המחברים מבקשים להודות לLirui דו לבניית וקטור pCAGAdDU ואוליבר גורקה למתן פרוטוקול הקיבעון.

1. שיבוט של גן של עניין לוקטור כניסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבט את הגן של עניין לוקטור כניסה. ההגברה PCR של הגן ואחרי קשירה בוטה סוף לתוך וקטור topoisomerase מצמידים (למשל pENTR / D-TOPO) או הגבלת אנזים בתיווך שיבוט עשוי לשמש להליך זה. </li></ol> 2. העברת הגן של עניין לוקטור יעד pCAGAdDu <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הגן של עניין מוקטור כניסתו לוקטור היעד על ידי רקומבינציה LR (מיקס למשל Gateway LR Clonase השני אנזים). הפעולה זו תיצור וקטור ביטוי adenoviral (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize 10 מיקרוגרם של וקטור ביטוי adenoviral בפאצ&#39;י הגבלה לעכל, לזרז את ה-DNA וresuspend אותו במים בריכוז של 3 מיקרוגרם לכל 100 μl. ינאריזציה משחררת את החזרות ההפוכות נגיפיות (ITR), אשר נדרשות לשכפול וencapsidation של Vה-DNA iral לחלקיקי נגיף. </li></ol> 3. דור של lysate הווירוס היסודי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 1 x 10 5 תאי HEK293A ב2 תרבות תקשורת סלולרי מ&quot;ל (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) באחד טוב של 6 גם צלחת ודגירת התאים עבור 6-14 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב10% CO 2 באינקובטור כדי לאפשר להם לדבוק. לאחר מכן תאים צריכים להיות בכ -50% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lipofection: העברת 6 μl של מגיב jetPEI ל94 μl של 50 מיקרומטר NaCl, בקצרה מערבולת. מוסיף את הפתרון המעורב עד 100 וקטור אדנווירוס ינארית μl תוך vortexing ודגירת תמהיל transfection זה במשך 15 - 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol> לבצע את כל הפעולות הבאות בתנאים המתאימים biosafety לזיהום אדנווירוס! <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על פתרון dropwise על התא המכיל גם HEK293A ודגירת התאים ב 37 ° C ו-CO 2 10%. בעת שימוש בסמן פלואורסצנטי, להעריך transfection יעילות חזותי לאחר 12-36 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הוסף 0.5 מ&quot;ל של מדיום חדש כל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו כל 2 - 3 ימים עם מיקרוסקופ אור או הקרינה לתופעות cytopathic (CPE), שהם אזורים עם תאים מוגדלים ומעוגלים שמתחילים לניתוק. זה מעיד על דור וירוס יעיל. על המופע של אזורים רחבים יותר של CPE (איור 3), זה ייקח 24-72 שעות לפני שכל התאים נגועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל התאים להראות סימנים של CPE, אבל לפני ניתוק כולל של תאים מתרחש, לנתק את התאים על ידי pipetting העדין ותאים עם העברת supernatant (SN, 3 - 5 מ&quot;ל) לצינור פוליסטירן 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את התאים בSN על קרח יבש במשך 15 - 20 דקות ולהפשיר אותם במהירות על 37 מעלות צלזיוס לאחר מכן לקרע התאים. חזור על הקפאה והפשרה, מחזור זה (נ / TC) פעמיים נוספות. שמור lysate הווירוס העיקרי על קרח לשימוש תוך יום או להקפיא אותו ב -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך. כל F נוסף/ TC יפחית את כייל הנגיף על ידי 30 - 50%. </li></ol> 4. הגברה וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים ולגדל תאי HEK293A למפגש 90% על צלחת תרבית רקמת ס&quot;מ 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים עם מחצית lysate הווירוס העיקרי (1.5-2.5 מ&quot;ל) ודגירת התאים במשך לפחות 36 שעות. כמעט כל התאים צריכים להיות נגועים לאחר מכן, כפי שניתן לקבוע על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור מחדש ההגברה של מניות וירוס כבר מוגבר (כלומר מרוכז יותר), להדביק HEK293A בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 50 (ראה 6.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות בצור כאשר כל אחד מהם מראים CPE אבל לפני הניתוק. עם ייצור וירוס יעיל מצב זה הוא הגיע בתוך 48 שעות לאחר הדבקה. (אם זה לוקח עד שבוע, לשקול סיבוב נוסף של הגברה על ידי הגדלת כמות מניות אדנווירוס משמשת לזיהום המתואר ב4.2.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים על ידי pipetting העדין והעברת תאים וSN לצינור פוליסטירן 50 מ&quot;ל. ספין למטה תאים ב XG 300 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את SN וresuspend גלולה בהיקף מתאים של מדיום או SN (1 מיליליטר בקירוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 F / TC לשבש את התאים ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תוריד את מספר סידורי המכיל את חלקיקי הנגיף (כלומר lysate הנגיף המרוכז), וaliquot lysate הווירוס לאחסן אותו ב -80 ° C. </li></ol> 5. קביעת כייל נגיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 10 5 תאים לכל A549 גם ל5 בארות של צלחת 12 גם במדיום 1 מ&quot;ל ולתת לתאים לדבוק 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש μl 1 של אדנווירוס המרוכז (מופשר על קרח) לביצוע דילול סדרתי במדיום (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) ולהוסיף 10 μl בכל טוב. להשאיר אחד גם נגוע להתאים gating בcytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 36 שעות, תוריד את מספר סידורי, לשטוף עם תאי PBS ולנתק (לדוגמה על ידי trypsinization). לקבלת הוראות בטיחות Biohazard, מומלץ לתקן גאמות בparaformaldehyde 4% μl 100 ב PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולשטוף עם PBS פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח FACS של ביטוי זיהום סמן. עלילה &#39;lysate הנגיפי μl ייושם כנגד המספר המוחלט של תאים נגועים (איור 4). לקבוע את הטווח ליניארי של זיהום ולחשב לכל מ&quot;ל של כייל נגיף חי מהעקומה הסטנדרטית על פני הטווח ליניארי באמצעות x = 1,000 μl. </li></ol> 6. זיהום תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי T מסוג CD4 תמימים / מנוחה מDO11.10 TG; עכברי TG CARΔ1 באמצעות MACS (מסוג CD4 + T הנאיבי צינוק ערכה השני) או FACS מיון (מסוג CD4 + CD25-CD44-CD62L +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויים בקנה מידה קטנה, פיפטה נפח מתאים של lysate הנגיפי כדי להשיג משרד הפנים של 50 לאחד גם צלחת תחתונה 96, גם סיבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עד 4 x 10 5 תאי T בנפח סופי זיהום של 50 μl במדיום תא T (RPMI1640, 10% FBS, PenStrep 5%, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x ממ חיוניויטמין, 1x-L-גלוטמין, 1:250,000 mercaptoethanol, 10 HEPES מ&quot;מ). לדוגמה: משרד הפנים של 50 ישמשו להדביק 3 x 10 5 תאי T; כייל הנגיף הוא 3 X 10 9 מ&quot;ל -1 נפח וירוס = משרד הפנים x T מספר תא / כייל נגיף = 50 x (3 x 10 5) / (3 x מיליליטר -1 10 9) = 0.005 מ&quot;ל </li></ol> הערה: לזיהום של מספרים סלולריים גדולים יותר, בקנה מידה של דבר באמצעות משרד הפנים של 50 בהיקף זיהום של 165 μl לכל 10 6 תאי T נאיביים בצינור קלקר עם כוס רופפת (עד 3 מ&quot;ל לכל צינור TP). