עבודה זו נתמכה על ידי מענק הצטיינות סקירה (NEUD-004-07F) מהמנהל הוותיקים (לSP).

1. הרחבת NPCs האדם (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיות את המניה הקפואה של NPCs אדם מהמוח העוברי (Lonza, Walkersville, MD, ארצות הברית) ותרבותם בהשעיה בT-75 צלוחיות כneurospheres (איור 1 א) במדיום neurobasal המכילה תוספי התפשטות, EGF (10 ng / ml) ו FGF (10 ng / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 ימים בתרבות, להעביר את neurospheres לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 500 סל&quot;ד במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant והותיר אחריו ~ 100 בינוני μl מעל התא גלולה ולהעביר לתוך צינור Eppendorf. גלולה 100 תא μl מספיק להתפצל ל2 T-75 צלוחיות. אם פחות, לצמצם את מספר צלוחיות כתאי neuroprogenitor מצליחים להתרבות אם לפצל דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate את הכדור עם קצה μl 200 50x, תוך שמירה על קצה 200 μl נגד החלק התחתון של הצינור. מחלקים את ההשעיה התא באופן שווה לשני חלקים ולהוסיף אותם ל2 T-75 צלוחיות (1-2 מפוצל), אחת להמשיךהתרחבות ונוספת לבידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך התרבות של תאי neuroprogenitor להרחבה (בקבוק הראשון) על ידי שינוי הבינוני כל 4-5 ימים עד neurospheres להגיע לגודלם המקורי של 300-500 מיקרומטר. השנה בינונית על ידי צנטריפוגה (סל&quot;ד 500; 5 דקות), לבטל את המדיום הישן ולהוסיף מדיום חדש. </li></ol> 2. בידול של NPCs האדם לתרבות Neuron עשירה (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמיינות של תאי neuroprogenitor לתרבות עשירה של תאי עצב, במקום coverslip יחיד לבאר כל צלחת 24 גם ומעיל עם 100 / מיליליטר מיקרוגרם של פולי-L-ליזין על ידי הוספת 500 μl לכל אחד. דגירה את הכלים ל30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב-L-ליזין פולי הפתרון ולשטוף את הצלחת עם מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, מעיל הבארות של הצלחת עם 500 μl 5 laminin עכבר מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה במשך 30 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את הבארות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ימים לאחר splitting התאים (שלב 1.4), להעביר את neurospheres הקטנה בבקבוק שכותרתו &#39;לבידול&#39; לכלים מצופים בצפיפות של ~ 500 neurospheres לכל טוב של צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 שעות, כאשר neurospheres לצרף הצלחת, להסיר את מדיום ההתפשטות ולהוסיף בינוני בידול בהיקף של מדיום neurobasal, תוסף B27, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 מ&quot;מ), וחומצה רטינואית (2 מיקרומטר). </li></ol> 3. הכתמה Immunofluorescence של NPCs הבדיל (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התרבות של תאי neuroprogenitor במדיום בידול עצבי במשך שבועיים, תרבות נוירון עשיר מתקבלת. יש לשטוף את תאי העצב פעם אחת ב PBS ולאחר מכן לתקן אותם בparaformaldehyde 4% במשך 30 דקות. ברגע שנקבע, יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם חיץ permeabilization (BSA 5% ו0.2% טריטון X-100 PBS) ב RT עבור 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות O / N ב 4 i C °שייקר na עם השילוב הבא של polyclonal ונוגדנים חד שבטיים בBSA 3% ב-PBS: NeuN (1:250) וsynapsin (1:250); אצטיל כולינסטרז (1:500) וsynaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) וGAP43 (1:250); STAT3 (1:500) וGFAP (1:1,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה אותם עם נגד ארנב-Cy3 ונוגדנים משני אנטי עכבר FITC ב RT בחושך במשך 90 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 10 μl של מדיום הרכבה על גבי זכוכית, להוציא את coverslip ממנת התרבות עם מלקחיים, ולמקם אותו במהופך על ההרכבה בינונית. בעדינות, לנגב כל מדיום הרכבה עודף וסוגר את הקצוות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את הנוירונים immunostained במיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 4. Microdissection לכידת לייזר של נוירונים (איור 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל NPCs לתרבות נוירון עשיר בשקופית קרום PENs מצופה laminin פולי-L-ליזין והעכבר בעקבות ההליכים המתוארים באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל השלבים הבאים בתנאי RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התרבויות באמצעות HistoGene כתם (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא