AV נתמכה על ידי עמיתי הבתר EMBO לטווח ארוך. מחקר במעבדת מרטין ממומן על ידי מענק מוצא ERC (GeometryCellCycle) ומענק קרן הלאומי למדע שוויצרי (31003A_155944) כדי SGM.

ניתוח מיקרוסקופי של רבייה מינית שמרי ביקוע 1. הכנת Media <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מינימום נביגה (MSL-N) 15 על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: גלוקוז: 10 גר &#39;/ ל, KH 2 PO 4: 1 גר&#39; / ל, NaCl: 0.1 גר &#39;/ ל, MgSO 4 · 7H 2 O: 0.2 גר&#39; / ל הוספת יסודות קורט (10,000x): 100 μl / L, ויטמינים (1,000x): 1 מ&quot;ל / L, ו -0.1 M CaCl 2 &#160; מ&quot;ל / L. מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל 0.22 מיקרומטר נקבוביים ולאחסן בטמפרטורת חדר (RT). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ויטמינים הבאים (1,000x) במלאי: Pantothenate: L / g 1, ניקוטינית חומצה: 10 גר &#39;/ ל, אינוזיטול: 10 גר&#39; / ל, ביוטין: 10 מ&quot;ג / ליטר. מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש יסודות קורט הבאים (10,000x) במלאי: חומצת בור: 5 גר &#39;/ ל, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 גר&#39; / ל Moo 3,: 0.4 גר &#39;/ ל, KI: 1 גר&#39; / ל, CuSO 4· 5H 2 O: 0.4 גר &#39;/ ל, חומצה ציטרית: 10 גר&#39; / ל. מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן MSL-N Agarose 2% (המשמש לייצור תאי כרית agarose) על ידי שילוב של 10 מ&quot;ל MSL-N עם 0.2 גרם של agarose. ממיסים עבור ~ 2 דקות בהספק גבוה במיקרוגל עד להמסת agarose ו -0.5 מ&quot;ל aliquot צינורות microcentrifuge. חנות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מינימום נביגה עם חנקן (MSL + N) מ MSL-N ידי הוספת (NH 4) 2 SO 4: 1 גר &#39;/ ל, לאוצין: 0.225 g / L, אדנין: 0.225 g / L, אורציל: 0.225 g / L . מסנן לעקר באמצעות מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר. חנות ב RT. הערה: לאוצין, אדנין ו אורציל מתווספים בינוני זו כדי לאפשר צמיחה של זני auxotrophic. יש לכלול תוספת חומצות אמינו נוספת אם הזן המשמש נושא auxotrophy מובהק (למשל his3Δ). כמו כן, שים עבודה עם זני prototroph מלא מומלץ, כמו שרקזנים כאלה ייאפשרו יעילות הזדווגות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 200 מיליליטר VALAP לאיטום קאמרי. בכוס להוסיף משקל זהה של לנולין, וזלין (או וזלין אחר), וכן פרפין. תערובת חום בטמפרטורה נמוכה ומערבבים מדי פעם עד לקבלת תערובת אחידה היטב. Aliquot את התערובת לתוך כמה צלחות פטרי קטנות. חנות ב RT. </li></ol> 2. זני שמרים Culturing ביקוע לניסויים מזווגים (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1, ערב: לחסן טרי זנים ומפוספסים מן התקשורת מוצקה לתוך צינורות תרבות המכילים 3 מיליליטר של MSL + N. השתמש צינורות שטוח בתחתית בקוטר כ -2.5 ס&quot;מ. השתמש צינורות או צלוחיות תרבות אחרים עם נפח תרבות מותאם. דגירה לילה (O / N) עם רועד ב 25 ° C, 200 סל&quot;ד. אם עובד עם זני heterothallic, לחסן בנפרד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל השעיות תא התקשורת למחרת בבוקר כדי לוודא שיש תרבויות צפיפות אופטית נמדד ב 600 ננומטר (OD 600) של 0.4-0.8 