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי. </li></ol> (אופציונלי: התאים עלולים להישטף שוב כדי להסיר את הווירוס באופן יעיל יותר) <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspendב200 בינונית μl תא T בלי גירוי נוגדנים וציטוקינים אחרים בלי IL-2 או לנוח ו 40 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור כדי לאפשר ביטוי של הגן של עניין לפני ההפעלה. </li></ol> 7. הפעלת תא T וקיטוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בנפח של אנטי CD3-וחרוזים אנטי CD28 מצמידים ששווים למספר התא (לדוגמה: 4 x 10 5) לתוך כוס מגיב קטנה, להוסיף נפח של פי 10 של PBS ולשים אותם על מגנט במשך 2 דקות . קח את supernatant ו resuspend את חרוזי 200 בינוני קיטוב μl (לTregs: בינונית + T תא TGFβ ng / 1 מ&quot;ל, 100 U / ml IL-2). </li></ol> הערה: ניתן גם להפעיל תאים באמצעות תרבות מנות רקמות מצופות בנוגדנים נגד CD28 ואנטי CD3, או באופן ספציפי לקולטן תא T DO11.10 באמצעות splenocytes BALB / ג מוקרן פעם עם אנטיגן ovalbumin 323-339 פפטיד. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugהדואר נח תאים כמו קודם, תוריד את תאי resuspend SN וב200 בינונית μl קיטוב המכילים אנטי CD3-וחרוזים-CD28 נוגדן אנטי מצמידים. דגירה של 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור ללא שינוי בינונית. </li></ol> 8. קיבוע תא T ומכתים עבור cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים: ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי. לבצע את כל שלבי הכביסה הבאים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בתמיסת 100 μl ניתן לתקן מת תא מכתים ודגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, resuspend ב100 PBS μl, להוסיף paraformaldehyde 4% μl 100 PBS, 15 דקות לדגור על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים, resuspend אותם במתנול 70% μl 200 קר כקרח PBS ו דגירה למשך 30 דקות על קרח. </li></ol> הערה: ניתן לטפל בתאים מעתה והלאה ללא אמצעי זהירות Biohazard!<ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 60 אדון ותמהיל של 60 μl μl PBS + 10 מיקרוגרם / מיליליטר FC-בלוק (אנטי FCR3 לחסום מחייב נוקבים). שטוף תאים, resuspend אותם 40 μl של PBS + אנטי FCR3 ודגירת 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של PBS + אנטי FCR3 המכיל נוגדני 1 מיקרוגרם PE-מצמידים אנטי FOXP3, מערבב היטב ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעמים PBS ולנתח תאים בcytometer זרימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease.">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li><li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen.">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li><li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration.">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li><li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation.">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li><li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict.">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li><li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease.">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity.">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li><li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., H&#228;mmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors.">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Peripheral+CD4+CD25-+Naive+T+Cells+to+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+TGF-&#946;+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3.">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-&#946; Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li><li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation.">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).</li><li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+(TCR)+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR.">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li><li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency,+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+(MEA).">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).</li><li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells.">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).</li><li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes.">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li><li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+expression+of+the+coxsackie/adenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells.">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li><li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie/adenovirus+receptor+transgenic+model.">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4 (2002).</li><li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation.">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li><li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression.">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+structural,+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination.">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li><li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes.">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li><li>Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155.">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+bic/microRNA-155+for+Normal+Immune+Function.">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&#947;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&#947; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים.

