אנו מודים לג&#39;יליאן סטנפילד להערות על כתב היד. טאג&#39; נתמך על ידי אוניברסיטת יוטה הגנטיקה הדרכה גרנט T32-GM007464 מNIGMS NIH.

1. דור פסיפס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלב גנטי האמבטיה w FRT 19 א: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, כטב&quot;מ-GFP (זכרים) X * FRT 19 א / אל (נשים), שבו * מייצג את המוטציה כדי להיבחן. הערה: הגדרה לעבור לפחות יום אחד לפני הניסוי, כמו זו מאפשרת חיות להזדווג כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חילוני: צלב העברה לבקבוקונים לטוס-מזון עם כתם קטן של רסק שמרים טרי הונח על כלי התקשורת. לאפשר לשכבת במשך שעה 1 ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח: חיות העברה מבקבוקון מראש להניח לבקבוקון טרי עם כתם קטן של רסק שמרים טרי. לאפשר להניח ל6 שעות ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוגרים העברה בחזרה מראש להניח בקבוקון לאחסון ושימוש בניסויים הבאים. הלם באופן מיידי חום הבקבוקון המכיל 0-6 שכב עוברים ישנים HR ל45 דקות ב 38 מעלות צלזיוס, באמבט מים במחזור. הערה: פני השטח של המזון צריך להיות מתחת למפלס המים כדי לאמת את כלעוברים כראוי לחמם בהלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוקונים המומים חום של 25 מעלות צלזיוס במשך 4-5 ימים עד שזחלי instar שלישי להתחיל לנדוד. </li></ol> 2. מסך למען בעלי חיים פסיפס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר בעדינות להרים זחלים שלישי instar-נודדים מן הצדדים של הבקבוקון ולהכניס אותם לתוך גליצרול 100% צוננים בצלחת פלסטיק קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הזחלים באמצעות מיקרוסקופ לנתח הגדלה גבוה מצוידים באופטיקה ניאון. זהה את הזחלים עם ביטוי פסיפס של תאים שכותרתו fluorescently קונים נשימה. בדרך כלל, זה יכול להיעשות ב10-הגדלת 20X. </li></ol> 3. קיבוע חום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר לבחור בקפידה חיות פסיפס מתוך הצלחת ומניחה בירידה של 100% גליצרול טרי בשקופית זכוכית לבנה מ&quot;מ 75x25x1 מיקרוסקופ. הערה: ניתן להציב בעלי חיים רבים בירידה (איור 1 א). יכולים גם להיות ממוקמים בעלי חיים בטיפת גליצרול ישירות על גבי coverslip,אך יש להקפיד במהלך קיבעון (שלב 3.2), כמו החיות תהיה לחמם במהירות רבה והוא יכול להיות מעל קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות זכוכית מקום על 70 מעלות צלזיוס עד לגוש חום החיות רק להפסיק לנוע, לא יותר מ -20 שניות לשקופית, ו -10 שניות ללהחליק את מכסה (איור 1). בעלי חיים להתפתל בהתחלה, אבל לעצור ולהיות נוקשה ומוארך פעם אחת מת. הערה: חשיפה לחום ארוכה מדי תפגע בסניפי מסוף ולומן, כמו גם להפוך את אות ה-GFP עמומה ומפוזרת. ליעילות אופטימלית מומלץ לי הגוש החום באותו החדר כמו מיקרוסקופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר בזהירות לכוון את כל הזחלים בירידה בכיוון אחד, כך שכל הזחלים בשקופית מקבילים בכיוון אחד לשני (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות מכסה זכוכית מייקר 18x18mm על גבי זחלים (או להפוך את coverslip לשקופית זכוכית) ולמנוע בועות יוצרים (1D איור). הערה: ייתכן שלא תשקר coverslip בדיוקדירה על זחלים, זו לא בעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי תמונה בתוך 30 דקות. תאי מסוף קבועים חום יהיו לבזות ואות ה-GFP תהפוך להיות מאוד מפוזרת. </li></ol> 4. בתחום ההדמיה vivo של תאי קני Terminal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית על הבמה של stereomicroscope מתחם. באמצעות מטרה לאתר 5X שני גזעי הגב המקבילים ריצה מקדמית לאחוריים על פני השטח הגבי של בעל החיים (איור 1F). לאתר את שני תאים סופניים גב, באופן ישיר בין שני הגזעים הגבי. זה עוזר לזהות את הקטע