המחברים מודים W. שמש וק Jansen לדיונים הביקורתיים, ומכירים תמיכה על ידי מעבדת ביומכניקה Nano באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. NAK מודה תמיכה על ידי מארי קירי IIF מלגה.

קציר 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג MD-MBA-231 תאים מ37 ° C, החממה 5% CO 2. ניתוק תאים מצלחת תרבית רקמה באמצעות 0.5% פתרון טריפסין- EDTA. השתמש 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA לתאים בתרבית בבקבוק T25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב × 200 גרם במשך 4 דקות, לשאוב supernatant, ותאי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור צפיפות תאים, ρ, באמצעות hemocytometer. הערה: כדי להכין את הג&#39;ל הפנימי התא-זרע, ההשעיה התא תהיה בהמשך להיות מדולל 10 × להגיע צפיפות זריעת תא הסופית. לכן, נדרש 10 × השעיה תא מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח הבינוני הנדרש כדי להשיג ריכוז 10 × תא: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> הערה: צפיפות זריעת תא סופית, ג סופי, של כ 215; 10 6 תאים / מיליליטר מומלץ לMD-MBA-231 תאים ומשמש בפרוטוקול זה. צפיפות זריעה אחרת גם יכולה להיות חוקרים לסוגי תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה עוד פעם אחת בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב × 200 גרם במשך 4 דקות, ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בכמות הנדרשת (מדיום V מחושבים בשלב 1.3) של מדיום תרבית תאים ללא סרום ביסודיות כדי למזער clumping תא. הערה: פנול אדום הוא auto-ניאון, ויכולים להפריע להדמית הקרינה / החזרה. שימוש במדיום ללא פנול אדום עשוי להיחשב להשגת איכות תמונה הטובה ביותר. </li></ol> 2. הכנת פתרונות קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את פתרון קולגן המניות, 10 × חיץ PBS, מילי-Q H 2 O, 0.1 M NaOH, וכמה צינורות microcentrifuge. שמור את כל על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם, ולשמור על מצב סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן זכוכית סטריליתצלחת תחתית על ידי ההתחממות מראש בחממת 37 ° C. הערה: כל הכרכים בפרוטוקול זה כבר מותאם למנת זכוכית תחתונה עם 12 מ&quot;מ גם. אם נעשה שימוש בסוג מנה אחר, להתאים את הכרכים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח הנדרש הדרוש כדי להכין 50 μl של 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון קולגן לג&#39;ל הפנימי (אני פתרון) המבוסס על מניית קולגן הריכוז. הערה: ניתן להשתמש גם בריכוזי קולגן אחרים לג&#39;ל הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי), להוסיף באיטיות 5 μl של 10 × חיץ PBS לכמות הנדרשת של מניות פתרון קולגן (מחושבת בשלב 2.3) עם מתערבל עדין. תשמור על עצמך, כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של התערובת ל -7.4 באמצעות 0.1 M NaOH באמצעות pH מטר מכויל. כמדריך גס, השתמש כ -5 μl להביא קרוב pH 7.4 (הסכום משתנה בהתאם לריכוז המניות וpH). הערה: שים לב שהכרכים מעורבים בזההצעד קטן מדי לשימוש במד pH סטנדרטי. השתמש באחד הטריקים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות קולגן לדוגמאות רבות. התאם את ה- pH בכמות גדולה באמצעות מד pH סטנדרטי ולהפיץ את פתרונות קולגן פני הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לשנות את ה- pH של פתרון קולגן בנפח גדול יותר (i. דואר., נפח המאפשר שימוש במד pH סטנדרטי). שים לב לכמות של NaOH הדרוש כדי להביא את ה- pH ל pH הסופי. להקטין את הכמויות ולהשתמש בכמות המתאימה של NaOH לניסוי. אשר את ערך ה- pH משתמש בנייר לקמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרת, להשתמש אלקטרודת מיקרו כדי להתאים את ה- pH של כמויות קטנות באופן מדויק יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הפתרון להיקף של 45 μl באמצעות H 2 O. לבצע את כל הצעדים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם. </li></ol> 3. כינונה של קונצנטריים ג&#39;ל תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחת הזכוכית תחתונה המחוממת מראש (ראה שלב 2.2) מהחממת דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של ההשעיה 10 × המרוכז התא (מוכנה בשלב 1.5) לפתרון I. Resuspend ביסודיות. תשמור על עצמך, כדי למנוע היווצרות בועת אוויר. התערובת עכשיו יש נפח של 50 μl ומכילה את הריכוז הסופי קולגן (2.4 מ&quot;ג / מיליליטר) וצפיפות תאים (c = 2 × 10 6 תאים / מיליליטר סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפתרון המכיל תאים שאני לאט לאט למרכז היטב, כך שהיא מהווה טיפה (איור 1 א) בצורה כיפה. תשמור על עצמך כדי למנוע היווצרות בועה בשלב זה. אם צורות בועה, בזהירות אבל במהירות מנסה גם לפגוע בו או למצוץ אותו החוצה באמצעות קצה פיפטה. מניח בעדינות את הצלחת בחזרה בחממה כדי לאפשר את הג&#39;ל הפנימי פלמר במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן O פתרון (לג&#39;ל קולגן החיצוני, acellular) כ -15 דקות לפני תום שלב דגירה זה. הערה: מצב ג&#39;ל החיצוני יכול להיות מגוון במונחים של ריכוז קולגן וpH פילמור ללהשיג ברשתות עם microstructures שונה 10. בפרוטוקול זה, יתמקד ב1.5-4.0 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;ל קולגן polymerized בpH של 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על מניית קולגן הריכוז, לחשב את הנפח הנדרש הדרוש כדי להכין 200 μl של O פתרון קולגן בריכוז הסופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 10 × PBS חיץ לאט את הכמות הנדרשת של מניות פתרון קולגן (מחושב בשלב 3.4) עם מתערבל עדין. התאם את ה- pH של התערובת לpH הסופי באמצעות 0.1 M NaOH עם השימוש של pH מטר מכויל. ראה הערה לצעד 2.5 לגבי התאמת pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הפתרון לנפח סופי של 200 μl באמצעות H 2 O. לבצע