האזורים של אוכלוסיות נוירונים טהורות נטולות האסטרוציטים באמצעות תמונת מפת הדרכים של כל השקופית עם מערכת Veritas LCM. סמן את תאי העצב באמצעות כלי הציור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע לכידת לייזר של אזורים אלה באמצעות דיוק מבוקר מחשב ואוטומציה בתהליך בן שני שלבים. ראשית, IR (אינפרא אדום) הוא ירה בנקודות מרובות עם הגדרת חשמל לייזר של 70 mW ודופק של 2,500 μsec כדי לקבל הקרום לצרף את הכובע. בשלב בא, באזור המסומן הוא נכרת באמצעות כלי חיתוך UV בהגדרת רמה נמוכה של 10 mV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב של תהליכים אלה באופן סלקטיבי לוכד את האזורים המסומנים מן הקרום PEN על כובעי מאקרו CapSure LCM. כאשר הכובע הוא הרים, הקרום עם neurons שומרת על הכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA הכולל דגימות LCM באמצעות ערכת PicoPure RNA בידוד (ארקטורוס) ולטפל עם DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את RNA הבודד באמצעות ערכת ההגברה RiboAMP RNA הבאה הוראות מהערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח בזמן אמת RT-PCR באמצעות בדיקות TaqMan לזהות שרשרת כבדה neurofilament האנושי (hNFHc). </li></ol> קיצורים: לספירה, מחלת אלצהיימר; BDNF, גורם נוירוטרופי שמקורם במוח; CREB חלבון, מחזורי אלמנט תגובת AMP מחייב; DBC, AMP המחזורי Dibutyryl; EGF, גורם הגדילה באפידרמיס, FGF, גורם גדילה פיברובלסטים; GFAP, חלבון חומצי fibrillary גליה; LCM, לייזר ללכוד microdissection; NGF, גורם גדילה עצבי; NPC, neuroprogenitor תא; PEN, naphthalate פוליאתילן.

<ol>
	<li>Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+identity+of+neural+stem+cells.">The glial identity of neural stem cells.</a> Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).</li><li>Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+an+overview.">Neural stem cells: an overview.</a> Circ. Res. 92, 598-608 (2003).</li><li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases:+a+review.">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review.</a> J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).</li><li>Breier, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+as+models+for+high-throughput+screens+of+developmental+neurotoxicity:+state+of+the+science.">Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+supplementation+of+differentiating+human+neural+progenitors+and+embryonic+stem+cells+leads+to+enhanced+neurogenesis+in+vitro.">Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro.</a> J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuronal+gene+expression+with+laser+capture+microdissection.">Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection.</a> J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).</li><li>Robles, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+gene+expression+profiling+in+spatial+discrimination+learning.">Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning.</a> Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).</li><li>Su, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ethanol+versus+formalin+fixation+on+preservation+of+histology+and+RNA+in+laser+capture+microdissected+brain+tissues.">Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues.</a> Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).</li><li>Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+CREB+expression+in+Alzheimer's+brain+and+in+Abeta-treated+rat+hippocampal+neurons.">Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons.</a> Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).</li><li>Dworkin, S., Mantamadiotis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CREB+signalling+in+neurogenesis.">Targeting CREB signalling in neurogenesis.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+perspectives+of+neural+stem+cell+differentiation:+from+neurotransmitters+to+therapeutics.">Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.</a> Cytometry A. 75, 38-53 (2009).</li><li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells.">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li><li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים להכריז.