המתאים לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת בכיוון, לסובב את החיות לתאים סופניים רצויים תמונה. כדי לעשות זאת, בזהירות לדחוף את coverslip על הקצה עם המלקחיים בניצב לציר הארוך של הזחלים, מגלגלים את הזחלים מתחת coverslip (האיורים 1E ו1G) באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת תאי המסוף המתאים היא קריטית לתוצאות עקביותוהשוואות בין מוטציות. (FB) תאים סופניים סניף השומן בגוף נמצאים בסמוך לגזע הגבי, לרוחב קו האמצע בקלות. התאים סופניים לרוחב קבוצת G (LG) הם מצאו בקלות והם ממוקמים רק לרוחב של קו האמצע הגחון (איור 1H). הערה: ב( TR10) המגזרים הקדמיים ביותר (TR1) ואת אחורי של תא הסדר מסוף הוא מסתעף ממגזרים אחרים. אנו מנתחים רק תאים סופניים במגזרי TR2-Tr9. יש תאים סופניים הגבי דפוס הסתעפות סטריאוטיפי יותר מאשר תאים סופניים קנו נשימה אחרות. זה יכול להיות תלוי באותות נוספים, שאינו תא אוטונומיים, וזה צריך להילקח בחשבון כאשר מחליטים אם לכלול אותם בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתא מסוף עניין זוהה, ללכוד תמונה באמצעות ההגדלה הרצויה, בדרך כלל 10X או 20X הוא הטוב ביותר (איור 2 א). הערה: בשל דפוסי הסתעפות משתנות, מנסה ללכוד תמונות שכוללות כמה שיותר סניפים וטיפים לסניף ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להזיז את הבמה, לכבות את הקרינה ולהדליק את האור מועבר ללכוד תמונת brightfield של אותו התא ומישור מוקד (איור 2). הלום יהיה דמיינו כמו קדרות מנוגדת בתוך חלל תא המסוף. אם מתכנן על סניפים לכמת סלולריים מסוף ולומן, לאסוף מספר רב של תמונות במטוסי מוקד מרובים של כל תא מסוף. </li></ol> 5. ניתוח וכימות של מורפולוגיה של תאי מסוף באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונות הניאון וbrightfield באמצעות ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">(http://rsb.info.nih.gov/ij/)</a> התוספת NeuronJ <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">(http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי &quot;הוסף העתקים&quot;, באופן ידני לאתר את הסניפים ולומן של תא הטרמינל כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באפשרות &quot;תווית ההעתקים&quot;, שינוי שם וRecolor להקצות לכל קו בתוך עקבות ייעוד ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באפשרות &quot;הגדר הפרמטרים&quot;, לשנות את עובי הקו 6-10 512x512 פיקסלים (לתמונות המתקבלות מהמצלמה הדיגיטלית מחוברת למיקרוסקופ המתחם. למצלמות ברזולוציה גבוהות יותר או נמוכות יותר, ברוחב פיקסל צריך להיות מדורגת כראוי), תוך שימוש בכל הגדרות ברירת מחדל אחרות, ולבחור &quot;אישור&quot;. לאחר מכן להשתמש בכלי &quot;הפוך תמונה&quot; לקחת תמונה. בחר &quot;צייר עקבות&quot; כדי לקבל תמונת מצב של העקבות שניתן לראות בצד על ידי צד עם מקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;מדוד ההעתקים&quot; ובחר את סוג המעקב (כלומר שסניפים למדידה המבוססים על הייעודים הספציפיים שהוקצו בשלב 5.3). בשלב הבא, בחר באפשרות &quot;תצוגת מדידות מעקב&quot; ו &quot;מדידות קודמות ברור&quot; ולאחר מכן לחץ על &quot;הפעל&quot;. זה יהיה לייצר גיליון אלקטרוני המכיל את השם, תווית, אורך (בפיקסלים), ונתונים אחרים לתמונה. לאחר מכן ניתן לשמור את הנתונים כגיליון אלקטרוני של Microsoft Excel עבור סטטיסטי נוסףניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

טכניקת קיבוע החום המתוארת כאן היא כלי מהיר ונוח לתאים סופניים קונים נשימת הדמיה תסיסנית זחל. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לבחון את ההסתעפות ודפוס לומן של wild-type תאים. קנו נשימת תאים להביע GFP, מונע על ידי האמרגן הספציפי לקנה הנשימה הנשימה, יכולים להיות בקלות ...

