaches19. Furthermore, our recent study10 reveals that the efficacy of various anti-migratory drugs (administered on the 7th day of the experiment) can be strongly affected by the architecture and stiffness of the matrix (i.e., outer gel). In the future, we plan to use these experimental frameworks to further understand how such effects can arise from the basic molecular mechanisms of cell migration (e.g., cytoskeletal contractility20, extracellular matrix reorganization21, and pericellular proteolysis22).
One limitation of this assay is the asymmetry of the mechanical support: the top surface of the gel is not attached to any solid surface, while the bottom surface adheres to the glass surface of the dish. While edge effects can be avoided simply by excluding cells near the edges, the lack of mechanical support at the top surface can potentially lead to in-plane preferential migration and therefore introduce artificial flattening of the 3D cell trajectories7. One way to solve this issue while still maintaining oxygen and nutrition supply to the cells is by topping the gel with holed glass plate23. Additionally, to further suppress any wall effect, a thin layer of collagen gel can be first made on the glass surfaces, before the formation of the inner and outer gels. This ensures complete geometrical encapsulation of the gels.
To obtain meaningful and accurate description of cell migration behavior, it is important to consider the time scale and the nature of migration, which can vary considerably between cell lines. Preliminary experiments must be systematically performed to understand these factors, and then the interval time between image captures and live-cell imaging duration can be adjusted. The interval time should be no larger than the characteristic time scale of cell turning. It is also important to consider that cell migration behavior may change both spatially and temporally, depending on the biophysical conditions of the local microenvironment7. It is always a good idea to simultaneously visualize the cells and the fibrous matrix, for example using multi-color confocal fluorescence or multimodal (e.g., reflectance, second harmonic generation) imaging. After imaging, post-processing of the time-lapse 3D image, construction of the cell tracks, and analysis of the trajectories can in principle be done with any image processing software.
In conclusion, the concentric gel assay described here provides a simple and useful experimental system for quantitatively studying 3D cell migration, mechanosensing and mechanotransduction in diverse microenvironments.

נדידה של תאים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובות פיסיולוגיות שונות כגון התפתחות עוברית, haemostasis, ותגובה חיסונית, כמו גם בתהליכים פתולוגיים כגון מחלות לב וכלי דם, דלקת, וסרטן 1. לנתח את הגורמים ביוכימיים וbiophysical יסוד נדידת תאים ולכן חשוב ביסודו לא רק כדי להבין את העקרונות הבסיסיים של פונקציות סלולריות, אלא גם לקידום יישומים ביו-רפואיים שונים, כגון בהנדסת רקמות, אנטי-גרורות ופיתוח תרופות אנטי-דלקתי. מאז תצפית in vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית, הרבה מאמצים התמקד בסיכום במבחנה של נדידת תאים. בשיטות מבחנה ללמוד נדידת תאים במידה רבה תוכננו עבור מבחני על שני משטחים ממדיים (2D), שהבולטים בם השריטה או פצע ריפוי assay 2. מבחני כאלה מציעים התקנה ניסיונית פשוטה, קל live-הדמיה תא, ולספק תובנות שימושיות למנגנונים ביוכימיים שונים שבבסיס נדידת תאים. עם זאת, מבחני אלו אינם מהווים מטריצת ארכיטקטורה תאית (ECM) ושיפוץ, שהם היבטים קריטיים בהבנה בהגירה vivo. לאחרונה, זה כבר מוערך יותר ויותר כי מודל תרבות 3D, לעתים קרובות במטריצות מבוססות קולגן 3, מספק פלטפורמה שיותר דומה למצב בvivo. ואכן, תאי תערוכת דינמיקת migrational כי הם שונים מאלה על משטחי 2D, בעיקר בשל ממדית של הסביבה 4 השונים. יתר על כן, את מאפייני biophysical ומכאניים של מטריקס ברגישות משפיעים תא הגירה 5, כוללים בהקשר של תאים סרטניים פלישה 6. כאן, אנו מציגים שיטה ללמוד 3D נדידת תאי התנהגות בECM עם מאפייני biophysical שיכול להיות בקלות מגוונת עם תנאי הכנה. התאיםזורעים ב&quot; ג&#39;ל הפנימי &quot;ולאפשר להם להימלט וללפלוש&quot; ג&#39;ל החיצוני &quot;בתחילה acellular. השיטה מסתמכת על יכולתו של התא להכיר בנוכחותו של, ונטייה להגר ל, אזורי תא ללא בג&#39;ל החיצוני, אשר קשור באופן הדוק לתא mechanosensing 7. במחקר זה, אנו מעסיקים רשתות קולגן כECMS פלש על ידי תאי סרטן השד פולשני מאוד, MD-MBA-231. יכולים להיות מכוון הנכסים ומייקרו של שני ג&#39;לים הפנימיים וחיצוניים מכאניים 8 ומאופיינות 9 כדי להשיג תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. שחזור וניתוח של מסלולי התא מאפשרים בדיקה כמותית מפורטת של הגירת התנהגות spatiotemporal בשתי רמת האוכלוסייה ורמת תא בודדת. חשוב לציין, ההתקנה של מערכת ג&#39;ל קונצנטריים מחקה את in vivo טופולוגיה הרקמה מתמודדת על ידי תאים נודדים, במיוחד פולשים תאים סרטניים, ובכך להציע תובנות חשובות בלמנגנונים הפיזיים של נדידת תאים וגרורות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