אנו מתארים במחקר זה מודל הנוירון עשיר בתרבית תאים בהתמיינות של תאי neuroprogenitor אנושיים עצמי חידוש ושיטה לבודד את אוכלוסייה טהורה של תאי עצב על ידי microdissection ללכוד לייזר. יש לנו השתמשתי בשילוב של NGF, BDNF, DBC וחומצה רטינואית לבידול עצבי של NPCs. DBC משמש להפעלת CREB, גורם שעתוק שמשפר את הנוירוגנזה 12. חומצה הרטינואית גורמת ליציאת מחזור התא ומפחיתה את אוכלוסיית גליה 13. השיטה המתוארת במחקר זה משלבת שינויים על הדוח הקודם שלנו 14. אנחנו קודם לכן השתמשנו בצעד של triturating neurospheres להשעית תא בודד ולאחר מכן זריעתו בצלחות מצופים. זה יכול להוביל לבידול עצבי לא יעיל באזורי צפיפות הנמוכה (2E איור). עכשיו יש לנו הצגנו את ההליך של זריעת neurospheres הקטנה בן ארבעת הימים (איור 1), כדי להבטיח קשר בין דיפרנציאלינוירונים ting (תרשים 1C). בנוסף, תוסף הבידול (גזע טכנולוגיות ניידים) מוחלף בתוסף B27 (Invitrogen), 4-5 ימים לאחר זריעה. השיטה הנוכחית מניבה נוירונים 80-90% באופן עקבי. נוירונים אלה עם רשת ענפה של תהליכים יכולים להישמר בתרבות ל2-3 חודשים, יש יתרון ברור על פני המודל העצבי כתוצאה מהתמיינות של שורות תאי נוירובלסטומה אנושיות. Immunostaining במשך כמה סמנים עצביים כוללים NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin וGAP43 נצפו עם NPCs המובחן (איור 3). STAT3 וGFAP, סמנים של האסטרוציטים היו גם זוהו באוכלוסייה קטנה של תאים. על ידי הגדלת הריכוז של חומצה רטינואית ל2-5 מיקרומטר, אוכלוסיית astrocyte ניתן להפחית עוד יותר. עם זאת, לא יכולות להישמר תרבויות כזה למשך תקופה ארוכה, כי תאי גליה לתמוך הישרדות עצבית על ידי הפרשה של גורמי גדילה. יש לנו ציינו כי היארצוי להגביר את הריכוז רטינואית 3-5 ימים לפני ביצוע הניסויים. הטבע הטרוגנית של נוירונים הבדיל מציב אתגרים במונחים של קביעת פרופיל ביטוי גנים של תאים מסוג ספציפי. לכן, יש לנו מותאם לתנאי LCM של נוירונים בתרבית (איור 4). במחקר הנוכחי, אנו מובחנים NPCs בשקופיות עם מוסיף קרום PEN וLCM בוצע בגלל טכניקה זו הוצגה קשיים עם נוירונים בתרבית על מנות תרבית תאים רגילות כפי שהם מחוברים בחוזקה. למרות שהמטרות של LCM יכולות להיות נפגשו על ידי ניתוח immunohistochemical, LCM מציע מספר יתרונות, כולל היכולת להגביר את האות ברמת RNA, לבצע ניתוח זמנית, וכימות מדויק. בשילוב עם microarray, LCM מאפשר ניתוח ביטוי של אלפים גנים בתאים מסוגים שנבחרו 15.