בערב. הערה:OD 600 מדידות כמו פרוקסי של ריכוז התא עבור שמרים ביקוע הם ליניאריים בטווח של כ 0.1-1.0. לקבלת OD ספקטרופוטומטר שלנו 600 = 0.1 תואמים 1.4 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. לכן, אם ראשוני OD 600 קורא הם מחוץ לטווח זה דגימות צריכות להיות דלילות / מרוכז למדידות אמינות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2, ערב: לדלל התאים ב 20 מ&quot;ל של התקשורת MSL + N כדי OD 600 = 0.025 100 מ&quot;ל צלוחיות. דגירת זני O / N ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד. הערה: בתרביות תאי wild-type צריכות להגיע OD 600 ~ 0.8 למחרת בבוקר (15 שעות מאוחר יותר). אם עובד עם זנים עם זמן דור כבר להתאים דילול בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3, הבוקר: מדוד OD 600 לוודא שיש תרבויות צפיפות התאים של OD 600 ~ 0.8. אם עובד עם זני heterothallic, לערבב מספר שווה של תאי שותף. תאים גלולים XG ב 1000 ולהעביר 1.5 מיליליטרצינור. שטפו תאים שלוש פעמים 1 מ&quot;ל של מדיום MSL-N. Re להשעות תאים 3 מ&quot;ל של מדיום MSL-N ו לדלל התאים OD 600 = 1.5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח זיווג בין תאי אחות ישירות הר תאי הדמיה (ראה פרוטוקול סעיף 2.4). השתמש זני h90 homothallic, שבה מיתוג סוג ההזדווגות יתקיים במהלך חטיבות mitotic שהתרחשו לאחר קיפוח חנקן. הרכבה מיידי של תאים על כרית agarose מבטיח כי, לאחר חלוקת התא, אחות-התאים נשארים אחד ליד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח קיטוב תא (דינמיקת גישוש shmooing) דגירה 1-3 מיליליטר של תרבית תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד במשך 3-4 שעות לפני תאי הרכבת הדמיה. בתוך 3-4 אלה hr, חטיבת mitotic האחרונה תהיה התרחשה. כמה תאים יהיו יזמיו קיטוב, אבל הכי פשוט יהיה החל דינמיקת קיטוב הגישוש שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח איחוי תאים תאים דגירה 1-3 מ&quot;ל של תרבית תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד במשך 4-6 שעות פריאו הרכבת תאי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח אירועים שלאחר היתוך דגירת 1-3 מיליליטר של תרביות תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד במשך 8 שעות לפני הרכבת תאי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח בתגובת ריכוז פרומון מסוים (רק עבור זני heterothallic) דגירה 3 מיליליטר של תרבית תאים על 30 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד במשך 3-4 שעות לפני הרכבת תאי הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור microcentrifuge MSL-N-המכיל מהגוש 95 ° C החום (ראה סעיף 2.4.1 פרוטוקול. להלן). להוסיף P-גורם או M-גורם בריכוז הרצוי ישירות agarose MSL-N נמס. מערבבים היטב על ידי vortexing לפני ההכנה כרית מיידית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תא הרכבה, דגירת הכרית במשך 15-30 דק &#39;ב 25 ° C לפני ההדמיה. P-factor ו פרומונים M-גורם שימשו מפתרון המניות של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מתנול. הערה: אם עובד עם מוטצית זני פעמי דגירה עשויות להשתנות. התקבצות של תאים עלולה להתרחש לאחר דגירה ממושכת מ נוזלedia