את כל הצעדים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן המוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה לאחר 45 דקות של פילמור ג&#39;ל הפנימי (ראה שלב 3.3). בעדינות להוסיף 180 μl של O פתרון על גבי ג&#39;ל הפנימי, כך שהפתרון מכסה לחלוטין פנימיג &#39;ומתמלא היטב (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שלב זה בזהירות מבלי ערבוב הפתרון, אשר יכול להוביל לכיווני סיבים לא אחידים בג&#39;ל החיצוני. תשמור על עצמך כדי להימנע מלגעת בג&#39;ל הפנימי עם קצה פיפטה, וכדי למנוע את היווצרותן של בועות או כיסי אוויר. אם צורות בועה, בזהירות אבל במהירות מנסה גם לפגוע בו או למצוץ אותו החוצה באמצעות קצה פיפטה. מניח בעדינות את הצלחת בחזרה בחממה כדי לאפשר לפלמר ג&#39;ל החיצוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה לאחר 45 דקות של פילמור. ג&#39;ל צריך להיות כבר התגבש למדי בשלב זה, למרות שהוא עדיין יכול להתנתק מהמשטח התחתון אם טופל בגסות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות יוצק 2 מיליליטר של מדיום תרבית תאים חימם לצלחת (איור 1 ג). לוודא כי ג&#39;ל הוא שקוע לחלוטין בטווח הבינוני. רענן הבינוני כל 2-3 ימים לכל אורכה של התרבות. </li></ol></li></ol> 4. Live- תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצוידים ביכולת Live- תא הדמיה לטווח ארוך. כולל מובנה בתא דגירה עם טמפרטורה (37 ° C) ובקרת CO 2 (5%). לעבור על המיקרוסקופ ולחמם את הבמה שעה לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. הערה: עדשה אובייקטיבית שימוש עם מרחק עבודה ארוך כדי לייעל את התצפית ולוקליזציה של תאים בג&#39;לים 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;ל במדיום המכיל 5 μl של צבע גשש תא ניאון למשך 30 דקות כדי לאפשר לוקליזציה מדויקת של התאים במערכת 3D. בהמשך לכך, להסיר צבע מאוגד על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 1 × PBS. לאחר מכן, להוסיף בינוני תרבות תאים לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת מן החממה ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ (1D איור). הערה: הדמיה תא חי יכולה להתחיל בעיקרון מייד לאחר פילמור של ג&#39;ל החיצוני. עם זאת, בשלב זה, התאים in ג&#39;ל הפנימי לא התפשט עדיין. כדי לבחון את ההגירה של התאים הראשונים שפלשו ג&#39;ל החיצוני, Live- תא הדמיה יכולה להתחיל 24 שעות (תלוי בסוג התא) לאחר תחילתה של התרבות. כמדריך גס, סביב 12 - 14 ימים של התרבות יש צורך ברוב של התאים בג&#39;ל הפנימי להיכנס לג&#39;ל החיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרכים נבחרים של צפה (vov של) באזורים בג&#39;ל החיצוני המקיף את הג&#39;ל הפנימי. לאחר 24 שעות של דגירה, אוכלוסיית התא התפשטה, חצה את הממשק בין ג&#39;לי הפנימי וחיצוני, והתחיל לפלוש ג&#39;ל החיצוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לvov של, כוללים אזורי ג&#39;ל מייד ליד ממשק ג&#39;ל, אזורי ביניים, והאזורים הקרובים לoutskirt של ג&#39;ל החיצוני 7. לא לכלול אזורים קרובים מ -50 מיקרומטר מהמשטחים התחתון וצד, כמו גם מהחלק העליון של ג&#39;ל, כדי למנוע תופעות קצה אפשריות. כל vov בדרך כלל מודד 647 × 647 × 100 מיקרומטר 3 (בx, Y, z וכיוונים, בהתאמה), עם מרווח של 5 מיקרומטר -stack z. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו מצבי הדמיה, ערוצים / מסננים, זמני חשיפה, והחלטות תמונה נבחרות בצורה נכונה. עבור הדמיה ללא תווית של רשת קולגן, להשתמש במיקרוסקופ ההחזרה confocal בו-זמנית בLive- תא ההדמיה הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות לדוגמא, העלילה היסטוגרמות העצמה, ולהתאים את הרווחים וקיזוזים להתבונן אות מספיק ולמנוע הרוויה על ידי הבטחה כי היסטוגרמה נמצאת בין אפס והעוצמה מקסימלית. אין לשנות הגדרות אלה יותר לאורך כל תקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של vov של נבחר זמן לשגות, עם מרווח זמן, t Δ, של 10 דקות במשך 8 שעות (או יותר במידת צורך). </li></ol> 5. מעקב סלולארי וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע לאחר עיבוד תמונה כמותי מתמונות -stack z באמצעות appropria<html> תוכנת עיבוד תמונת te. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע הזמן לשגות תמונות כדי לבחור את עמדות תא 3D ב( x, y, z, t) באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מסגרת, לבדוק באופן ידני את דיוק הלוקליזציה ולהסיר חיוביים שגוי בשל פסולת תא ובליטות סלולריות שעשויים להיחשב בטעות לתאים. הסרת תאי שגשוג מהניתוח והתאים חופפים או קשורים פיצול לאובייקטים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור מסלולי תא הזמן לשגות 3D מקואורדינטות התא (x, y, z, t) שהושגו בשלב הקודם על ידי קישור למיקום של כל תא ברצף הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את הרעש אקראי ומערכת על ידי הסרת מסלולים קצרים יותר מאורך מסלול סף (בדרך כלל 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את סחיפת מדגם על ידי הפחתת ההתקות נטו הכולל מהמסלולים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תזוזת תא,Iles / ftp_upload / 52,735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, ומרחק נדידת תאים, <img alt="משוואה 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> , ממסלולי התא הנצפים, שבו הוא וקטור המייצג את מיקום 3D של תא בזמן והוא המספר הכולל של נקודות זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מהירות תא כS = ד / (t Δ • n), כאשר t Δ הוא את מרווח הזמן בין מסגרות. לחשב יווני נדידת תאים (או התמדה) באמצעות P = Δd / ד. מדד פשוט זה של התמדה מרמז כי לP = 0 העקירה נטו היא אפס ולP = 1 המסלול הוא קו ישר כיוונית. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration.">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