דור וירוס וטיטרציה לקבלת תוצאות אופטימליות transfection, האיכות והכמות של וקטור לינארית מופיעות חשוב ביותר. אנו לא צופים השפעה שלילית על ייצור lysate עיקרי מצמיחת יתר ראשונית של התרבות מאז הזיהום ימשיך במהירות ברגע ייצור וירוס יעיל מתרחש. ...

Tregs הם חיוניים כדי לשמור על סבילות חיסונית ולצנן את התגובות חיסוניות להחטיא. Tregs לדכא הפעלת תא T עובר אורח. כתוצאה מכך, אבלציה של Tregs מובילה לאוטואימוניות הקטלנית והרס עצמי מונעת על ידי תאי T מופעל 1. Tregs להתפתח בבלוטת התימוס במהלך סלקציה שלילית של CD4 מבשרים אחת חיובי, אבל הם גם יכולים להבחין בפריפריה מתאי T מסוג CD4 תמימים על גירוי אנטיגן במינון נמוך עם 1,2 שיתוף הגירוי הכי מוצלח. נראה הרתי Tregs לדכא אוטואימוניות רקמה נגד-אנטיגנים עצמיים, ואילו ההיקפי Tregs היו מעורב במתן סובלנות במעי או הריאה. המושרה Tregs אלה potently למנוע הפעלת תא T לאחר הכרה של אנטיגנים זרים ברירית, כולל אנטיגנים סביבתיים ממזון והאוויר, חיידקי commensal, ואלרגנים 3,4. בנוסף, Tregs הם קריטיים להקמת סובלנות אימהית לעובר 5 פפטידים ומראשמחלת שתל נגד מארח פורקן 6. במקביל, גם Tregs לתווך לוואי בלתי רצוי על ידי הפחתת ערך מעקב חיסונית של תאים סרטניים 7,8. תכונת ההיכר של Tregs היא הביטוי של-משנה ציון FOXP3 גורם השעתוק, גורם שעתוק המכיל תחום המזלג בראש, כי הוא הכרחי ומספיק להעניק Treg פונקציה 9,10. כמה מסלולי איתות שיכול לגרום ביטוי FOXP3 ידועים. עם זאת, התהליכים המולקולריים השליטה, להסדיר, או לווסת Treg בידול בתגובה לקולטן תא T מפעילה הם הבינו פחות טובים. יכול מאוד יעיל להיגרם Tregs במבחנה על ידי הגירוי של תאי T מסוג CD4 נאיביים עם נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28 בנוכחות TGFβ ו-IL-2 11. כTregs מתעורר הם פונקציונליים in vivo, המניפולציה של מולקולות המקדמות בידול Treg נושא פוטנציאל עצום לעתיד therapies, למשל, טיפול באסתמה, מחלת Crohns, והשתלת 11,12. לעומת זאת, אפנון טיפולי של מולקולות כדי לחסום בידול Treg עשוי לספק תועלת בגישות עתידיות של טיפול המשולב של חולי סרטן. במבחני בידול במבחנה כבר סייע לתיאור של שינויים מולקולריים הקשורים להתמיינות תאי T משנה. באותו הרגע, ניסיונות ניסיוניים לחיפוש או מסך למוצרי גן שהתמיינות תאי T שליטה הם הקשו על ידי העובדה שהשיטות הנפוצות ביותר של ביטוי גנים מחוץ לרחם להיכשל בתאי T נאיביים. לדוגמה, electroporation ותמרת retroviral הם יעילים רק בתאי T מופעלים. בניגוד לציפיות ראשוניות, תמרת lentiviral, שהוא בדרך כלל יעיל בתאי מנוחה, דורשת מראש הפעלה של תאי T נאיביים ידי ציטוקינים 13. יתר על כן, ההעברה של cDNA או mRNA במהלך electroporationכרוך בשלילת קוטביות של קרום הפלזמה, שהיא עצמה מעניקה תכונות של הפעלת תאי T ואולי אף לגייס Ca 2 + איתות ולהפעיל את חלבוני NFAT (תצפית ושופט שלא פורסם. 