מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענק R01 EB008268.

1. ייצור שבבים 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את שני לוחות מכדורי Zeonex 690R: להפיץ 8-9 כדורי Zeonex גרם באופן שווה במרכז לוחית מתכת, מחממים על העיתונות המחוממת בעמ &#39;198 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט ל2,500 psi למשך 5 דקות נוספות. כדי להשלים שלב זה, השתמש עיתונות חמה קארבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלטת microfluidic הערוץ בשלט עם עובש אפוקסי. פרטים על ייצור העובש מתוארים במקום אחר 12 (עיצוב ערוץ באיור 2b): לשים שלט אחד על עובש אפוקסי; מחמם אותם בעיתונות המחוממת ב157 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט לpsi 1000 למשך 10 דקות נוספות . הסרת הפלאק מהעובש ביד או באמצעות מלקחיים לפני שהיא מתקררת. (שים לב: ללבוש כפפות תרמיות בשלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים בשבב הבולט בכניסה, יציאת פסולת, והיציאה של ערוץ microfluidic. אנחנו השתמשנו בקוטר 1.25 מ&quot;מeter מקדח להפוך את השלושה חורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ונד שבב המובלט עם שלט אחר (על גבי): לשטוף את השבבים עם IPA, RNAse הרחק ובמי deionized ברצף; אוויר יבש ומחמם אותם בעיתונות המחוממת ב131 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן קש על 350 psi לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף Nanoports בכניסה, הפסולת, ואת היציאות לשקע בנפרד באמצעות JB הוולד אפוקסי; לרפא במשך 15 עד 24 שעות לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את ערוץ SPE עם 50 RNAse חוץ μl, אחריו עם מי nuclease חופשיים μl 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ערוץ SPE עם 4 μl של פתרון ההשתלה (methacrylate תיל עם 3% w / v benzophenone) ולאחר מכן Crosslink methacrylate ידי דוגר למשך 10 דקות בתנור UV תחת אורך גל 365 nm UV ו2000 mJ / 2 סנטימטר. הסר את פתרון השתלת שיירים עם ואקום. אנחנו נצלנו את חלל הריק הקיר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, פתרון טרי צריך להיות בשימוש. זה בדרך כלל מקובל, עם זאת, כדי לאחסןפתרון מוכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון SPE העמודה (כל% v / v): 16% dimethacrylate אתילן, 24% methacrylate וטיל, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol, ולהוסיף 1% -2 dimethylamino-4-(מתיל phenylamino)-פנול כצילום יוזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את אותו הנפח של תמיסת microspheres סיליקה כפתרון עמודת SPE (כדי להפוך תערובת ביחס 1:1), ולייבש אותו לחלוטין ב 70 מעלות צלזיוס למשך לילה בתנור ואקום. לשבור את הכדור על ידי קשה על הצינור עם המכסה הסגור. הוסף פתרון עמודת SPE לתוך הצינור המיובש סיליקה microsphere והמערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 4 μl של פתרון SPE לאותו ערוץ ולאחר מכן Crosslink זה על ידי הקרנת UV במשך 2.5 דקות. ואז, להפוך את השבב מעל ולהקרין תמורת 2.5 דקות נוספות. טור SPE polymerized צריך להיות מוצק לבנה אטומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הערוץ עם 500 μl של מתנול 100% לשטוף מעל מגיבים עודפים. לשטוף זה גם מסיר תוך פולימר פוממסי rogenic, ובכך ליצור מבנה הנקבובי הפתוח של עמודת SPE כאשר התייבשו בתנאי הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שני תנורים, סרט דק לחלק התחתון של השבב עם קלטת מוליכי תרמית. את הצדדים של תנורי החימום צריכים להיות מיושרים עם הקצה של הערוצים הרחבים לdenaturation וחישול בנפרד (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 צמדים תרמיים מקום לשבב דרך מת הסתיימו ערוצי צד פתוחים של כל שבב (ראה איור 2b). את הצמדים התרמיים להישאר בערוצים אלה באמצעות התאמת עיתונות. קלטת שמשה כדי לתקן את המיקום של צמדים תרמיים נוסף. </li></ol> 2. שיטת חילוץ שלב מוצקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 