שיטה זו עוקבת אחר מבנים בתאי שמרים בשלושה ממדים לאורך דקות רבות, ומאפשרת לנו לחקור את הדינמיקה של אורגנים ותאים תאיים. הדמיה 4D מבטיחה כי אנו יכולים להסיק מסקנות אמינות על דינמיקה תאית, במיוחד עבור מבנים או סמנים שעשויים להיות ארעיים. הפגנת ההליך תהיה נטלי ג'ונסון, פוסט-דוק מהמעבדה שלי.
התחל על ידי גידול תרבות לילה של זן שמרים של עניין חמישה מיליליטר של סינתטי שאינו פלואורסצנטי מוגדר, או NSD, בינוני, בבקבוק מבולבל 15 מיליליטר עם aeration טוב, ב 23 מעלות צלזיוס. שלוש עד ארבע שעות לפני הניתוח, לדלל את תרבות שמרים שלב לוגריתמי במדיום NSD טרי, כך הצפיפות האופטית הסופית ב 600 ננומטר, או OD600, יהיה 0.5 כדי 0.8 בזמן ההדמיה. לפחות שעה אחת לפני שהתרבות מוכנה, צנטריפוגה aliquot של שני מיליגרם למיליליטר קונקבאלין פתרון במשך חמש דקות במלוא המהירות, כדי גלולה כל חלקיקים, ולהוסיף 250 microliters של supernatant לתוך צלחת מיקרוסקופיה תחתית זכוכית 35 מילימטר נקי.
לאחר 15 דקות, לשטוף את המנה פעמיים עד שלוש פעמים עם שני מיליליטר של מים מזוקקים לכל לשטוף, הוספת 250 microliters של תרבות השמרים לצלחת מצופה Concanavalin A לאחר שהוא מיובש. המתן 10 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק, לפני שטיפת המנה בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים נוספות עם שני מיליליטר של מדיום NSD טרי. ואז לכסות את התאים עם שני מיליליטר של NSD טרי.
כדי לדמיין את תאי השמרים, בחר עדשת טבילת שמן 63X עם צמצם מספרי של לפחות 1.4 במיקרוסקופ אור קונפוקלי. כאן, עדשה אובייקטיבית 100X ניתן להשתמש גם במקום עדשה אובייקטיבית 63X. לאחר מכן, מניחים את המנה על העדשה האובייקטיבית, הבחין בשמן טבילה.
מהתפריט הנפתח של הכרטיסיה מצב רכישה, בחר xyzt. תחת הכרטיסיה XY, עצב את גודל המסגרת לרוחב 256 בגובה 128. השתמש במהירות הסריקה המרבית, שהיא בדרך כלל בסדר גודל של שמונה קילוהרץ.
הפעל סריקת X דו-כיוונית אם היא זמינה, והתאם את גורם הזום לתשע, מה שיהפוך לגודל פיקסל של כ- 80 ננומטר. אם נעשה שימוש במטרה 100X, התאימו את גורם הזום בהתאם לשמירה על גודל פיקסל של כ-80 ננומטר. לאחר מכן הגדר את הצטברות הקו לארבעה או שישה.
הגדר את חור הסיכה ל- 1.2 יחידות אוורימיות והדליק את לייזר האור הלבן, אם הוא זמין. לאחר מכן הגדר את אורך גל העירור ואת כוח הלייזר אחוז עבור כל ערוץ פלואורסצנטי. אם אפשרות זו זמינה, אפשר את השימוש במצב ספירת פוטון תחת לשונית התצורה על-ידי ביטול הבחירה בזמן שילוב מרבי.
עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, הקצה גלאי רגישות גבוהה, הגדר את טווח אורך הגל של הפליטה והפעיל מצב ספירת פוטון, אם הוא זמין. הגדר את חלון gating הזמן ל 0.6 עד 10 ננו שניות עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, כדי למנוע לכידת אור משתקף מצלחת הזכוכית. לאחר מכן, הפעל הדמיית שדה בהיר ובחר גלאי רגישות נמוכה עבור איסוף הנתונים.