ועלול להיות חזק במיוחד זנים מוטנטים כמה. תאים מגושמים לא ניתן הבחינו על כריות agarose בשכבה אחת ובכך שקשה פוקוס אוטומטי ותמונה. במקרה התקבצות תא נרחב הר תאים על כריות agarose מייד לאחר שטיפות מחדש השעיה בתקשורת חסרת-חנקן (כמו באזור הפרוטוקול 2.3.1.) דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת תאי הדמיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן MSL-N רפידות agarose 16 על ידי המסת דוגמא מתמיסה בסיסית בתוך גוש חום 95 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות והוספה 200 μl בין שתי שקופיות זכוכית מופרדות מפרידים (האיור 1B). השתמש מפרידים בעובי של ~ 0.5 מ&quot;מ. כדי להפוך מפרידים, רצועות שימוש לגזור קרטון, כגון נמסר כי עם אנזימי הגבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 100 μl של תאים XG ב 1000 דקות 1, להסיר את supernatant מחדש להשעות תאים בינוניים שיורית 2-4 μl. לא מחדש להשעות במדיום טרי כמו שהוא מעכבהזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2-3 דקות להסיר בזהירות מפרידי שקופיות הזכוכית העליונות. אם מספר זנים הם להיות מותקנים, להכין את התא מתרכז לפני הכנת כרית agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של תאים לרפד ולחכות עד הטיפה ומתחילה לנגב (~ 1 דק &#39;) לפני הכיסוי עם תלוש כיסוי ואיטום עם VALAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן הכרית לשבת במשך לפחות 30 דקות לפני ההדמיה של 25 מעלות צלזיוס או RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל תערובת של תאים בשלבים שונים של הזדווגות, לבצע משטח מיד לאחר שטיפות ב MSL-N (ראה סעיף 2.3.) ו לדגור על 18 ° CO / N (~ 15 שעות). גישה זו שימושית עבור הדמית תאים בשלבי הזדווגות נפרדות עם רזולוציה גבוהה זמנית או דוגמאות עם אות חלשה. </li></ol></li></ol> 3. Live- תא הדמיה של תאי שמרי הזדווגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם גדרות רכישת תמונה. הערה: הגדרות רכישת תמונה המוצגת כאן היו אופטימיזציה עבור פלטפורמת DeltaVision המורכבת IX-71 אולימפוס אישיתמיקרוסקופ הפוכה עם תכנית Apo 60X / 1.42 NA או U-תכנית Apo 100X / 1.4 מטרות NA, מצלמת CoolSnap HQ2 וכן מאייר היחיד בשילוב Insight SSI 7 צבע. החומרה נשלטת על ידי v4.1.2 softWoRx כי גם מאפשר autofocusing הדיגיטלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי מרווחי autofocusing לא יעלו על 15 דקות מאז להיסחף-Z לאורך זמן ארוך יותר יכול לעלות את היכולת של מערכת autofocusing תוכנה. אם באמצעות מערכת autofocusing מבוסס חומרה, להשתמש במרווחים גדולים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם מרווח הדמיה. קח תמונות כל 10 דקות במשך ~ 15 שעות כנקודת מוצא כשעובדים עם מתויג חלבון fluorescently בפעם הראשונה. מרווח זה מספק סקירה טובה של תהליך ההזדווגות כולו ללא הלבנה נרחבת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה עם 5 מרווחי דקות או קצרים לאירועי שעה במדויק יותר כגון היתוך. במרווחי זמן קצרים יותר דורשים fluorophores החזק המאפשר פעמי חשיפה נמוכות לבן קטן. עבור הדמיה עם מרווחים מתחת ל -1 דקות להימנע O / מיקרוסקופיה Nובמקום להכין תערובת של כל שלבי ההזדווגות כמפורט בסעיף 