היכולת של תאים לנדוד היא חיונית במגוון רחב של פונקציות תא לאורך כל חיים מהתפתחות עוברית וריפוי פצעים לגידול וגרור סרטני. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, העקרונות ביוכימיים וbiophysical הבסיסיים של נדידת תאים עדיין לא הבינו באופן מלא, במיוחד במייקרו-הסביבות הרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תלת ממדי (3D). כאן אנו מתארים assay במבחנה נועד לאפשר בחינה הכמותית של התנהגויות נדידת תאי 3D. השיטה מנצלת את יכולתו של התא mechanosensing ונטייה לנדוד לתוך מטריצה ​​פנויה בעבר תאי (ECM). אנו משתמשים בפלישה של תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד&quot;א MB-231, ג&#39;ל קולגן כמערכת מודל. התפשטות אוכלוסיית תא ודינמיקת ההגירה של תאים בודדים מעל שבועות של התרבות ניתן לנטר באמצעות Live- תא הדמיה וניתחו כדי לחלץ נתונים spatiotemporally נפתרו. יתר על כן, השיטה היא להתאמה בקלות למטריצות תאית מגוונות, ובכך להציע דרך פשוטה אך רבת עוצמה כדי לחקור את תפקידם של גורמי biophysical במייקרו-הסביבה על נדידת תאים.

