Ce travail a été soutenu par l&#39;examen du mérite subvention (NEUD-004-07F) de l&#39;Administration des anciens combattants (SP).

Une. Expansion des PNJ humaines (Figure 1) <ol><li> Renouer avec le stock congelé de PNJ humains de cerveau fœtal (Lonza, Walkersville, MD, USA) et de la culture leur en suspension dans flacons T-75 que neurosphères (figure 1A) en milieu neurobasal contenant des suppléments de prolifération, l&#39;EGF (10 ng / ml) et FGF (10 ng / ml). </li><li> Après 3 jours de culture, les neurosphères transférer à un tube de 15 ml et centrifuger à 500 rpm pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant laissant derrière lui ~ 100 ul de milieu au-dessus du culot de cellules et les transférer dans un tube Eppendorf. Un culot cellulaire 100 pi est assez de se scinder en deux T-75 flacons. Si moins, réduire le nombre de flacons que les cellules neuroprogenitor incapables de proliférer si diviser mince. </li><li> On triture le culot avec un embout de 200 ul 50x tout en maintenant la pointe de 200 pi par rapport au fond du tube. Divisez la suspension cellulaire aussi en deux parties et les ajouter à 2 T-75 flacons (1-2 split), un pour la poursuitel&#39;expansion et l&#39;autre pour la différenciation. </li><li> Continuer la culture des cellules neuroprogenitor d&#39;expansion (premier flacon) en changeant le milieu tous les 4-5 jours jusqu&#39;à ce que les neurosphères atteignent leur taille originale de 300 à 500 um. Changer le milieu par centrifugation (500 rpm, 5 min), jetez le support et ajouter un nouveau milieu. </li></ol> 2. Différenciation des PNJ humain dans une culture Neuron riche (Figure 2) <ol><li> Pour la différenciation des cellules dans un neuroprogenitor riche culture des neurones, placer une lamelle couvre-objet unique dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits et le manteau avec 100 ug / ml de poly-L-lysine en ajoutant 500 ul dans chaque puits. Incuber les boîtes pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer le-poly L-lysine solution et rincez la plaque avec de l&#39;eau stérile. </li><li> Ensuite, recouvrir les puits de la plaque avec 500 pi de 5 ug / ml de laminine de la souris et incuber pendant 30 min. Après incubation, laver les puits avec du PBS. </li><li> 4 jours après splitting les cellules (étape 1.4), transférer les petites neurosphères dans le flacon étiqueté «pour la différenciation» dans les boîtes revêtues à une densité de ~ 500 neurosphères par puits d&#39;une plaque de 24 puits. </li><li> Après 6 heures, lorsque les neurosphères attachent à plat, retirez le support de la prolifération et ajouter du milieu de différenciation consistant en milieu neurobasal, supplément B27, NGF (20 ng / ml), le BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), et l&#39;acide rétinoïque (2 uM). </li></ol> 3. Immunofluorescence de PNJ différenciés (Figure 3) <ol><li> Suite à la culture de cellules dans un milieu de neuroprogenitor différenciation neuronale pendant deux semaines, une culture de neurones riche est obtenu. Rincer les neurones une fois dans du PBS, puis les fixer à 4% de paraformaldéhyde pendant 30 min. Une fois fixé, rincer les cellules trois fois avec du PBS. </li><li> Incuber les cellules avec un tampon de perméabilisation (5% de BSA et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS) à température ambiante pendant 60 min. </li><li> Incuber les boîtes O / N à 4 ° C ina shaker avec la combinaison suivante d&#39;anticorps polyclonaux et monoclonaux dans 3% de BSA dans du PBS: NeuN (1:250) et synapsine (1:250); acétylcholinestérase (1:500) et la synaptophysine (1:250); BDNF (1 : 500) et GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) et GFAP (1:1000). </li><li> Laver trois fois les lamelles couvre-objet avec du PBS, puis de les incuber avec des anticorps anti-lapin-Cy3 et des anticorps secondaires anti-souris-FITC à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 90 min. Après l&#39;incubation, les lamelles laver trois fois avec du PBS. </li><li> Placer 10 ul de milieu de montage sur une lame de verre, prendre la lamelle de la boîte de culture avec une pince, et placez-le à l&#39;envers sur le support de montage. Doucement, essuyer tout support de montage excès et sceller les bords avec du vernis à ongles. </li><li> Examiner les neurones immunocolorées dans un microscope à fluorescence. </li></ol> 4. Microdissection laser de neurones (Figure 4) <ol><li> Différencier les PNJ dans une culture de neurones riches sur PEN lame de membranes recouvertes de poly-L-lysine et de laminine de souris en suivant les procédures décrites pour la figure 2. </li><li> Effectuez toutes les étapes ultérieures dans des conditions RNAse-libres. </li><li> Colorer les cultures en utilisant HistoGene Stain (Arcturus) pour visualiser les cellules. </li><li> Trouver les zones de populations neuronales purs dépourvus des astrocytes en utilisant l&#39;image de feuille de route de la diapositive entière avec le système Veritas LCM. Marquez les neurones en utilisant les outils de dessin. </li><li> Effectuer capture laser de ces zones à l&#39;aide de précision contrôlé par ordinateur et d&#39;automatisation d&#39;un processus en deux étapes. Tout d&#39;abord, IR (infrarouge) est tiré à plusieurs endroits avec un réglage de la puissance du laser de 70 mW et une impulsion de 2500 microsecondes pour obtenir la membrane joindre à la capsule. Ensuite, la zone marquée est excisée à l&#39;aide d&#39;un outil de coupe UV à un réglage bas de niveau de 10 mV. </li><li> Combinaison de ces procédés capture sélectivement les zones marquées de la membrane PEN sur CapSure LCM macro bouchons. Lorsque le capuchon est levé, la membrane avec le neurons adhère à la capsule. </li><li> Isoler l&#39;ARN total à partir d&#39;échantillons LCM en utilisant un kit d&#39;isolement PicoPure ARN (Arcturus) et traiter avec de la DNase. </li><li> Amplifier l&#39;ARN isolé en utilisant le kit d&#39;amplification RiboAMP ARN en suivant les instructions du kit. </li><li> Effectuer l&#39;analyse en temps réel RT-PCR utilisant des sondes TaqMan pour détecter neurofilaments humaine chaîne lourde (hNFHc). </li></ol> Abréviations: AD, la maladie d&#39;Alzheimer; BDNF, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau; CREB, protéine de liaison à l&#39;élément de réponse à l&#39;AMP cyclique; DBC, dibutyryl AMP cyclique, l&#39;EGF, le facteur de croissance épidermique; FGF, facteur de croissance fibroblastique, GFAP, protéine acide fibrillaire gliale, LCM, laser microdissection, NGF, facteur de croissance nerveuse; PNJ, neuroprogenitor cellule; PEN, polyéthylènenaphtalate.