2.4.6 פרוטוקול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם זמן חשיפת תמונה. פעמי חשיפת מבחן בין 50 ל 300 אלפיות שניים. מטרתם היא למצוא איזון בין יחס אות-רעש photobleaching כדי להשיג מספר רב של נקודות זמן עם אות ניתן להבחין (בדרך כלל מעל 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם-חתך Z. מדורים כל 0.3 מיקרומטר 5 מיקרומטר כיסוי לספק עומק הדמיה טוב. שים לב-נזק התמונה עליות נוספות חתך-Z, אשר ניתן למזער על ידי שימוש OAI (אינטגרציה לציר האופטי - רכישה לטאטא יחיד של עומק כלל המדגם). מערכת פוקוס אוטומטי טוב מפחיתה את הצורך Z- קטעים רבים והוא מומלץ מאוד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפים ללמוד התנהגויות זיווג סוג ספציפיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זני heterothallic, השתמש h- ו- H + תאי מבטאי fluorophores ברור, כך ששני סוגי התאים ניתן להבחין. השתמש בכל fluoropho מקודד גנטימחדש הביע כגרסה או היתוך cytosolic לחלבון אנדוגני, אם כי יש לנו הצלחה טובה עם sfGFP, גרסה מהירה מתקפלים של GFP 17. חלבונים אנדוגניים בדרך כלל מתויגים ב מוקד הגנומי אנדוגני שלהם על ידי רקומבינציה הומולוגי 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זני homothallic, לבטא חלבון פלואורסצנטי cytosolic מקודד גנטי בשליטת יזמים ספציפיים סוג ההזדווגות כגון אלה של גני קולטן פרומון map3 ו mam2 לנהוג הביטוי בתאי P ו- M, בהתאמה. היזמים של map3 ו mam2 אינם פעילים במהלך הצמיחה וגטטיבי והם המושרה על רעב חנקן 18,19. בונה נהיגה הביטוי של ה- GFP cytosolic או mCherry בשליטת היזמים אלה משולבים בדרך כלל מוקד גנומית (ura4, leu1) כי אינו מתערב עם התקדמות נורמלית במחזור חיי המין 12. </li></ol></li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסוג ההזדווגות fluorophores ספציפיים cytosolic (כמו בסעיף פרוטוקול 3.2.2) כדי לקבוע תזמון מדויק של איחוי תאים דמיינו כמו העברת אות ניאון מתא שותף אחד למשנהו. </li></ol> 4. כימות היעילות המזווגת ופיוז&#39;ן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את היעילות ההזדווגות ואיחוי 11,12, תאים במקום מיד לאחר MSL-N לשטוף על כריות agarose MSL-N, כמו בשלב 2.3.1 לעיל, ולהשאיר למשך 24 שעות ב 25 ° C לפני הדמיה (איור 1 א). שימוש בפרוטוקול זה יעילות הזדווגות זן פראי סוג homothallic מגיעה ~ 60% ויעילות פיוז&#39;ן 99%. כדי לבחון האם ירידה בכמות הערכים אלה נצפו זנים מוטנטים לשקף פנוטיפ מסוף או עיכוב, לחזור על הניסוי עם זמן דגירה 36 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יעילות הזדווגות כמו <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> זוגות זיווג לכלול zygotes, asci, וזוגות תא unfused זיהה מןהמיקום ואת הצמיחה שלהם אחד כלפי אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יעיל היתוך כמו <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> הערה: זוגות הזדווגות חיפוי מזוהים על ידי היכולת שלהם ליצור נבגים אם ידוע כי המוטציה נחקרת אינה משפיעה נביגה. אם נביגה לא ניתן להשתמש כמו-אאוט לקרוא, ההיתוך נקבע על ידי התבוננות הפצת סמן cytosolic לידי ביטוי רק אחד מבני זוג הזדווגות לתוך שני בני הזוג. </li></ol>