14). באופן דומה, לתמרת retroviral, תאי T הנאיביים צריכים להיות מופעלים עבור 18 - 40 שעות. במהלך תקופה זו, הפירוט של קרום הגרעין במהלך חלוקת תא מתרחש, ומאפשר לשילוב הגנומי הבא של וקטור retroviral 15. שיטות אלה אינם מסוגלים להתמודד עם הרגולציה המולקולרית המוקדמת של מפגש ראשוני עם תא T אנטיגן, המהווה את השלב המכריע של התמיינות תאי T מסייע. התמרה adenoviral ידועה להעניק ביטוי גנים מחוץ לרחם חולף במספר סוגי תאים האנושיים המבטאים את הקולטן אדנווירוס Coxsackie האנושי (מכונית). הוא ממשיך ללא דרישה להפעלת תא או התקדמות מחזור התא. משטח הביטוי של גAR הוא חיוני לקובץ מצורף וירוס יעיל והפנמה, וביטוי מהונדס של הגרסה המקוצצת CARΔ1 תחת אמרגן תא ספציפי T נמצא כדי להבהיר thymocytes העכבר ותאי T הרגישים לזיהום adenoviral 16. חשוב לציין, transgene אינו משנה thymocyte פיתוח או בבידול מבחנה של CD4 תאי T נאיבי לתוך תת שונים (מידע לא מוצג; נ&quot;צ 17.). התמרה אדנווירוס בתיווך של תאי T ששימש בעבר לביטוי יתר 17,18 ועקום למטה גישות 19,20. יכולים להיות מטוהרים תאי T המהונדס מזמין מסחרי DO11.10 TG; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ונ&quot;צ 17.). חשוב לציין, התמרה adenoviral מאפשרת ביטוי גבוה של גן של עניין בתאי T נאיביים ללא גרימת סימנים ברורים של הפעלה. תאי ה-T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) לאחר infectiוביכול להיות מופעל ומובחן לTreg דומה לתאים שאינם נגועים. ייצור של adenoviruses רקומביננטי יכול להיות מושגת לאחר transfection של תאי HEK293A עם פלסמידים adenoviral (איור 1). פלסמידים אלה מכילים בדרך כלל את הגנום האנושי אדנווירוס מסוג 5 עם גני E1 ו-E3 שנמחקו כדי להבהיר adenoviruses רקומביננטי שכפול פסול 21. תאי HEK293A להשלים מחסור שכפול כפי שהם כבר הונצחו באמצעות שילוב יציב של אדנווירוס טעון 22. מאז וקטורי adenoviral גדולים (~ 40 KB) וכתוצאה מכך לא מתאים גם לשיבוט בתיווך אנזים הגבלה מסורתי, אנחנו עובדים במערכת השער. הגן של עניין הוא משובט תחילה לתוך וקטור כניסה קטן יותר, שממנו ניתן להעביר אותו בקלות לתוך וקטור יעד adenoviral דרך תגובת רקומבינציה מבדה (LR) 23. אנחנו בניתי את וקטור pCAGAdDuעל ידי שילוב של אמרגן CAG (אמרגן אקטין עוף ומשפר CMV) עם קלטת ביטוי המכילה אתרי LR איגוף סמן בחירת ccdB procaryotic 24. קלטת ביטוי זה התמזגה לאתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) רכיב המאפשר coexpression של החלבון אוקריוטים זיהום הסמן המשופר הירוק הניאון (eGFP), אשר התמזג רצף המכיל הורמון גדילת פולי השור () אות. אנחנו בחרנו את רצפי cis-הרגולציה חטיבת כלי טיס, שכן אמרגן CMV prototypic נמצא להיות מאוד הפעלה תלויה ושלילי ולכן לביטוי גנים בתאי T נאיביים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להתמיינות יעילה בTreg מבחנה ושיטה לtransduce תאי T מסוג CD4 תמימים ללא הפעלה (איור 2). השיטה מאפשרת ביטוי אקטופי גן או להפיל מסוג CD4 שקדמו התמיינות תאי T במצב הנאיבי. זה מאפשר לבחון את ההשפעה של overexpresseגן ד של ריבית במהלך אירועי איתות ראשונים על גירוי ראשוני TCR עד מחויבות משנה תא T. ניסויי האימות שלנו גם מספקים את הבסיס להקמת יישום דומה באדנווירוס הבידול של תת קבוצות אחרות כגון תאי T Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, או תאי TFH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

