אנו מודים לאמילי ג&#39;קסון, יהושע זיידמן, וניקולס רן להערות על התוכנה. עבודה זו מומנה על ידי GM95733 (לNM), 103,316 BBBE וקרנות הזנק (MIT לNM).

<ol>
	<li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level.">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li><li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system.">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling-mediated+bacterial+persister+formation.">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li><li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene.">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li><li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria.">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li><li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics.">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li><li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration.">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li><li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression.">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , (2013).</li><li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy.">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).</li><li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles.">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).</li><li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast.">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li><li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells.">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468 (2008).</li><li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry.">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li><li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage.">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes &amp; Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li><li>To, T. -. L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability.">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li><li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex.">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li><li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression.">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול לעיל מתאר שיטה פשוטה לקבל ולנתח את נתוני סדרת זמן הקרינה עם ניסיון מוגבל במיקרופלואידיקה או בפיתוח תוכנה. זה מאפשר לאדם להשיג סרטי הקרינה זמן לשגות של תאי שמרים בודדים; לחלץ גודל תא רלוונטי ומדידות ביטוי; מעקב כומר ומטלות שושלת, ולנתח את ההתנהגות של תאים של?...

ניתוח תא בודד של ביטוי גנים שקדם את ההבנה של היבטים רבים של ויסות הגנים שלנו. תמונות סטטיות של ביטוי ניאון כתב באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופיה לספק מידע שימושי על חלוקת ביטוי תא בודד, אבל חסרה את ההיסטוריה והאבולוציה של נתוני סדרת זמן הנדרשים כדי להודיע ​​ישירות דינמיקת ביטוי גנים. מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה מציגה אמצעים כדי להשיג את שני מדידות תא בודדות ואת ההיסטוריה שלהם. ניסיוני בטכניקות ואנליטיות שונות פותחו כדי להשיג ולכמת סרטים של ביטוי ניאון כתב, ובכך הקניית תובנות תכונות ויסות הגנים (ראה 1 לביקורת), כגון תא אל תא וריאציה 2,3, היווצרות חיידקי persister 4, שעתוק ייזום והתארכות 5, תעתיק מתפוצץ 6,7, תלות מחזור תא 8,9, ותורשתיות 10. עם זאת, obtסדרת זמן הקרינה aining איכות תא בודד כרוכה באתגרים טכניים משמעותיים בculturing monolayer של תאים בסביבה לשליטה וכימות בתפוקה גבוהה של הקרינה בסרטים שנרכשו. כאן, אנו מתארים הליך להשיג ולנתח את סרטי הקרינה של ס &#39; cerevisiae ללא ניסיון הנדרש בייצור מכשיר תרבית תאים או בפיתוח תוכנה (איור 1). ראשית, אנו פירוט פרוטוקול דוגמה ליצירת סרטי סדרת זמן הקרינה לשמרי ניצנים הביעו אחד או יותר כתבי ניאון. למרות שכבר נבנו תאי microfluidic תרבות מותאמים אישית והועסקו בעבר בהצלחה 11-13, אנו משתמשים במכשיר microfluidic זמין מסחרי מCellAsic (הייוורד, קליפורניה). מערכת תאי הגבולות לצמיחה monolayer ומאפשר שליטה מתמדת של סביבת זלוף. פרוטוקול מיקרוסקופיה אנו מציגים הוא אמצעי פשוט להשיג fluorescסרטי ence של שמרי ניצנים, אלא כל פרוטוקול ניסויי שונה (מכשיר תרבות מותאם אישית תנאי מדיה חלופיים, וכו &#39;). מניבים נתונים סרט הקרינה דומים של תאי שמרים בודדים עשויים להיות תחליף. בשלב הבא, אנו מתארים את הניתוח של הסרטים באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה בMATLAB (MathWorks, Natick, MA), המכונה GUI עבור ניתוח מהיר של סדרות עתיות הקרינה (שתלים), כדי לחלץ נתונים זמן סדרה לתאים בודדים. יש שתלי תכונות דומות לתוכנת 14 צדדי, הקוד פתוח חבילה נייד-ID בפילוח ומעקב אחר תאים וחילוץ בעוצמת הקרינה ומידע גיאומטרי. עם זאת, שתלים מספק תכונות חשובות נוספות. ראשית, היא מציעה עריכה אינטראקטיבית קלה של פילוח ותוצאות מעקב כדי לוודא דיוק הנתונים, ולא רק gating הסטטיסטי של עקבות אזור outlier לאחר ניתוח. יתר על כן, הוא מרחיב את הניתוח לautomaticallשושלת המיועדת y ונקודות מחזור תא עניין של שמרי ניצנים. קביעה כאשר האם והבת מתחלקות ליצירת שני אזורים סלולריים עצמאיים היא חיונית לקביעת תא כולו (אם לרבות כל ניצן מחובר) מדידות לאורך כל מחזור 8 התאים. החבילה מורכבת משלושה מודולים כדי לבצע משימות אלה. האזורים הסלולריים הקטעים הראשונים המבוססים על הניגוד בין תמונות שדה בהירות ממוקדות ולא ממוקדות, ומאפשר למשתמש להגדיר ולבחון את פרמטרים חזותי פילוח. המסילה השנייה (. באמצעות בלייר והיישום של Dufresne MATLAB של אל שגרת קרוקר et IDL, זמינה בכתובת: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/)</a> ומודדת אזורים סלולריים דרך זמן; מקצה אוטומטית שושלות, ומאפשרת בדיקה ויזואלית ותיקון שגיאות. GUI זומם פשוט כלול לנכסי תא בודד השאילתה. המודול השלישי מייחס ניצן הופעה והחלוקה TIMES, ומוציא כפלט את כל נתוני תא סדרת הזמן, כמו גם נגזרים בפעם הראשונה והשנייה שלהם (כפי שנדון ב9). מודול ניתוח פלטי את הנתונים כקובץ טקסט מופרדי רווחים למחקר שלאחר מכן בתוכנה הסטטיסטית של בחירה. לפיכך, החבילה מאפשרת למשתמש לחלץ נתוני סדרת זמן באיכות גבוהות באמצעות ממשק גרפי. יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי להעריך שיעורי שעתוק בזמן אמת בתאי שמרי ניצנים בודדים כפונקציה של מחזור התא 9. בעוד שמודולים שעברו אופטימיזציה עבור שמרי ניצנים, הפרמטרים או, במידת צורך, הקוד זמין באופן חופשי יכול להיות מותאם לאורגניזמים אחרים וסוגי תמונות. פילוח, מעקב, ושושלת אלגוריתמי הקצאה עשויים להיות ספציפיים לסוגי הדמיה הוקצתה ואורגניזם בשאלה. את האלגוריתמים הקיימים יכולים להיות מוחלפים, אבל עדיין שומרים על ממשק GUI המאפשר מעקב שגיאות שתמיד occu בדיקה ותיקון של פילוח חזותי ידידותית למשתמש וR עם כל אלגוריתם.