נדידה של תאים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובות פיסיולוגיות שונות כגון התפתחות עוברית, haemostasis, ותגובה חיסונית, כמו גם בתהליכים פתולוגיים כגון מחלות לב וכלי דם, דלקת, וסרטן 1. לנתח את הגורמים ביוכימיים וbiophysical יסוד נדידת תאים ולכן חשוב ביסודו לא רק כדי להבין את העקרונות הבסיסיים של פונקציות סלולריות, אלא גם לקידום יישומים ביו-רפואיים שונים, כגון בהנדסת רקמות, אנטי-גרורות ופיתוח תרופות אנטי-דלקתי. מאז תצפית in vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית, הרבה מאמצים התמקד בסיכום במבחנה של נדידת תאים. בשיטות מבחנה ללמוד נדידת תאים במידה רבה תוכננו עבור מבחני על שני משטחים ממדיים (2D), שהבולטים בם השריטה או פצע ריפוי assay 2. מבחני כאלה מציעים התקנה ניסיונית פשוטה, קל live-הדמיה תא, ולספק תובנות שימושיות למנגנונים ביוכימיים שונים שבבסיס נדידת תאים. עם זאת, מבחני אלו אינם מהווים מטריצת ארכיטקטורה תאית (ECM) ושיפוץ, שהם היבטים קריטיים בהבנה בהגירה vivo. לאחרונה, זה כבר מוערך יותר ויותר כי מודל תרבות 3D, לעתים קרובות במטריצות מבוססות קולגן 3, מספק פלטפורמה שיותר דומה למצב בvivo. ואכן, תאי תערוכת דינמיקת migrational כי הם שונים מאלה על משטחי 2D, בעיקר בשל ממדית של הסביבה 4 השונים. יתר על כן, את מאפייני biophysical ומכאניים של מטריקס ברגישות משפיעים תא הגירה 5, כוללים בהקשר של תאים סרטניים פלישה 6. כאן, אנו מציגים שיטה ללמוד 3D נדידת תאי התנהגות בECM עם מאפייני biophysical שיכול להיות בקלות מגוונת עם תנאי הכנה. התאיםזורעים ב&quot; ג&#39;ל הפנימי &quot;ולאפשר להם להימלט וללפלוש&quot; ג&#39;ל החיצוני &quot;בתחילה acellular. השיטה מסתמכת על יכולתו של התא להכיר בנוכחותו של, ונטייה להגר ל, אזורי תא ללא בג&#39;ל החיצוני, אשר קשור באופן הדוק לתא mechanosensing 7. במחקר זה, אנו מעסיקים רשתות קולגן כECMS פלש על ידי תאי סרטן השד פולשני מאוד, MD-MBA-231. יכולים להיות מכוון הנכסים ומייקרו של שני ג&#39;לים הפנימיים וחיצוניים מכאניים 8 ומאופיינות 9 כדי להשיג תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. שחזור וניתוח של מסלולי התא מאפשרים בדיקה כמותית מפורטת של הגירת התנהגות spatiotemporal בשתי רמת האוכלוסייה ורמת תא בודדת. חשוב לציין, ההתקנה של מערכת ג&#39;ל קונצנטריים מחקה את in vivo טופולוגיה הרקמה מתמודדת על ידי תאים נודדים, במיוחד פולשים תאים סרטניים, ובכך להציע תובנות חשובות בלמנגנונים הפיזיים של נדידת תאים וגרורות.

