עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון לאומי לסרטן, מרכז לחקר הסרטן; הסכם המחקר משותף בין NCI וTherapeutics Calidris; האגודה האמריקנית לסרטן מענק IRG 97-152-17 לOT; וכספים פדרליים מ המכון לאומי לסרטן, NIH, תחת HHSN26120080001E החוזה.

1. הכנת lysate התא פרוטוקול זה מיועד לתאים חסיד מבטאים כל חלבון ה-GFP-התמזגו. מספר תא צורך יכול לנוע בין נמוכה כמו 10 6 לרבים כמו 20 x 10 6 תאים, תלוי ברמת ביטוי חלבון. לדוגמה, lysate של HEK תאי overexpressing GFP-STAT3 הוכן על ידי טיפול בתאים שגודלו 10 T75 צלוחיות ליד 70% confluency עם מאגר תמוגה 1 מ&quot;ל. עם זאת, lysate הזה היה צריך להיות מדולל של פי 150 על מנת לספק רמה אופטימלית של הקרינה לניסוי MST. פרוטוקול תמוגה תא תלוי בחום על המאפיינים והלוקליזציה תאית של החלבון נחקר. אם אתם משתמשים בחומרי ניקוי אינו רצוי בגלל חוסר יציבות חלבון, sonication מתואר להלן, יכול להיות הבחירה הטובה ביותר. ניתן להוסיף תוספים שונים למאגר תמוגה כדי למנוע תגובות שינוי חלבון: EDTA מונע זרחון, vanadate נתרן מעכב phosphatases חלבון טירוזין, כךפלואוריד dium הוא מעכב של phosphatases Ser / Thr. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה. לחלבוני cytoplasmic קלים כדי לחלץ-ההרכב הבא עובד היטב: 25 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8.0, ומעכבי פרוטאז קוקטייל מדולל פי 100 (סיגמא אולדריץ P2714, בהיקף של 2 מ&quot;מ AEBSF, 0.3 מיקרומטר Aprotinin, bestatin מיקרומטר 130, 1 mM EDTA, 14 מיקרומטר E-64, leupeptin 1 מיקרומטר). לחלופין, לחלבונים פחות מסיסים, אפשר להשתמש חיץ Ripa מסחרי עם פרוטאז קוקטייל מעכבים וחומרי ניקוי שאינו denaturing. שמור על החיץ על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים לזמן קצר עם PBS קר כקרח באמצעות 10 מ&quot;ל של חיץ לכל בקבוק T75. שמרו את התאים על קרח במשך 5 דקות, או עד שתאים מתחילים ניתוק מהבקבוק. לגרד תאים עם תא מגרד לנתק במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 10 מיליליטר הקרח הקר PBS ולהעביר צינור prechilled 14 מיליליטר סיבוב תחתון צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב400-600 XG ב 4 ° C למשך 5 דקות. שלב את התאים ממספר צלוחיות בשלב זה אניF צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS supernatant וresuspend גלולה ב 200 μl של חיץ תמוגה קר כקרח, העברת השעיה לטרום מקורר 1.5 צינור Eppendorf מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים על קרח כדי למזער את התחממות יתר מקומית. Lyse תאים עם 10 פעימות 3x שניות של sonication ב30% משרעת, באמצעות 2-3 מ&quot;מ טיפ מראש צונן. שמור את הקצה מתחת לפני השטח כדי למזער את הקצף. השמט צעד זה בעת שימוש בחומרי ניקוי המכיל חיץ ולדגור על קרח למשך 30 דקות במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את פתרון lysate להכיל ריכוז מלח פיסיולוגי (100 מ&quot;מ NaCl) במידת צורך באמצעות 5 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף lysates על ידי צנטריפוגה בכ -26,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את דילול lysate האופטימלי (כפי שמתואר בסעיף 3 להלן), והסכום של lysate הדרוש לטיטרציה אחד (בדרך כלל סביב 300 μl של lysate מראש בדילול מלא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot lysate ולאחסן בטמפרטורה מתאימה לחלבון תחת חקירה (-80 מעלות צלזיוס, ברוב המקרים). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. בחירת מאגר MST והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז את אינטראקציות חלבון ליגנד תלויות בתנאי חיץ, חיץ הרכב MST נבחר בהתבסס על המאפיינים של מערכת מסוימת. זה בדרך כלל יתרון לבדיקה לפחות שני מאגרים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מאגרי MST 5x. היו לנו חוויות טובות עם שתי יצירות הבאות: HEPES (250 HEPES מ&quot;מ, pH 7.4, 25 מ&quot;מ MgCl 2; 500 מ&quot;מ NaCl, 0.25% NP-40) וטריס HCl (250 מ&quot;מ טריס HCl, pH 7.4, 750 מ&quot;מ NaCl, 50 מ&quot;מ MgCl 2; 0.05% Tween-20). תוספת של BSA (5% בתערובת המחייבת הסופית) יכולה לסייע במניעת הידבקות של חלבונים לצינורות פלסטיק וזכוכית נימים. יכול גם להיות כלול NaN 3 (0.5 מ&quot;מ) כדי למנוע צמיחה של מיקרואורגניזמים. </li></ol> 3. נחישות של דילול lysate האופטימלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מקור עירור LED עם אורך גל λ = 470 nm על מכשיר MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען נימים עם cell לחלץ דילול 2 ו10x עם חיץ MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הפעולה &quot;מצא את הנימים&quot; בתוכנת בקרה של מכשיר MST. טווח הקרינה האופטימלי בlysate המדולל הוא מ400 עד 1,500 יחידות הקרינה. </li></ol> 4. קביעת טווח הריכוז האופטימלי ליגנד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הריכוז הגבוה ביותר של ליגנד צריך להיות לפחות 20x גבוה מקבוע דיסוציאציה הצפויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הריכוז הנמוך ביותר יגנד צריך להיות נמוך יותר מאשר ריכוז טוחנת של חלבון פלואורסצנטי. </li></ol> עיין בכלי Finder ריכוז טכנולוגיות NanoTemper להערכת טווח הריכוז ליגנד. 