נוירוגנזה חיים ארוכים ידועה להתרחש באזור subventricular של החדרים לרוחב ובשכבת subgranular של gyrus משוננת של המוח של היונקים הבוגרים 1. תאי Neuroprogenitor (NPCs) שמקורם באזורים אלה הם תאי multipotent שיכול להתמיין לתאי עצב, האסטרוציטים וoligodendrocytes 2. NPCs יצרו עניין בשל הפוטנציאל שלהם להיות מושתלים בחולים עם הפרעות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, שבץ ומחלת אלצהיימר (AD) 3. מחקרים עם NPCs יש בדרך כלל מתמקדים בזווית ההשתלה הזה, אבל את הפוטנציאל של תאי עצב שמקורם בNPC כמודל תרבית תאים כדי לקבוע את המנגנון של ניוון מוחיים לא נוצל במלואו. מחקרים קודמים המשמשים בדרך כלל נוירונים לאחר mitotic בודדו מרקמות המוח מכרסם אשר צריכים להיות מבודדים עבור כל ניסוי כפי שהם לאחידוש עצמי. למרות שניתן להרחיב שורות תאי נוירובלסטומה האדם כולל SH-SY5Y ותאי SK-N-MC, אין להם את המאפיינים של נוירונים עיקרי. NPCs אדם, לעומת זאת, מציע גם יתרונות כי הם יכולים להיות מורחבים למעברים מרובים ויכולים להיות מובחן כדי לייצר אוכלוסיית תא עם המאפיינים של נוירונים העיקרי 4,5. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול בידול חדש כדי להשיג אוכלוסיית נוירון עשיר עקבית מNPCs זמין מסחרי מבודד מהמוח העוברי אנושי. מכיוון שתרבויות אלה מכילות אחוז קטן של תאי גליה, אנחנו צריכים שיטות נוספות כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של תאי עצב לאפיון מולקולרי. microdissection ללכוד לייזר (LCM) הוא טכניקה חדשנית שבו אוכלוסייה הומוגנית של תאים מקטע רקמה יכולה להיות שנתפסו באופן סלקטיבי לניתוח ביטוי גנים 6. המוח הוא רקמה הטרוגנית המורכבת של נוירונים, גליה וטאי הסלולרי האחרPES. LCM נעשה שימוש כדי לקבוע ביטוי נוירון הספציפי גן מנתח 7-10. אנחנו ביצענו בעבר LCM של נוירונים בהיפוקמפוס מחלקים לספירה (Tg2576) מוח עכבר כדי להראות ביטוי ירידה של חלבון מחייב אלמנט תגובת AMP המחזורי (CREB) וBDNF במיוחד בנוירונים בהיפוקמפוס 11. במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליכים להרחבת NPCs אדם, בידול עצבי, מכתים immunofluorescent עבור סמנים עצביים ו LCM עבור הבידוד של נוירונים בתרבית בשקופיות קרום PEN.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neuroprogenitor cells (NPCs) </td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2599</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A human basal medium</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5750</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A Proliferation supplement</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5753</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A Differentiation supplement</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5754</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>B-27 Supplement (50x) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human epidermal growth factor</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>2633</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fibroblast growth factor </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor </td>
			<td>Cell signaling </td>
			<td>3897S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nerve Growth Factor </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13257-019</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0627</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5899</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse laminin </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>STAT3 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9132</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GAP43 antibody</td>
			<td>Transduction laboratories</td>
			<td>612262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1534SP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetyl cholinesterase antibody </td>
			<td>Santz cruz</td>
			<td>Sc-11409</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synaptophysin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18008-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NeuN antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synapsin antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB300-104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti mouse FITC</td>
			<td>Jackson Immuno </td>
			<td>115-095-146</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td>Research Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno </td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td>Research Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Acros</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehye </td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip (Big circle cover slip)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting medium (Prolong Gold)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen membrane</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>LCM0521</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Histogene LCM frozen section staining kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0401</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RiboAmp RNA Amplification kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Picopure RNA Isolation kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0202</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CapsureMacro LCM caps</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

laser capture microdissection of neurons from differentiated human neuroprogenitor cells in culture

תאי Neuroprogenitor (NPCs) מבודדים מהמוח העוברי האנושי הורחבו בתנאי שגשוג בנוכחות גורם אפידרמיס צמיחה (EGF) וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) כדי לספק שפע של תאים. NPCs הובדלו בנוכחות שילוב חדש של גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורם במוח (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) וחומצה רטינואית על מנות מצופות פולי-L-ליזין וlaminin עכבר כדי להשיג נוירון עשירה בתרבויות. NPCs גם הובדלו בהעדר neurotrophins, DBC וחומצה רטינואית ובנוכחותו של גורם נוירוטרופי הריסים (CNTF) להניב תרבויות astrocyte עשיר. NPCs המובחן התאפיינו מכתים immunofluorescence לפנל של סמנים עצביים כוללים NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin וGAP43. חלבון fibrillary גליה חומצי (GFAP) וSTAT3, סמני astrocyte, התגלו ב10-15% מNPCs המובחן. כדי להקל עלאפיון מולקולרי תאים מסוג מסוים, microdissection ללכוד לייזר בוצע לבודד את תאי עצב בתרבית על naphthalate פוליאתילן שקופיות קרום (PEN). השיטות שתוארו במחקר זה מספקים כלים רבי ערך כדי לקדם את ההבנה של המנגנון המולקולרי של ניוון מוחיים שלנו.