96 μl של אתנול 70% במים DEPC שטופל וautoclaved (deionized או Millipore בפילטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 μl הוסף של רנ&quot;א 25X Secure עד 96 μl של אתנול 70% בצינור אחד, ולשכפל את אותה תערובת עם אתנול 100% בצינור נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300μl של חיץ ערוץ על ידי ערבוב הבא: 75 μl של thiocyanate ז 6 guanidine (GuSCN), 150 μl של 2-propanol, 63 μl מים חופשיים nuclease, ו12 μl של רנ&quot;א Secure 25X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 312 μl של חיץ תמוגה ידי ערבוב: 100 μl של 6 מ&#39;GuSCN, 200 μl של 2-propanol, ו12 RNA 25X μl המאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם אתנול 70%, 100% אתנול, חיץ ערוץ ומאגרי תמוגה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות כדי להפעיל RNA המאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאזן את ערוץ microfluidic, הפעל את חיץ הערוץ דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהיר להפשיר מדגם הבדיקה בVTM על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, והסר את המדגם באופן מיידי מאמבט מים ברגע שהוא מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 13000 סל&quot;ד למשך 10 דקות, ולהעביר 100 μl של supernatant לתוך 300 μl של חיץ תמוגה. השלם את התערובת על ידי הוספת 6 μl של מיקרוגרם 1 / רנ&quot;א המוביל μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת לערבב, ואחרי סיבוב כבר5 שניות, טענו כל lysate לתוך מזרק סמ&quot;ק luer-Lok 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל lysate דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את ערוץ SPE עם 100 μl של אתנול 70%, ואחריו אתנול 100% μl of100 ב1 מ&quot;ל / שעה. (יש נפח מת μl 50 שבקצה המזרק שלא ידחק אותי החוצה, ולכן למעשה רק 50 μl עובר ערוץ.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם מזרק ריק בסימן 0.5 המ&quot;ל ולדחוף אוויר דרך הערוץ כדי לייבש אותו ב1 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 67.5 μl מי nuclease חינם דרך הערוץ לelute את חומצות גרעין הקשורות ברמה של 0.5 מ&quot;ל / שעה, ולאסוף μl 13.5 מnanoport בנמל הפסולת. (איבוד הנוזלים בשל הנפח המת μl 54 שבקצה המזרק וערוץ SPE). </li></ol> 3. RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 36.5 μl של מיקס מאסטר RT-PCR במהלך השלב היבש האוויר (2.12) תוך שימוש בחומרים הכימיים בתוך ערכות OneStep Qiagen RT-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען RT-PCR מגיב בnanoport בנמל הפסולת, ולערבב עם רנ&quot;א כדי לקבל את התגובה הבאה 50 μl RT-PCR: 13.5 רנ&quot;א eluted μl במי nuclease חופשיים, 4 תמהיל האנזים μl RT-PCR, פתרון ש 10 μl, 10 μl1X 1 חיץ צעד, 2 25 מ&quot;מ μl MgCl 2, 1 פריימר 5&#39;-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 &#39;50 מיקרומטר μl קדימה, 1 מיקרומטר פריימר μl 50 הפוך 5&#39;-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 &#39;, DNTP 2 μl, 1.0% μl 0.75 w / v BSA, 0.73 μl PEG8000 ומי nuclease חופשיים μl 5.02. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת RT-PCR לתוך ערוץ RT ידי ואקום עדין (השתמשנו בואקום הקיר) ולאטום Nanoport עם הולם סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 35 V לדוד 1. שמור את ריאגנטים בערוץ RT למשך 30 דקות לאחר החימום 1 equilibrates ב 50 ° C. שמור את ריאגנטים בערוץ RT במשך 15 דקות לאחר ש1 equilibrates הדוד ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 27 V לתנור 1 ו 50 V לדוד 2, להמתין כשלוש דקות או עד 1 equilibrates דוד בגיל 60 ודהז; C ומחמם 2 equilibrates ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף את ריאגנטים לערוץ ה-PCR על 0.5 μl / דקה. זה אמור לקחת 20 דקות לריאגנטים לזרום דרך התעלה המפותלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמדגם הופך