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+as+models+for+high-throughput+screens+of+developmental+neurotoxicity:+state+of+the+science.">Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+supplementation+of+differentiating+human+neural+progenitors+and+embryonic+stem+cells+leads+to+enhanced+neurogenesis+in+vitro.">Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro.</a> J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).</li><li>Bonner, R. 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Res. 69, 578-586 (2002).</li><li>Robles, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+gene+expression+profiling+in+spatial+discrimination+learning.">Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning.</a> Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).</li><li>Su, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ethanol+versus+formalin+fixation+on+preservation+of+histology+and+RNA+in+laser+capture+microdissected+brain+tissues.">Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues.</a> Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+perspectives+of+neural+stem+cell+differentiation:+from+neurotransmitters+to+therapeutics.">Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.</a> Cytometry A. 75, 38-53 (2009).</li><li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells.">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li><li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer.

Nous décrivons dans la présente étude, un modèle de culture cellulaire neurone-riche par différenciation de cellules humaines neuroprogenitor auto-renouvellement et une méthode pour isoler une population pure de neurones par microdissection par capture laser. Nous avons utilisé une combinaison de NGF, BDNF, DBC et l&#39;acide rétinoïque pour la différenciation neuronale des PNJ. DBC est utilisé pour activer CREB, un facteur de transcription qui augmente la neurogénèse 12. L&#39;acide rétinoïque...