תאי T רגולטוריים (Tregs) הם חיוניים כדי לספק סובלנות חיסונית עצמי, כמו גם לאנטיגנים זרים מסוימים. יכול להיות שנוצר Tregs מתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה עם TCR-ושיתוף גירוי בנוכחות TGFβ ו-IL-2. זה נושא פוטנציאל עצום לטיפולים עתידיים, לעומת זאת, המולקולות ומסלולי איתות שבידול שליטה הם במידה רבה לא ידועים. ניתן להשפיע תאי T עיקריים דרך ביטוי גנים מחוץ לרחם, אך שיטות נפוצות אינן מצליח למקד את המדינה הנאיבית החשובה ביותר של תא T לקראת הכרת אנטיגן העיקרית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבטא גנים מחוץ לרחם בתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה לפני גרימת בידול Treg. היא חלה התמרה עם אדנווירוס כפול המחסר ומסבירה הדור והייצור שלה. אדנווירוס יכול לקחת עד מחדיר גדול (עד 7 קילו) והוא יכול להיות מצויד עם יזמים כדי להשיג overexp הגבוהה והחולףression בתאי T. זה למעשה transduces תאי T עכבר נאיביים אם הם מבטאים רצפטור אדנווירוס Coxsackie מהונדס (מכונית). חשוב מכך, לאחר הדבקת תאי T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) ויכול להיות מופעל ומובחן לTregs דומה לתאים שאינם נגועים. לכן, שיטה זו מאפשרת מניפולציה של CD4 התמיינות תאי T מראשיתו. זה מבטיח כי ביטוי גנים מחוץ לרחם כבר נמצא במקום כאשר אירועי איתות ראשונים של גירוי TCR הראשוני גורם לשינויים תאיים שסופו של דבר יובילו לבידול Treg.

ייצור וירוס עבור דור של titers וירוס גבוה, העיתוי של מסיק תא HEK293A בייצור וירוס ראשוני או הגברה וירוס הוא קריטי. תמונות עם ניגודיות ניאון ושלב נציג עם סימנים חזותיים של ייצור נגיף מוצגות באיור 3. CPE נצפו 10 ימים לאחר transfection של תאי ...

Watch this Scientific Journal Video about Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation at JoVE.com

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T רגולטורים<em&gt; במבחנה</em&gt;.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Views.  Helmholtz Zentrum München. העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T רגולטורים במבחנה.

Video: Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

פענוח התחייבות מוקדמת של תאי T מסייעים לזקיקים בזיהום LCMV חריף

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

מחבר זרקור: הבהרת המסלולים של התמיינות תאי TFH באתגרי LCMV חריפים

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...