<ol>
	<li>Mata, J., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+roles+of+Ste11p,+cell+type,+and+pheromone+in+the+control+of+gene+expression+during+early+sexual+differentiation+in+fission+yeast.">Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).</li><li>Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+pheromone-targeted+transcription+in+fission+yeast.">Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast.</a> BMC Genomics. 7, 303 (2006).</li><li>Klar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+studies+of+fission+yeast+mating-type+switching+and+silencing.">Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing.</a> Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).</li><li>Beach, D. H., Klar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+transposable+mating-type+cassettes+of+fission+yeast.">Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast.</a> EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).</li><li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+and+fuse:+how+yeast+cells+do+it.">Mate and fuse: how yeast cells do it.</a> Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).</li><li>Mochizuki, N., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+in+the+intracellular+cAMP+level+triggers+initiation+of+sexual+development+in+fission+yeast.">Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast.</a> Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).</li><li>Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+ste11++encodes+a+transcription+factor+with+an+HMG+motif+that+is+a+critical+regulator+of+sexual+development.">Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development.</a> Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).</li><li>Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activation+of+the+fission+yeast+pheromone-responsive+pathway+induces+ectopic+meiosis+and+reveals+ste11+as+a+mitogen-activated+protein+kinase+target.">Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target.</a> Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).</li><li>Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+encoding+a+G-protein+alpha+subunit+from+Schizosaccharomyces+pombe:+involvement+in+mating+and+sporulation+pathways.">Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).</li><li>Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+genes+that+confer+resistance+to+staurosporine+encode+an+AP-1-like+transcription+factor+and+a+protein+kinase+related+to+the+mammalian+ERK1/MAP2+and+budding+yeast+FUS3+and+KSS1+kinases.">Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases.</a> Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).</li><li>Bendezu, F. O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+explores+the+cell+periphery+for+mate+selection+in+fission+yeast.">Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast.</a> Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).</li><li>Dudin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-led+premeiotic+chromosome+movement+in+fission+yeast.">Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast.</a> Science. 264 (5156), 270-273 (1994).</li><li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+pheromone+production+and+response+in+fission+yeast+by+a+halo+test+of+induced+sporulation.">Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation.</a> Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).</li><li>Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+nuclear+positioning+in+fission+yeast+based+on+microtubule+pushing.">A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing.</a> J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Kitamura, K., Shimoda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Schizosaccharomyces+pombe+mam2+gene+encodes+a+putative+pheromone+receptor+which+has+a+significant+homology+with+the+Saccharomyces+cerevisiae+Ste2+protein.">The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein.</a> EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).</li><li>Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+map3++encodes+the+putative+M-factor+receptor.">Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor.</a> Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).</li><li>Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+type+V+myosins+in+fission+yeast,+one+of+which+functions+in+polarized+cell+growth+and+moves+rapidly+in+the+cell.">Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell.</a> Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).</li><li>Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+of+fission+yeast+at+the+onset+of+nitrogen+starvation.">Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation.</a> Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Dyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+shallow+chemical+gradients+by+actin-driven+wandering+of+the+polarization+site.">Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site.</a> Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).</li><li>Beta, C., Bodenschatz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tools+for+quantitative+studies+of+eukaryotic+chemotaxis.">Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis.</a> Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+assay+of+single+cell+chemotaxis.">Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