Long de la vie neurogénèse est connu pour se produire dans la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et dans la couche sous-granulaire du gyrus denté de l&#39;adulte cerveau des mammifères 1. cellules Neuroprogenitor (PNJ) qui proviennent de ces régions sont des cellules multipotentes qui peuvent se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes 2. PNJ ont suscité un intérêt en raison de leur potentiel à être transplantés chez des patients atteints de divers troubles neurodégénératifs, y compris la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, accidents vasculaires cérébraux et la maladie (AD) 3 d&#39;Alzheimer. Des études avec des PNJ ont généralement porté sur cet angle de la transplantation mais le potentiel de neurones NPC dérivés comme un modèle de culture cellulaire afin de déterminer le mécanisme de neurodégénérescence n&#39;a pas été pleinement exploité. Des études antérieures ont généralement utilisé des neurones post-mitotiques, isolé à partir de tissus de cerveau de rongeur qui doivent être isolés pour chaque expérience comme ils ne sont pasauto-renouvellement. Bien que des lignées de cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y, y compris les cellules et SK-N-MC peuvent être étendus, ils n&#39;ont pas les caractéristiques des neurones primaires. PNJ humains, d&#39;autre part, offrent des avantages car ils peuvent être développées pour de multiples passages et peuvent être différenciées pour générer une population de cellules avec des caractéristiques de neurones primaires 4,5. Dans la présente étude, nous décrivons un nouveau protocole de différenciation pour obtenir une population de neurones riches en uniforme de PNJ disponibles dans le commerce isolées de cerveau fœtal humain. Parce que ces cultures ne contiennent un petit pour cent des cellules gliales, nous avons besoin d&#39;autres méthodes pour isoler une population pure de neurones pour la caractérisation moléculaire. microdissection par capture laser (LCM) est une nouvelle technique par laquelle une population homogène de cellules provenant d&#39;une section de tissu peut être capturé de manière sélective pour l&#39;analyse de l&#39;expression du gène 6. Le cerveau est un tissu hétérogène constitué par les neurones, des cellules gliales et des cellules d&#39;autres types. LCM a été utilisée pour déterminer l&#39;expression génique spécifique des neurones analyses 7-10. Nous avons déjà effectué LCM de neurones de l&#39;hippocampe de AD (Tg2576) des coupes de cerveau de souris pour montrer diminution de l&#39;expression de la protéine de liaison cyclique élément de réponse AMP (CREB) et BDNF spécifiquement dans les neurones hippocampiques 11. Dans la présente étude, nous décrivons les procédures pour l&#39;expansion des PNJ humains, la différenciation neuronale, immunofluorescence pour marqueurs neuronaux et LCM pour l&#39;isolement des neurones cultivés sur des lames de membrane PEN.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neuroprogenitor cells (NPCs) </td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2599</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A human basal medium</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5750</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A Proliferation supplement</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5753</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A Differentiation supplement</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5754</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>B-27 Supplement (50x) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human epidermal growth factor</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>2633</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fibroblast growth factor </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor </td>
			<td>Cell signaling </td>
			<td>3897S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nerve Growth Factor </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13257-019</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0627</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5899</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse laminin </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>STAT3 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9132</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GAP43 antibody</td>
			<td>Transduction laboratories</td>
			<td>612262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1534SP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetyl cholinesterase antibody </td>
			<td>Santz cruz</td>
			<td>Sc-11409</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synaptophysin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18008-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NeuN antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synapsin antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB300-104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti mouse FITC</td>
			<td>Jackson Immuno </td>
			<td>115-095-146</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td>Research Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno </td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td>Research Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Acros</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehye </td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip (Big circle cover slip)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting medium (Prolong Gold)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen membrane</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>LCM0521</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Histogene LCM frozen section staining kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0401</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RiboAmp RNA Amplification kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Picopure RNA Isolation kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0202</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CapsureMacro LCM caps</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

laser capture microdissection of neurons from differentiated human neuroprogenitor cells in culture

cellules Neuroprogenitor (PNJ) isolés du cerveau fœtal humain ont été développés dans des conditions de prolifération en présence de facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) de fournir une offre abondante de cellules. NPC ont été différenciées en présence d&#39;une nouvelle combinaison de facteur de croissance nerveuse (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le dibutyryl cAMP (DBC) et de l&#39;acide rétinoïque sur des boîtes revêtues de poly-L-lysine et de laminine de souris pour obtenir neurone riches cultures. NPC ont également été différenciés en l&#39;absence de neurotrophines, DBC et l&#39;acide rétinoïque et en présence de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) pour produire des cultures d&#39;astrocytes riches. PNJ différenciés ont été caractérisées par immunofluorescence pour un panel de marqueurs neuronaux dont NeuN, synapsine, l&#39;acétylcholinestérase, synaptophysine et GAP43. Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et STAT3, marqueurs d&#39;astrocytes, ont été détectés dans 10-15% des PNJ différenciées. Pour faciliterCaractérisation moléculaire spécifique de type cellulaire, microdissection par capture laser a été réalisée pour isoler des neurones en culture sur le polyéthylène naphtalate (PEN) coulisse de la membrane. Les méthodes décrites dans cette étude constituent des outils précieux pour faire avancer notre compréhension du mécanisme moléculaire de la neurodégénérescence.

Expansion des PNJ (Figure 1) Lorsque neurosphères sont décomposées à une suspension de cellules individuelles par la trituration, l&#39;embout de pipette a besoin de toucher le fond du tube de sorte qu&#39;il existe une certaine résistance lorsque la suspension est introduite à la pipette de haut en bas. Le nombre de fois de trituration varie entre les individus et doit être décidé par essais et erreurs en examinant la suspension cellulaire obtenue sous un microscope. ...

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Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Cellules neuroprogenitor humaines (CNP) ont été élargis dans des conditions de prolifération. NPC ont été différenciées en cultures de neurones riches en présence d&#39;une combinaison de neurotrophines. Marqueurs neuronaux ont été détectés par immunofluorescence. Pour isoler une population pure de neurones, les PNJ ont été différenciés sur des lames de membrane PEN et microdissection laser a été effectuée.

Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K vues.  Denver VA Medical Center.  Cellules neuroprogenitor humaines (CNP) ont été élargis dans des conditions de prolifération. NPC ont été différenciées en cultures de neurones riches en présence d'une combinaison de neurotrophines. Marqueurs neuronaux ont été détectés par immunofluorescence. Pour isoler une population pure de neurones, les PNJ ont été différenciés sur des lames de membrane PEN et microdissection laser a été effectuée.