צורת תא היא קריטית לתפקוד של תאים בודדים בתוך האורגניזם, כמו גם תאים שמתפקדים כחלק מאיבר או רקמה. אנו משתמשים בתאים תסיסנית קנו נשימת מסוף, מרכיב של מערכת הנשימה החרקים, כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המשתתפים בשליטה על שני סוגים נשמרים של מורפולוגיה תאית: היווצרות צינור (lumenogenesis) והסתעפות. תאי מסוף נמצאים בקצוות של רשת מסועף של צינורות שפונקציות כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות 1 ויש לי מורפולוגיה קנים משוכללת אשר תלוי במסלול איתות FGF שהוא נשלט על ידי רמות חמצן מקומיות בתוך יעד רקמות 2. ענפים סלולריים מסופים צינורות דקים, עם לום subcellular מלאי גז המתרוצץ בכל סניף. הארכיטקטורות שונות של תאים הסלולריות מסופים, יחד עם קלות שבה ניתן לבצע ניתוח גנטי בדרוזופילה, להפוך את התאים האלה F מודל מצויןאו חקר מנגנונים של תולדה סלולרית, מסתעף, והיווצרות צינור תוך תאית. תאי מסוף הוכיחו מודל שימושי להבנת חלק ממסלולי האיתות המובילה להתמיינות תאים מסועפת, תולדה, והתבגרות 2-4. באמצעות מערכת זו משוחדת, מסכי קדימה גנטיים למוטנטים המורפוגנזה סלולריים כבר בוצעו, מניב תובנות מנגנוני שליטה תא צורה 5,6. לדוגמה, מסכי אלה חשפו כי RabGAP ספציפי נדרש לקוטביות cytoskeletal וסחר בשלפוחית ​​בהיווצרות ומיצוב 7 לום; שהידבקות integrin בתיווך נדרשת ליציבות ענף 8, וכי חלבוני PAR-קוטביות אפיתל לווסת את סחר קרום מקוטב נדרש עבור שניהם לום היווצרות 9 הסתעפות ו. מחקרים אחרים בתאי מסוף הראו כי הצטברות אקטין סימטרית וארגון microtubule נדרש להתארכות תא וlumenogenesis <sעד&gt; 10. לפיכך, מנגנוני תאים שונים, נשמרים ביולוגיים יתרמו להמורפוגנזה תא מסוף. כאן, אנו מתארים שיטה לתקן את הזחלים תסיסנית שלישי instar-שלמים לניתוח של מסוף היווצרות לום תא הסתעפות ובמהירות. פרוטוקול זה גם יכול להתבצע על בעלי החיים instar גם ראשונים והשני. מפתח לטכניקה זו היא היכולת לדמיין תאי מסוף שכותרתו גנטית על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי ישירות דרך ציפורן הזחל של בעלי חיים שלמים. מאז הליך זה אינו דורש שום מניפולציות לאחר קיבוע, כגון צביעת נוגדנים, כדי לבחון את התאים, הוא גם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה, כולל בדיקות גנטיות או בסמים. ביטוי חלבון פלואורסצנטי חושף את המבנה של הסניפים המלאים cytoplasmically. היווצרות צינור יכולה להיות במעקב במקביל באמצעות מיקרוסקופ brightfield לזהות לום גז מלא, העומד בניגוד לסביבת נוזל המילוירקמות ed. בפרוטוקול זה כלל הוא השיטה ליצירת פסיפסים גנטיים המבוססים על מערכת MARCM 11, כדי לייצר תאים סופניים מוטציה הומוזיגוטים שכותרתו עם חלבוני ניאון בבעלי חיים בדרך אחרת ללא תווית. זה הכרחי, שכן תאים סופניים לפרט המבנים המורכבים שלהם רק בשלב מאוחר יחסית בפיתוח; פסיפסים גנטיים מאפשרים מעקף של דרישות הגנים ברקמות אחרות מוקדמת יותר בפיתוח. . כדי ליצור שיבוטים MARCM, קנה נשימה מסומנות באמצעות מנהל ההתקן הספציפי לקנה נשימת הנשימה (BTL) 12 מתוארת כאן הוא הפרוטוקול לכרומוזום X תסיסנית; לכרומוזומים אחרים, ניתן להשתמש בהליך דומה, עם חומרים כימיים גנטיים מתאים לכרומוזום להיות בדק. כאן, קנה נשימה מתויגת על ידי ביטוי של GFP cytoplasmically מקומי, אבל ההליך עובד באותה מידה גם עם ביטוי של חלבוני ניאון אחרים, כגון DsRed. בנוסף, יש לנו כלל שיטה לכמת דפוסי הסתעפות והיווצרות לומן בתאים סופניים, המבוסס על שיטות שפותחו לאפיון דפוסים עצביים 13 סניפים. סוג זה של נתונים כמותיים יכול להיות קריטי בתפקיד ההבחנה המדויק של הגנים בתהליך ההסתעפות או lumenogenesis, כמו גם לאפשר להשוואה ישירה בין מוטציות שונות 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