הפעל מצב דימות חי והגדל את הרווח בערוץ השדה הבהיר עד שהתאים יהיו גלויים בבירור. אם במצב ספירת פוטון, שנה את טווח הערכים האפורים מכדור ידני לאוטומטי כדי להציג את אות הפלואורסצנטי. הגדר את מחסנית Z כדי לדמיין את כל נפח תאי השמרים ולציין את הכיווניות של ההדמיה כך למטה נע לכיוון החלקת המכסה.
הגדר את מרווח הזמן של שלב Z ל- 0.25 עד 0.35 מיקרומטר כדי להשיג כ- 20 עד 25 מקטעים אופטיים לכל מחסנית Z והפעיל את זרימת Galvo אם היא זמינה. עבור סרט טיפוסי, הגדר את מרווח הזמן בין ערימות Z לשתי שניות והגדר את משך הסרט לחמש עד עשר דקות. לאחר מכן שמור את הסרט כקובץ LIF.
עבור פירוק סרטים, הפעל תוכנה מתאימה לפירוק המשתמשת באלגוריתם הערכת הסבירות המרבית הקלאסי, ופתח את סידרת הנתונים. בחר אשף פירוק ועורך פרמטרים כדי לאשר כי פרמטרי הדימות מזוהים ומוצגים כראוי. שנה את ערך מדד השחזור הבינוני המוטבע ל- 1.4 כדי להעריך את ציטופלסמת השמרים.
לאחר מכן השתמש בעורך כדי להעריך את מיקום עמוד השער. בחר הגדר את כל המאומתים ולחץ על קבל ובחר הזן אשף. לחץ על החץ הבא כדי לעקוף את בחירת פונקציית כפולת הנקודות ואת שלבי החיתוך שלפני העיבוד, והמשך דרך אשף האצלה עבור כל ערוץ פלואורסצנטיות.
בחר את פונקציית המיפוי האנכי הלוגאריתמית של המיפוי ובדוק את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות של הנתונים הגולמיים. הגדר ידנית כ למצב להערכת הרקע, הזן ערך רקע ולחץ על קבל. השאר את ערך האיטראציות המרבי על 40 והזן אות משוער ליחס רעש.
לאחר מכן כבו את תיקון האקונומיקה ולחצו על 'Deconvolve'. בחר קבל לערוץ הבא בחלון תוצאת deconvolution, אם הרעש מוסר מספיק מבלי לבטל את הפלואורסצנטיות המקורית מהמבנים העמום. לאחר שכל הערוצים הפלואורסצנטיים נותקו באופן משביע רצון, לחץ על הכל וסדר תחילה את הערוץ האדום, ואחריו ערוצי השדה הירוק, הכחול והבהיר, לעריכה הבאה ב- ImageJ.
לאחר מכן שמרו את רצף התמונה כקובץ TIF של שמונה סיביות ובחרו קובץ אחד לערוץ והניגודיות נמתחת במצב המרה. לתיקון אקונומיקה, יבאו את רצפי התמונה המפותלים ל-ImageJ ולחצו על 'תמונה', 'היפרסטאק' ו'מחסנית' ל'היפרסטאק' כדי להמיר את התמונות להגזמה. בחרו xyzct מהתפריט הנפתח והזינו את מספר הערוצים, פרוסות ערימת Z ומסגרת הזמן.
לתיקון ערוצי הפלואורסצנטיות להלבנת תמונות, בחרו 'תמונה', 'צבע', 'ערוצי פיצול' ובערוצי פלואורסצנט, בחרו 'תוספים', 'EMBLtools', 'תיקון אקונומיקה' ו'התאמה מעריכית'. לאחר מכן בחרו 'תמונה', 'צבע' ו'ערוצי מיזוג' כדי למזג את השדה הבהיר ואת ערוצי הפלואורסצנטיות מתוקנים להיפר-סטאק, ולשמור את ההיפר-סטאק המפותל והמכוולב עבור יצירת הסרטים והעריכה הבאים כקובץ TIF של שמונה סיביות. כדי להמיר את ערכת הנתונים המפותלת והמתוקנת למונטאז' מוקף, בחר תוספים, IJ_Plugins והפוך את סדרת מונטאז', ובחר את ההיפר-סטאק הרלוונטי של שמונה סיביות.