<table><tbody><tr><td>Y04C Yeast Perfusion Plate</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Microfluidic Perfusion Platform</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200 metal-halide arc lamp</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>set #89006</td><td>Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 controller and filter wheels</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>64-bit version handles large data files better than 32-bit</td></tr></tbody></table>

acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using grafts

מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה הפכה לכלי רב עוצמה בחקר תהליכים ביולוגיים רבים ברמת התא בודד. בפרט, סרטים המתארים את התלות הזמנית של ביטוי גנים לספק תובנות לגבי הדינמיקה של הרגולציה שלה, עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים לקבלת וניתוח של סרטי הקרינה של תאים בודדים. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי כדי להפיק נתונים כאלה, וממשק מבוסס MATLAB, משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה לכמת את תמונות הקרינה. מגזרי התוכנה ותאי מסלולים, מאפשרים למשתמש לאצור חזותי טעויות בנתונים, ומקצים באופן אוטומטי שושלת וזמני החלוקה. GUI נוסף מנתח את סדרת הזמן לייצר כל עקבות סלולריים, כמו גם נגזרות בפעם הראשונה והשנייה שלהם. בעוד התוכנה תוכננה עבור ס cerevisiae, מודולריות והרבגוניות שלו צריכה לאפשר לו לאo לשמש כפלטפורמה ללימוד סוגי תאים אחרים עם כמה שינויים.

ניסוי בוצע בהצלחה וניתח יניבו סדרת זמן מתמשכת בעיקר לתאים שלמים יחידים עם הופעת ניצן שהוקצה מציאותי ופעמי חטיבה. כדוגמה, ביצענו פרוטוקול לעיל עם זן שמרי הפלואידים להביע עותק משולב של חלבון פלואורסצנטי Cerulean (CFP) מונע על ידי האמרגן המכונן ADH1 כדי לבחון כיצד צמי...

Watch this Scientific Journal Video about Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS at JoVE.com

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

acquiring-fluorescence-time-lapse-movies-budding-yeast-analyzing

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  Massachusetts Institute of Technology. אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

Video: Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Bioengineering

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biochemistry

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D מיקרוסקופ של שמרים

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...