תנאים סביבתיים, וזמינות מזינה בפרט, מאוד משפיעים על הפיסיולוגיה שמרים ביקוע. רעב חנקן הכרחי מחויב הרבייה המינית בתחילה מובילה לשינויים בולטים את התקדמות מחזור תא mitotic (Ref. 21 ואיור 2). לאחר הסרת חנקן מן האוכלוסייה גדלה באופן אקספוננציאלי, גודל תא בחטיבה י?...

למרות חילופי גנטי בין שני תאים הוא האירוע המרכזי ברבייה מינית, היא מסתמכת על שרשרת האירועים מקדמים התמיינות תאים, לאפשר בחירה שותף, לבצע איחוי תאי תאים ולשמור על יציבות גנומית. כך מחזור החיים המיניים מציגים את עצמו כמערכת מודל ללמוד מספר השאלות ביולוגיות לגבי מתגים התפתחותי, בתגובה לגירויים חיצוניים, היתוך קרום פלזמה, פרדה כרומוזום, וכו &#39;היכרות עם שמרי ביקוע מחזור מיני ללמוד תופעות אלה מביאה את היתרונות של גנטיקת העצמה של מודל המערכת, ומבוסס גישות תפוקה גבוהה במיקרוסקופ משוכלל. סקס בשמרי ביקוע הוא אירוע heterotypic בין תא-P ו- M-תא של סוגי הזדווגות ברורים. שני סוגי התאים דיפרנציאלי להביע מספר הגנים 1,2 כולל אלה לייצור של P-המופרש ו- M-פרומונים, פרומון קולטנים Map3 ו Mam2 וכן פרומון פרוטיאהses Sxa1 ו Sxa2. זנים Homothallic, כגון זן h90 נפוץ, לשאת את המידע הגנטי לשני סוגי ההזדווגות בגנום יחיד התאים עוברים דפוס מורכב של מיתוג סוג ההזדווגות לאורך כל מחזור החיים mitotic (הנסקרת נ&quot;צ. 3). מבודד מרובה של ביקוע שמרי heterothallic כי לעתים רחוקות או אף פעם לא יחליף את סוג ההזדווגות משמש גם 4 נפוץ, ובעיקר את h + N (P-type) ו- h -S (M-סוג) זנים. בשמרי ביקוע, כניסת מחזור החיים המיניים נמצאת תחת רגולציה קפדנית תזונתית. רק בתאי שמרי ביקוע מורעבי חנקן לעצור רביית mitotic ולייצר פרומונים diffusible לאותת נוכחות של שותף הזדווגות ולקדם צעדים נוספים של המחזור המיני (הנסקרת נ&quot;צ. 5). מניעת חנקן דה-מדחיק את הרגולטור תעתיק המפתח של Ste11 ההזדווגות שפועל כמתג התפתחותי ומקדם דוארxpression הזדווגות גנים ספציפיים כולל קולטן פרומון ואת הגנים ייצור פרומון 6,7. אירוסי פרומון קולטן מפעילים את החלבון בשילוב קולטן G-אלפא ואיתות MAPK במורד זרם אשר משפר עוד יותר פעילות תעתיק Ste11 8-10, ובכך להגדיל ייצור פרומון בתוך משוב חיובי בין בני זוג הזדווגות. רמות פרומון הם קריטיים כדי לגרום מצבי קיטוב תאים שונים על ידי ויסות מארגן אדון קוטביות התא, Cdc42 GTPase Rho-משפחה 11. בחשיפה לריכוזים נמוכים פרומון, פעיל Cdc42 היא דמיינה בטלאים דינמיים לחקור את פריפרית התא, ולא צמיחת תאים הוא ציינה בשלב זה. רמות פרומון מוגברים לקדם את התייצבות פעילות Cdc42 לאזור וצמיחה יחיד של הקרנה מקוטבת, כינה את shmoo, מה שמביא תאים שותף בקשר. בהמשך לכך, שני שותפי הזדווגות הפלואידים פתיל כדי ליצור זיגוטה דיפלואידי. מחקר שנערך לאחרונה מגלה הקיומו דואר של מבנה יקטין רומן חיוני היתוך שמורכב על ידי formin מושרה ההזדווגות Fus1 12. מוקד היתוך זה מתרכז תהליכים התלויים שרירן הסוג-V ו- ממקם את המכונות שפלות דופן תא, ובכך מאפשר שיפוץ של דופן התא כדי לאפשר מגע קרום פלזמה ללא תא תמוגה 12. לאחר איחוי תאים תאים, הגרעינים באים במגע ועוברים karyogamy. תנועה בולטת-dynein תלויים גב ו-ושוב של גרעין בתוך הזיגוטה (תנועת זנב סוס) אז מקדם ההתאמה של homologs כרומוזום 13,14, אשר מלווה המיוזה. לבסוף, ארבעה מוצרים של המיוזה ארוזים לתוך נבגים בודדים במהלך נביגה. בגלל המורכבות שלה ואת הצעדים הרבים המעורבים, ניטור של הזדווגות מפורט כבר מאתגר. שני קשיים בולטים הן כי התהליך כולו לוקח הרבה מעל חמישה עשר שעות וכי תאים קשים לסנכרן. אלה דifficulties אפשר להערים על ידי גישות מיקרוסקופיה תא בודד. הנה פרוטוקול החקירה כללי מחזור החיים מינית בשמרי ביקוע מוצגים. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה מאפשר הלימוד של כל השלבים השונים של התהליך, כלומר האינדוקציה של תוצר גן הזדווגות, קיטוב תא זיווג בין-תאי ואחות אחרי מיתוג סוג ההזדווגות בין בני זוג לא-אחות, היתוך תאי תאים, ופוסט היתוך סוס זנב התנועה, המיוזה ו נביגה. שיטה זו מאפשרת ל -1) בקלות לדמיין fluorescently מתויג חלבונים לאורך זמן מראש, במהלך פיוז&#39;ן פוסט; 2) להפלות את התנהגותם של תאים מסוג ההזדווגות מול; ו -3) למדוד ולכמת פרמטרים כגון shmooing, הזדווגות, איחוי או יעיל נביגה.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71381</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>AppliChem</td><td>A2088,0025</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>AppliChem</td><td>A0963,0100</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>AppliChem</td><td>A1716,0100</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>AppliChem</td><td>A0967,0250</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1038,0250</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A3514,0250</td><td></td></tr><tr><td>Molybdenum oxide (VI) (MoO&lt;sub&gt;3)&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69850</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>AppliChem</td><td>A3872,0100</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A1034,0500</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2344,0500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01217.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Reactolab</td><td>92045-74-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Reactolab</td><td>7005600</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