אותו לסוף הערוץ המתפתל, לאסוף את מוצרי ה-PCR בשקע באמצעות pipettor וקצה בגודל המתאים. </li></ol> 4. איתור מוצרי PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים במבחן Agilent רגישות גבוהה DNA כדי לזהות את המוצרים. כדי להפעיל את המבחן הזה מוציא את ערכת DNA רגישות הגבוהה Agilent ממקרר 30 דקות לפני הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Bioanalyzer ולפתוח את תוכנת המומחה 2100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען μl 1 של מוצרי ה-PCR לבדיקות והמעקב Agilent הפרוטוקול <a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">(20Manual.pdf% http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ולתעד את הנתונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Nicholls, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+Influenza:+The+Inside+Story.">Pandemic Influenza: The Inside Story.</a> PLoS Biol. 4, (2006).</li><li>Wenzel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+performance+determination+and+clinical+validation+of+the+novel+roche+realtime+ready+influenza+A/H1N1+detection+set.">Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).</li><li>Chan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+(H1N1.">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1.</a> Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).</li><li>Ginocchio, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+multiple+test+methods+for+the+detection+of+the+novel+2009+influenza+A+(H1N1)+during+the+New+York+City+outbreak.">Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak.</a> Journal of. 45, 191-195 (2009).</li><li>Aeron, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+influenza+rapid+point-of-care+tests+in+the+detection+of+swine+lineage+A(H1N1)+influenza+viruses.">Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).</li><li>Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+tests+for+influenza+and+other+respiratory+viruses:+determining+performance+specifications+based+on+clinical+setting.">Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).</li><li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Three+Influenza+A+and+B+Real-Time+Reverse+Transcription-PCR+Assays+and+a+New+2009+H1N1+Assay+for+Detection+of+Influenza+Viruses.">Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).</li><li>Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).</li><li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+microfluidic+device+for+on-chip+purification+of+nucleic+acids+for+disposable+diagnostics.">Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).</li><li>Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+microfluidic+chip+for+continuous-flow+polymerase+chain+reaction:+Simulations+and+experiments.">Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments.</a> Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chip+for+Molecular+Amplification+of+Influenza+A+RNA+in+Human+Respiratory+Specimens.">Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens.</a> PLoS ONE. 7, e33176 (2012).</li><li>R&#229;dstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+PCR-Inhibitory+Components+in+Blood+Cells.">Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li><li>Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+PCR+Inhibitors+by+Silica+Membranes:+Evaluating+the+Amplicor+Mycobacterium+tuberculosis+Kit.">Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).</li><li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples.">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li></ol>