<table><tbody><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>Model: 371, S/No 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1R</td><td></td><td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottom dish</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td><td></td></tr><tr><td>Microprocessor pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>Nutragen Collagen</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>#5010-D</td><td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sartorius</td><td>S/No 29153352</td><td>Basic pH Meter PB-11</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

היכולת של תאים לנדוד היא חיונית במגוון רחב של פונקציות תא לאורך כל חיים מהתפתחות עוברית וריפוי פצעים לגידול וגרור סרטני. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, העקרונות ביוכימיים וbiophysical הבסיסיים של נדידת תאים עדיין לא הבינו באופן מלא, במיוחד במייקרו-הסביבות הרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תלת ממדי (3D). כאן אנו מתארים assay במבחנה נועד לאפשר בחינה הכמותית של התנהגויות נדידת תאי 3D. השיטה מנצלת את יכולתו של התא mechanosensing ונטייה לנדוד לתוך מטריצה ​​פנויה בעבר תאי (ECM). אנו משתמשים בפלישה של תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד&quot;א MB-231, ג&#39;ל קולגן כמערכת מודל. התפשטות אוכלוסיית תא ודינמיקת ההגירה של תאים בודדים מעל שבועות של התרבות ניתן לנטר באמצעות Live- תא הדמיה וניתחו כדי לחלץ נתונים spatiotemporally נפתרו. יתר על כן, השיטה היא להתאמה בקלות למטריצות תאית מגוונות, ובכך להציע דרך פשוטה אך רבת עוצמה כדי לחקור את תפקידם של גורמי biophysical במייקרו-הסביבה על נדידת תאים.

Assay ג&#39;ל קונצנטריים מוצג כאן בוצע באמצעות תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד&quot;א MB-231, עם 2.4 מ&quot;ג / מיליליטר ג&#39;ל קולגן הפנימי וצפיפות זריעת תא של = 2 × 10 6 תאים / מיליליטר, כדוגמא. כפי שניתן לראות באיור 2, בדרך כלל אחרי כמה ימים של תרבות, תאי הפר ממשק ג&#39;ל הפנימי-ח...

Watch this Scientific Journal Video about Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration at JoVE.com

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Views.  FOM Institute AMOLF.  הנכסים ומייקרו של המטריצה ​​תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר. 

Video: Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medicine

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

כמו כריך microenvironments לרתום ניידים / חומרי אינטראקציות

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...

מערכת ג'ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video