צמיחת ביקוע שמרים והזדווגות Dynamics עם וסילוק מקור חנקן כמו רעב חנקן הוא תנאי הכרחי חניכה של רבייה מינית בשמרי ביקוע, h90 זן homothallic wild-type היה פיקוח על מעבר בין חנקן עשיר עד בינוני מקופח חנקן (איור 2), בעקבות הפרוטוקול המתואר באיור 1.</str...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle at JoVE.com

מיקרוסקופיה של שמרים ביקוע מחזור חיים מיני | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

microscopy-of-fission-yeast-sexual-lifecycle

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Human Biology

Reproduction and Development

SCIENTISTS IN ACTION

14.4K Views.  University of Lausanne. We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process. 

Video: Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Genetics

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biochemistry

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

זיהוי תרופות המשפיעות על פילמור חלבונים ציטו-שלד חיידקיים

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB have emerged as important targets for novel antimicrobial discovery. Several assays have been developed to identify compounds targeting nucleotide binding and polymerization of these cytoskeletal proteins, primarily focused on FtsZ. Moreover, many of the assays are either laborious or cost-intensive, and ascertaining whether these proteins are the cellular target of the drug often requires multiple methods. Finally, the toxicity of the drugs to eukaryotic cells also poses a problem. Here, we describe a single-step cell-based assay to discover novel molecules targeting bacterial cytoskeleton and minimize hits that might be potentially toxic to eukaryotic cells. Fission yeast is amenable to high-throughput screens based on microscopy, and a visual screen can easily identify any molecule that alters the polymerization of FtsZ or MreB. Our assay utilizes the standard 96-well plate and relies on the ability of the bacterial cytoskeletal proteins to polymerize in a eukaryotic cell such as the fission yeast. While the protocols described here are for fission yeast and utilize FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli, they are easily adaptable to other bacterial cytoskeletal proteins that readily assemble into polymers in any eukaryotic expression hosts. The method described here should help facilitate further discovery of novel antimicrobials targeting bacterial cytoskeletal proteins.

Author Spotlight: Exploring Cytoskeletal Dynamics to Reveal Novel Antibiotics through Innovative Cell-Based Assays

Fission yeast is used here as a heterologous host to express bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB as translational fusion proteins with GFP to visualize their polymerization. Also, compounds that affect polymerization are identified by imaging using a fluorescence microscope.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...