החוקרים הכריזו אין אינטרסים כספיים מתחרים.

שיטת האבחון שהוצגה כאן הדגימה את היכולת של שבב microfluidic פלסטיק משולב כדי להגביר שפעת RNA מן דגימות מטופל עם סגוליות גבוהות וגבול גילוי נמוך 13 עצבנו השבב הזה לנקודת פוטנציאל של בדיקות טיפול:. (א) את הטמפרטורה וfluidic השליטה הייתה פשוטה יותר, (ב) את השבב הוא עלות נמוכה ומ?...

מיליוני מקרי מוות דווחו בשלוש מגיפות השפעת של המאה ה -20 1. יתר על כן, מגיפת השפעת האחרונה הוכרזה על ידי ארגון הבריאות העולמית (WHO) 2 בשנת 2009, והחל מיום 1 באוגוסט 2010, 18449 מקרי מוות שדווח על ידי ארגון בריאות עולמית 3. מגיפה זו הוכיחה שוב את הניטל הגבוה של מחלות זיהומיות, ואת הצורך בזיהוי מהיר ומדויק של שפעת כדי לאפשר אישור מהיר מחלה, תגובה לבריאות הציבור מתאימה וטיפול יעיל 4. ישנן מספר שיטות נפוצות לאבחון שפעת, אלה כוללים immunoassays מהיר, בדיקת האנטיגן ניאון ישירה (DFA) ושיטות תרבות ויראליות. immunoassays ראפיד דרמטי חסר רגישות 5-8, בעוד שתי שיטות האחרות הן עתירות עבודה וזמן רבים 9. בדיקות מולקולריות להציע יתרונות רבים, כולל תפנית הזמן sensit קצר, גבוהלקוחים, וסגולי גבוהים יותר. כמה גופים מסחריים כבר עובדים לקראת בדיקות מולקולריות מהירות (הנקרא גם בדיקות או NATS חומצות גרעין) למחל זיהומיות, וכמה יש מבחני שפעת בצינורות שלהם. עם זאת רובם דורשים הכנת מדגם את השבב. אף אחד מתיקוני הרפואה ו( CLIA) ייתרו בדיקות מולקולריות לשלב הכנת מדגם לתוך מחסנית assay או מודול. טכנולוגיית מעבדה על השבב משחקת תפקיד חשוב בפיתוח של מכשירי בדיקת נקודה של טיפול. לאחר המבוא של שבב ה-PCR לראשונה בשנת 1993 10, מאמצים רבים שהושקעו בפיתוח שבבי בדיקת חומצות גרעין. עם זאת, רק מעטים מהם יש הכנת מדגם גולמית משולבת עם הגברה במורד זרם. אנחנו הוכחנו בעבר את המזעור של עמודת מיצוי שלב מוצקה (SPE) לתוך שבב microfluidic פלסטיק 11 ולפתחment ואופטימיזציה של שבב ה-PCR זרימה רציפה 12. כאן, אנו מרחיבים את העבודה הקודמת לשלב SPE בצעדי PCR RT ולתוך שבב יחיד לאבחון קליני ולהפגין את יכולתה להגביר חומצות גרעין ממטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> 1-dodecanol </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 443816-500G </td></tr><tr><td> 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 196118-50 </td></tr><tr><td> 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה </td><td> G2943CA </td></tr><tr><td> 2-Propanol </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 19516 </td></tr><tr><td> Benzophenone </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 239852-50 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית </td><td> A7979-50ML </td></tr><tr><td> methacrylate וטיל </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 235865-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> רנ&quot;א Carrier </td&gt; <td> Qiagen, ולנסיה, קליפורניה </td><td> 1017647 </td></tr><tr><td> Cyclohexanol </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 105899-1L </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> dimethacrylate אתילן </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 335861 </td></tr><tr><td> dimethacrylate אתילן גליקול </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 335681-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 250 μl מזרק הזכוכית </td><td> המילטון, רינו, NV </td><td> 81127 </td></tr><tr><td> thiocyanate guanidine </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 50981 </td></tr><tr><td> ערכת ה-DNA רגישות גבוהה </td><td> Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> עיתונות חמה </td><td> קארבר, Wabash, IN </td><td> 4386 </td></tr><tr><td> JB epoxies הוולד </td><td> מקמאסטר-CaRR, Elmhurst, IL </td><td> 7605A11 </td></tr><tr><td> מזרקי luer-Lok </td><td> BD-רפואי, פרנקלין אגמים, ניו ג&#39;רזי </td><td> 309628 </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית </td><td> AB-0359 </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 494437 </td></tr><tr><td> methacrylate תיל </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> M55909 </td></tr><tr><td> Nanoport </td><td> אפצ&#39;רץ&#39; מדעי </td><td> N-333-01 </td></tr><tr><td> Nanoport התאמה </td><td> אפצ&#39;רץ&#39; מדעי </td><td> ה-F-120x </td></tr><tr><td> מי nuclease חופשיים </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק, pittsburge, הרשות פלסטינית </td><td> PR-P1193 </td></tr><tr><td> OneStep RT-PCR ערכה </td><td> Qiagen, ולנסיה, קליפורניה </td><td> 210210 </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 41009 </td></tr&gt; <tr><td> אספקת חשמל </td><td> VWR, רנדור, הרשות פלסטינית </td><td> 300V </td></tr><tr><td> RNAse חוץ </td><td> סיגמה אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי </td><td> 83931-250 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> RNASecure </td><td> אפלייד Biosystems, הפוסטר סיטי, קליפורניה </td><td> AM7005 </td></tr><tr><td> סיליקה microspheres </td><td> Polysciences, ורינגטון, הרשות פלסטינית </td><td> 24324-15 </td></tr><tr><td> משאבת מזרק </td><td> הרווארד Apparatus, Holliston, MA </td><td> HA2000P/10 </td></tr><tr><td> קלטת מוליכי תרמית </td><td> מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL </td><td> 6838A11 </td></tr><tr><td> צמד תרמי </td><td> אומגת הנדסה, סטמפורד, קונטיקט </td><td> 5SRTC-TT-J-40-36 </td></tr><tr><td> מחממי סרט דק </td><td> Minco, מיניאפוליס, מינסוטה </td><td> HK5166R529L12A </td></tr><tr><td> Crosslinker אולטרה סגול </td><td> UPV, Upland, קליפורניה </td><td> CL-1000 </td></tr><tr><td> Zeonex </td> &lt;td&gt; Zeon כימיקלים, Louisville, KY </td><td> 690R </td></tr></tbody></table>