הרחבת NPCs (איור 1) כאשר neurospheres מפורקים להשעית תא בודדת על ידי טחינה דקה, קצה פיפטה צריך לגעת בתחתית של התחתית, כך שיש התנגדות מסוימת, כאשר השעית pipetted למעלה ולמטה. את מספר הפעמים של טחינה דקה ינוע בין יחידים וצריך להיות מוכרע על ידי ניסוי וטעייה על ידי בחינת ההשעיה תא וכתוצאה מכך מתחת למיקרוסקופ. זה קריטי כדי לספק צפיפות מספקת של השעיה תא בגלל הריבוי יהיה בקצב מהיר יותר כאשר NPCs בא במגע קרוב. אם NPCs לא גדל, צפיפות התאים צריכה להיות מוגברת על ידי צמצום מספר צלוחיות. אנחנו כבר הצלחנו להרחיב neurospheres עד 10-15 קטעים. אספקה ​​כך שפע של NPCs אדם יכולה להיווצר, הפחתת השימוש ברקמה עוברית אנושית. להמשך האספקה ​​NPCs ונוירונים, רצוי להרחיב אותם תחילה ל3-4 קטעים ולאחר מכן, מחצית NPCs ניתן להרחיב כמו neurospheres ואת החצי השני יכול להיות מובחנת לניסויים מתמשכים. לחלופין, NPCs ניתן גם הרחיב לעוד קטעים, קפואים בחנקן נוזלי כמו במקרה של שורות תאים ליצור היצע גדול יותר של מניות, וקם לתחייה בעת הצורך. זה גם רצוי לבצע ניסויים עם נוירונים הנגזרים מקבוצות שונות של NPCs. עצבי דיפרנציאציה של NPCs (איור 2) NPCs הם תאי multipotent ויכול להיות מובחן לנוירונים, האסטרוציטים או oligodendrocytes בהתאם לתנאי התרבות. פרוטוקול הבידול שלנו מעורב זריעה של ישנה neurospheres 4 ימים במנות מצופים (איור 2 א). הבחנו כי זה חיוני לזרע צפיפות מספקת של neurospheres כך שנוירונים ההבחנה פזורים ויוצרים רשת צפופה של תהליכים עצביים. תמונות אחרי 1 (איור 2 ב) ו -4 ימים (איור2C יור) של זריעה מוצג. תרבויות נוירון עשיר מניב נוירונים 80-90% והאסטרוציטים 10-15%, התקבלו לאחר ההתמיינות של NPCs בנוכחות שילוב של NGF, BDNF, DBC וחומצה רטינואית לשבועיים (איור 2 ד). למיטב ידיעתנו, בפרוטוקול שתואר במחקר זה להבחנה עצבית לא דווח בעבר על ידי אחרים. באזורי צפיפות נמוכה, NPCs מובחן להאסטרוציטים (2E איור). כדי להשיג תרבות astrocyte עשיר, יכול להיות מתורבת NPCs בנוכחות CNTF (10 ng / ml) ובהעדרו של NGF, BDNF, DBC וחומצה הרטינואית. לכן הרכב נוירון astrocyte ניתן להשפיע במהלך התמיינות בהתאם למטרת הניסוי. אפיון של בדיל נוירונים (איור 3) כדי להמשיך ולאפיין NPCs המובחן אלה, ביצענו immunostaining הכפול עבור סמנים עצביים wpolyclonal ה-i ונוגדנים חד שבטיים, ואחרי חשיפה לנוגדנים משני ארנב ועכבר קשור לCy3 (אדום) וFITC (ירוק), בהתאמה. הסמנים עצביים הבאים זוהו: איור 3 א:. NeuN וsynapsin איור 3:. כולינסטרז אצטיל (AChE) וsynaptophysin איור 3 ג: BDNF וGAP43. לכן, יש לי NPCs המובחן המאפיינים של נוירונים עיקרי. בנוסף, סמני astrocyte STAT3 וGFAP התגלו באוכלוסייה קטנה של תאים (איור 3 א). לכן שיטות נוספות יש צורך בניתוח ביטוי גני נוירון הספציפי. Microdissection לכידת לייזר (LCM) של נוירונים (איור 4) למרות LCM יכול לשמש לבידוד של תאים ממנת תרבות, הניסיונות הראשוניים שלנו של LCM עם הנוירונים נכשלו משום שהם מחוברים בחוזקה לכלים מצופים. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו מובחנים o NPCsn שקופיות עם מוסיף קרום PEN מצופה פולי-L-ליזין וlaminin עכבר. השקופיות הונחו בתוך צלחת 100 מ&quot;מ תרבית תאים (איור 4 א). ההסדרים של שקופית קרום PEN וכובעי LCM מוצגים באיור 4. תרבויות היו מוכתמות בכתם HistoGen (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים (איור 4C). השקופיות הוצבה במיקרוסקופ במכשיר ארקטורוס ריטאס. נוירונים כדי לנפול בפח היו מסומנים עם כלי ציור (איור 4D). כובעי CapSure HS הונחו על קרום PEN. באמצעות שילוב של חיתוך לייזר UV ולכידת לייזר IR, האזורים המסומנים נאספו על הכובע. נוירונים שנתפסו מוצגים בכובע בנמוך (איור 4F) והגדלה גבוהה (איור 4F). <img alt="איור 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50487/50487fig1.jpg" /> איור 1.הרחבת NPCs האנושי. א NPCs היה בתרבית בתרחיף ב T75 צלוחיות כneurospheres. B. כאשר neurospheres הגיעה לגודל של 300-500 מיקרומטר, הם הועברו ל15 מיליליטר צינורות וcentrifuged ב 1,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות. ג supernatant הושלך ו התא גלולה ב μl 200 בינוני הועבר לצינורות Eppendorf וtriturated. ד neurospheres מוכנה לפצל מוצגות. neurospheres הבורה E. הבא טחינה דקה מוצגות. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50487/50487fig2.jpg" /> איור 2. בידול של NPCs האנושי. א neurospheres נשברה על ידי טחינה דקה ותרבית למשך ארבעה ימים כדי לייצר neurospheres החדשה. Neurospheres בן יומו ב &#39;ארבעה היו זורעים במנות מצופות פולי-L-ליזין וlaminin עכבר. ג דיפרנציאליtion של NPCs נצפה בנוכחות של NGF, BDNF, DBC וחומצה הרטינואית בשלושה ימים לאחר זריעה. תרבות ד Neuron עשירה הושגה לאחר שבועיים. ה NPCs מובחנת להאסטרוציטים באזורי צפיפות נמוכה. פ NPCs מובחן לתרבות astrocyte עשיר בנוכחות CNTF (10 ng / ml) ובהעדרו של NGF, BDNF, DBC וחומצה הרטינואית. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50487/50487fig3.jpg" /> איור 3. עצבי וסמני astrocyte בNPCs האנושי המובחן. NPCs מובחן במשך שבועיים היו קבועים כפול immunostained למטרות שצוינו בpolyclonal ונוגדנים חד שבטיים, ואחרי חשיפה לנוגדנים משני ארנב ועכבר קשור לCy3 (אדום) וFITC (ירוק), בהתאמה. הסמנים עצביים הבאים זוהו: א NeuN וsynapsin.כולינסטרז ב אצטיל (AChE) וsynaptophysin. ג BDNF וGAP43. בנוסף, סמני astrocyte הבאים זוהו: ד STAT3 וGFAP. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50487/50487fig4.jpg" /> איור 4. microdissection ללכוד לייזר של נוירונים. NPCs א הובדל בשקופית קרום PEN המצופה ליזין L פולי וlaminin עכבר. השקופיות הונחו בתוך צלחת תרבית תאי 100 מ&quot;מ. ב ההסדרים של שקופיות PEN קרום וכובע LCM במכשיר ארקטורוס ריטאס מוצגים. תרבויות ג הוכתמו כתם HistoGen (ארקטורוס) כדי להמחיש את התאים. ד נוירונים להישבות סומנו בכלי ציור. נוירונים שנתפסו מוצגים בכובע בנמוך (E) ומגנים גבוהים (F)fication. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50487/50487fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Views.  Denver VA Medical Center.  תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצ...

Video: Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...