צורת תא היא קריטית לתפקוד תא. עם זאת, למרות חשיבותה של מורפולוגיה של תאים, מעט מאוד ידוע על אופן בו תאים בודדים ליצור צורות ספציפיות. תאים סופניים קנו נשימה תסיסנית הפכו מודל גנטי רב עוצמה כדי לזהות ולהבהיר את התפקידים של גנים הנדרשים ליצירת מורפולוגיות הסלולר. תאי הדקים הם מרכיב של רשת צינורות מסועפת, המערכת לקנה הנשימה המתפקדת כדי לספק חמצן לרקמות פנימיות. תאי Terminal הם מודל מצוין לחקר שאלות של צורת תא כפי שהם בעלי שתי ארכיטקטורות סלולריות שונות. ראשית, יש תאים סופניים מורפולוגיה קנים משוכללת, בדומה לתאי עצב מורכבים; שני, סניפי מסוף סלולרי נוצרים כדקים צינורות ומכילים תאי לום קרום הנכנס. ניתוח כמותי של מספר מסוף תא סניף, ארגון סניף וסניף צורה פרטנית, ניתן להשתמש בו כדי לספק מידע על תפקידו של mech הגנטי הספציפיanisms בהתהוות של תאים מסועפים. ניתוח של היווצרות צינור בתאים אלה יכולים לחשוף את המנגנונים נשמרים של tubulogenesis משותפים לרשתות צינורי אחרות, כגון כלי דם החוליות. כאן אנו מתארים טכניקות שיכולים לשמש כדי לתקן במהירות, תמונה, ולנתח את שני דפוסי הסתעפות והיווצרות תאי צינור במסוף בתוך זחלי דרוזופילה. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לנתח תאים סופניים בחיות הבר מסוג ומוטציה גנטיים, או פסיפסים. בגלל היעילות הגבוהה של פרוטוקול זה, הוא גם מתאים מאוד לגנטי, RNAi מבוסס, או מסכי סמים במערכת תסיסנית קנה הנשימה.

תוצאות מוצגות באיור 2. קבוצה אחת לרוחב (LG) תא מסוף מציגה הסתעפות subcellular נרחבת (דמיין ידי GFP;) ולום subcellular מלאי גז פועל באמצעות כל אחד מהסניפים (דמיינו ידי מיקרוסקופ brightfield; ב &#39;). תמונות אלו נאספו מזחל L3 פסיפס, שנוצרו באמצעות מערכת MARCM המתוארת בסעיפי 1 ו -2, ונקבע חום...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy at JoVE.com

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מיקרוסקופ אור של תאים סופניים בקנה נשימה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים. שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של ענף ומורפולוגיה לום בבעלי חיים שלמים ויהיה שימושי עבור ניתוח של מוטציות או מסכים למוטציות המשפיעות על התפתחות תאי מסוף בודדות.

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K Views.  University of Utah. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מיקרוסקופ אור של תאים סופניים בקנה נשימה דרוזופילה זחלים. שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של ענף ומורפולוגיה לום בבעלי חיים שלמים ויהיה שימושי עבור ניתוח של מוטציות או מסכים למוטציות המשפיעות על התפתחות תאי מסוף בודדות.

Video: Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...