microfluidic chip fabrication and method to detect influenza

אבחון מהיר ויעיל, לשחק תפקיד חשוב בשליטה על מחלה זיהומית ומאפשר ניהול יעיל מטופל וטיפול. כאן, אנו מציגים שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב עם היכולת להגביר שפעת וירוס במטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates. בעקבות טעינת מדגם המטופלים, מכשיר microfluidic רצף מבצע תמוגה על שבב תא, טיהור רנ&quot;א וצעדים בתוך ריכוז המיצוי המוצק השלב (SPE), שעתוק לאחור (RT) ותגובת שרשרת פולימרז (PCR) בRT-PCR תאים, בהתאמה. איתור נקודת סיום מתבצע באמצעות Bioanalyzer את השבב (Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה). עבור ציוד היקפי, השתמש משאבת מזרק יחידה לנהוג מגיבים ודגימות, בעוד שני תנורי סרט דקים שמשו את המקורות החומים לRT-PCR והתאים. השבב נועד להיות שכבה אחת ומתאימה לייצור תפוקה גבוהה, כדי לצמצם את fabricatiעל זמן ועלות. שבב microfluidic מספק פלטפורמה לניתוח מגוון רחב של וירוסים וחיידקים, מוגבלים רק על ידי שינויים בעיצוב מגיב הדרושים כדי לזהות פתוגנים עניין חדשים.

<html> תוצאה טיפוסית מוצגת באיור 3 לשפעת דגימת שטיפת אף ולוע נגועה. בשל כמויות השונות של נגיף שפעת בכל דגימת מטופל, הריכוז הסופי של מוצר PCR ישתנה. תוצאה טובה צריכה רעש נמוך, שני שיאי סולם ברורים (35 ו10380 נ&quot;ב) ושיא מוצר אחד בגודל המוצר מיועד (107 נ&quot;ב) למדגם החיובי. א?...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza at JoVE.com

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

microfluidic-chip-fabrication-and-method-to-detect-influenza

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  Boston University. שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

Video: Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

ייצור של מכשירי microfluidic נייר מבוססים תלת ממדי עבור Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...