לחץ על פתח וסדר כדי לקבל את העובדה שכל הפרוסות ישמשו ליצירת המונטאז', ולחץ שוב על אישור כדי לקבל את ערך גורם קנה המידה המוצע. שמור את מונטאז' המקורי כקובץ TIF של שמונה סיביות ובחר תוספים, IJ_Plugins, סדרת מונטאז ' ל- Hyperstack ו- OK, כדי ליצור היפרסטאק 4D מהמונטאז ' המקורי הכולל את כל לוחות הזמנים. כדי ליצור את הסרט המוקרן הממוצע המקורי, בחר תחילה תוספים, IJ_Plugins, Project Hyperstack ו- OK, כדי לקבל את פרמטרי ברירת המחדל של ZProjection.
שמור את הסרט המוקרן הממוצע כקובץ TIF של שמונה סיביות ובדוק את הסרט כדי לזהות מבנים בודדים שניתן לעקוב אחריהם למשך תקופת התיוג שלהם. זיהוי מבנה שניתן לעקוב אחריו באופן אמין למשך הסרט, ולבודד מבנה זה לצורך ניתוח, הם השלבים הקריטיים ביותר של ההליך. לאחר מכן בצע את ההוראות במדריך למשתמש תוסף, כדי לבודד מבנים של עניין על ידי עריכת montage.
צור היפרסטאק 4D מהמונטאז' הערוך לתקופה הכוללת את מבני העניין, ושמור את ההיפר-סטאק הערוך. כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן עבור המבנה המבודד בהגזמה הדו-מימדית הערוכה, בחר תוספים, IJ_Plugins ונתח סרט ערוך, הזן את מרווח הזמן בין ערימות Z ולחץ על אישור. ליצירת סרט אחרון של המבנה המבודד, בחרו 'תוספים', 'IJ_Plugins' ו'היפרסטאק של פרוייקט', ציינו את פרוסות מחסנית Z שיש לכלול, בחרו 'עוצמה ממוצעת' כסוג ההקרנה ולחצו על הלחצן 'אשר'. כדי ליצור היפרסטאק 4D עם הנתונים המקוריים מעל הנתונים הערוכים, בחר תוספים, IJ_Plugins, מזג שני היפרסטאקים ומקם ראשון מעל השני. להפקת סרט מגזע ה-4D עם הנתונים המקוריים על הנתונים הערוכים, בחרו 'תוספים', 'IJ_Plugins' ו'היפרסטאק של פרוייקט', ציינו את פרוסות מחסנית Z שיש לכלול, בחרו 'עוצמה ממוצעת' כסוג ההקרנה ולחצו על הלחצן 'אשר'. כאן, ניתן להשוות את המסגרת הראשונה של הקרנת מחסנית Z של נתונים גולמיים לאותם נתונים מנופלים ונתונים מתוקנים מלבין.
מסגרות אלה מאותו סרט מנומק ותיקון אקונומיקה להראות שני cisternae שנותחו, אשר תווית ראשונה עם חלבון גליקוזילציה עמידות ונדאט ירוק 4 או סמן Vrg4, ומאוחר יותר עם הפרשת אדום 7 או Sec7 סמן חלבון הובלת גנים. מונטאז' זה, שנוצר מהיפרסטאק מנומק ואקונומיקה מתוקן, מציג את כל החלקים האופטיים בנקודת זמן אחת לפני ואחרי העריכה, כדי לאפשר בידוד של האות מאחד מהמצוות שנבחרו. בנתון זה, מספר מסגרות מהסרט הסופי של ערימות Z המוקרנות מוצגות עם ההקרנות המקוריות בחלק העליון של הדמות והקרנות ערוכות בתחתית.
כימות אותות הפלואורסצנט הירוקים והאדום מהססטרנה הגולגית שנבחרה מגלה כי סמן Vrg4 הירוק מגיע ונמשך כ-80 שניות, ולאחר מכן מגיע סמן ה-Sec7 האדום ונמשך כ-60 שניות, עם חפיפה קצרה בין שני הסמנים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזהות מבנים שניתן לעקוב אחריהם באופן חד משמעי לאורך כל חייהם. אותו סוג של ניתוח יכול להתבצע לאחר ביצוע מוטציה או סוג אחר של הפרעה ספציפית.
טכניקה זו פתחה את הדרך לחקר ההתנהגות הדינמית של אתרי יציאה מרטיקוליום Golgi ו- endoplasmic באמצעות שמרים כמערכת מודל.