Assay ג&#39;ל קונצנטריים מוצג כאן בוצע באמצעות תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד&quot;א MB-231, עם 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;ל קולגן הפנימי וצפיפות זריעת תא של = 2 × 10 6 תאים / מיליליטר, כדוגמא. כפי שניתן לראות באיור 2, בדרך כלל אחרי כמה ימים של תרבות, תאי הפר ממשק ג&#39;ל הפנימי-חיצוני והתחילו לפלוש ג&#39;ל החיצוני. אוכלוסיית התא התפשטה בעיקר רדיאלית החוצה. תנאי פילמור של ג&#39;ל החיצוני יכולים להיות שונה כדי ללמוד את התפקיד של תכונות צפיפות ומכאנית של המטריצה ​​על מאפייני נדידת תאים. איור 3 מציג את התנועות של תאים בודדים בג&#39;לים החיצוני של 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר, 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר, ו 4.0 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן, polymerized ב- pH 7.4. הזמן לשגות תמונות confocal נרכשו בגבול בין ג&#39;ל הפנימי והחיצוני במשך 8 שעות, ועקירתם של התאים בשלוש concen קולגן שונהtrations מצויינים בחצים לבנים. בהתאם לשיעור צפיפות זריעת תא ושגשוג, ~ בדרך כלל יכולים להיות שחולצו 200 מסלולי תא בודדים ונותחו בכל דגימה. אנו כמותית ניתחנו את מסלולי תא בריכוזי 3 קולגן השונים במונחים של עקירת נטו ממוצעת, מרחק שעבר, התמדה כיוונית, ואומרים במהירות מעל 8 שעות של הדמיה (איור 4). היה נראה כי משמעות עקירה והמרחק היו גבוהה ביותר עבור 4.0 מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז 58 מיקרומטר ו141.5 מיקרומטר, בהתאמה, למרות שלא היה הבדל משמעותי בעקירה והמרחק בין תאים ב2.4 מ&quot;ג / מיליליטר ו 4.0 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;לי . ב 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;ל, אומר עקירה והמרחק היו הקטנות ביותר. תצפית זו עלולה להופיע לסתור דיווחים אחרונים שמראים שיעילות פלישה יורדת בג&#39;לים עם עלייה בריכוז קולגן 11,12. שים לב, עם זאת, כי ההתקות ומרחקים בassay שלנו נמדדים על כל מסלולי התא הבודדים בתוך אוכלוסייה בעיקר רדיאלית החוצה נודדת. פרמטרים אלה הם אפוא הרבה פחות רגישים לתת-האוכלוסייה של התאים המהירים ביותר הנעה ואינם נשלטו לחלוטין על ידי תנועות סטוכסטיים. בכל המקרים, המרחק הכולל המכוסים (איור 4) היה גדול יותר מאשר העקירה נטו (איור 4 א). הגדרת התמדה פשוט כיחס בין העקירה למרחק, השגנו התמדה של ~ 0.4 בכל תנאי ג&#39;ל (איור 4C). התמדה נמוכה יחסית זה משקפת את ההגירה כיוונית החלשה במהות של התאים בassay שלנו. אנו צופים כי הנוכחות של גירויי chemotactic כיוונית או הדרגתיים ביוכימיים תגדיל את ההתמדה, שעלול להיות באופן תלוי ריכוז קולגן. יתר על כן, אנחנו גם ציינו כי המהירות הממוצעת של נדידת תאים לא השתנתה באופן משמעותי wiריכוז ה קולגן (איור 4D), סביר להניח בגלל יחסי הגומלין בין נוקשות מטריצה ​​(שעולה עם ריכוז קולגן) וגודל נקבובית (שיורד עם ריכוז קולגן) 10, כמו גם הווריאציה spatiotemporal של מאפייני הגירה בתוך אוכלוסיית תא 7. המהירות הממוצעת נעה בין 31 מיקרומטר / hr ו37.5 מיקרומטר / hr, עם מהירות מינימאלית תאים בודדות של 7 מיקרומטר / hr ומהירות תא בודד מרבי של 114 מיקרומטר / hr. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52735/52735fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של השלבים כרוכים בהקמת assay הגירת 3D ג&#39;ל קונצנטריים. () גיבוש ג&#39;ל קולגן הפנימי במרכז גם בצלחת הזכוכית תחתונה, המכיל את התאים. (ב) גיבוש ג&#39;ל קולגן החיצוני המתמצת את פנימי (acellular)ג&#39;ל. (C) טבילה של ג&#39;לים במדיום תרבית תאים. לאחר מכן התאים מותר לאזן ולצרף למטריצה ​​הסיבית שמסביב. צעד זה יכול לקחת כמה שעות עד היום 1 לאחר תחילת פילמור ג&#39;ל. (ד) Live- תא הדמיה, ניטור הפצה של אוכלוסיית תאים לתוך הג&#39;ל החיצוני. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52735/52735fig2.jpg" /> איור 2. הפצת של אוכלוסיית תא. (א) לאחר 12 ימים של תרבות, מד&quot;א MB-231 תאי פר ממשק ג&#39;ל הפנימי-חיצוני (ירוק קו מקווקו) ופלשו כלפי חוץ לתוך הג&#39;ל במקור acellular החיצוני (בר = 200 מיקרומטר בקנה מידה). האזורים בהירים הם אזורים שנכבשו על ידי תאים, בעוד שהאזורים הכהים הם אזורי תא ללא בתמונה בניגוד שלב זה. המלבנים הצהובים מייצגים את vov של עניין, שבו הפלישה של תאי סרטן 3D הייתה פיקוח. CeLLS היגר בעיקר רדיאלית החוצה, כפי שצוין על ידי החצים Overlay (B) של תמונת confocal הקרינה של מד&quot;א MB-231 תאים הנודדים (אדום; צהוב כאשר עליהן פסאודו בצבע ירוק קולגן). תמונה והחזרה של מטריצת קולגן ( ירוק). החצים מצביעים על כיוון הנדידה של תאים בודדים בתוך פרק זמן של 5 שעות זמן. בר סולם = 50 מיקרומטר. (C) מהזמן לשגות התמונות, ניתן לקבל מסלולים של התאים. הנה מסלולי התא הם לזמן, כפי שצוין על ידי בר הצבע (לוח זמנים = 8 שעות) בצבעים. מעובד מתוך שמש et al 7,10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52735/52735fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52735/52735fig3.jpg" /> איור 3. תנועה נייד בצפיפויות שונות ג&#39;ל קולגן. </stרונג&gt; התנועה של מד&quot;א MB-231 תאים בג&#39;לים חיצוני עם שלושה ריכוזי קולגן החיצוני שונים: 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר, 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר, ו 4.0 מ&quot;ג / מיליליטר. תאים תויגו עם הגשש לחיות תאי CMTMR (אדום). החצים הלבנים מצביעים על התזוזה הנקי של תאים בודדים בתוך 8 שעות של הדמיה. סרגל = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52735/52735fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52735/52735fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח של מסלולי נדידת תאים. מסלולי הנדידה של MD-MBA-231 תאים הבודדים מעל 8 שעות היו לכמת במונחים של מרחק () עקירה נטו, (B), התמדה (C), ו- (ד) אומר מהירות לריכוזים שונים קולגן ג&#39;ל החיצוני: 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר, 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר, ו 4.0 מ&quot;ג /מיליליטר. זמן לשגות תמונות נרכשו ליד הממשק של ג&#39;לים הפנימי וחיצוני. הנתונים הם ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM) המתקבל מלמעלה מ -200 מסלולי תא ב 3 ניסויים בלתי תלויים בכל מצב. כוכבית (*) מציין הבדל מובהק סטטיסטי (p-value &lt;0.01).

Watch this Scientific Journal Video about Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration at JoVE.com

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Views.  FOM Institute AMOLF.  הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר. 

Video: Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

תמיכה מרוכבת במטריצה חוץ-תאית מיקרוג'ל להדפסה תלת-ממדית משובצת של מבנים עצביים אנושיים

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

שימוש במערכי ננו-סיבי פחמן להעברה יעילה של ביומולקולות וצבעים לצמחים

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

מחבר זרקור: שחרור טרנספורמציה של צמחים על ידי חדשנות עם מערכי ננו-סיבי פחמן 

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

שימוש במערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית על מצעים קשיחים או גמישים להעברת ביומולקולות וצבעים לצמחים

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...