5. הכנת lysate התא ודילולי יגנד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מתלה צינור עם מספר דרוש (בדרך כלל 10-16) של 0.5 צינורות צנטריפוגה LoBind מ&quot;ל על קרח. פיפטה μl 25 של חיץ MST לחלק התחתון של צינור אחד. הוסף 25 μl של פתרון מניות יגנד לאמבטיה הראשונההדואר (# 1, הריכוז הגבוה ביותר יגנד) ולבצע דילול כפול סידורי של ליגנד באמצעות שאר צינורות. שמור על המדף עם דגימות יגנד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא הפשרת lysate לאט על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל lysate תא עם חיץ MST כדי לספק את הרמה האופטימלית של חלבון מטרת הניאון בתגובות מחייבות. ריכוז חלבון סופי צריך להיות קרוב הצפוי K D או נמוך יותר. זה צריך להיות מותאם להשגת מספר דרוש של ספירת הקרינה בפתרון הסופי. לקביעת ריכוז ה-GFP-STAT3 בlysate, המכשיר כויל עם עזרה של העמסה. הריכוז הטוחנת של ה-GFP בlysate נקבע באמצעות היחס בין תשואות קוונטי EGFP ההעמסה ו, 0.85 ו 0.61 בהתאמה. 15 </li></ol> 6. Microscale מחקרים מחייבים thermophoresis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מקור עירור LED עם λ = 470 nm על מכשיר MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 צינורות LoBind מ&quot;ל מקום בtUbe מדף מול צינורות עם דגימות דילול סדרת יגנד. להוסיף 15 μl של lysate התא בזהירות לתחתית צינור אחד. נסה לא לגעת קירות צינור כדי למנוע אובדן מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של מדגם יגנד עם הריכוז הגבוה ביותר (מס &#39;1) לצינור המקביל # 1 עם lysate התא. מערבבים היטב ולשנות קצה פיפטה. חזור על פעולה זו עם שאר הצינורות מלבד אחרון, שאמור להכיל לא יגנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של חיץ MST לצינור האחרון ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא כ 2/3 מהנימים ראשונה עם התערובת המחייבת מצינור # 1, להטות אותו כדי להעביר את הפתרון לכיוון המרכז, ומניח על מגש נימי הנימים לעמדת המס &#39;1 (העמדה הקרובה ביותר לפתיחת המגש) . חזור על פעולה זו עם שאר הנימים. קצות הנימים יכולים להיות מחוברים בשעווה לניסויים ארוכים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגש בתוך מכשיר MST ולסגור את הדלת של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע &quot;מצא את הנימים&quot;הפקודה לתת למכשיר למצוא עמדות של הנימים מדויקות ולמדוד את הקרינה של הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבוסס על עוצמת אות הקרינה, להתאים את כוח LED (10-100%) כדי להביא אותו למרווח יחידות 400-1,500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;התחל&quot; כדי לבצע את ניסוי thermophoresis. יותר מפעם אחת כוח IR-לייזר יכול להיות שנבחר לניסוי על מנת למצוא את שיפוע הטמפרטורה האופטימלי למערכת המסוימת. איסוף נתונים 2-3 ריצות לאותה הקבוצה של נימי דם על מנת להבטיח את שחזור של מדידות. זה לוקח 10-12 דקות כדי להפעיל קבוצה אחת של 16 נימים. </li></ol> 7. ניתוח נתונים thermophoresis microscale <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תיקיית הפרויקט. במציג מידע הפעלה הופיע בחר נגבים בעקומות ספציפיות IR לייזר כוח thermophoretic. יש אפשרות לפתוח את כל עקבות thermophoretic נאספו בתנאים שונים, כגון כוח לייזר אינפרא אדום, LED עמ &#39;ower, טמפרטורה, ריכוז, וכו &#39;. בפעם אחת ולאחר מכן בחירת עקומות כלשהן לניתוח על ידי החלפה אותם לסירוגין (לחץ על שמו של הניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון גרף הנקודות ההערכה, בחר thermophoresis או thermophoresis עם T-קפיצה. ודא שקווים כחולים ואדומים ממוקמים בצורה נכונה. כדי להשיג את הנקודות הממוצעות עם סטיות תקן, בחר &quot;שימוש ממוצע&quot; או &quot;להבחין פועל&quot; לריצות נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתוות כושר קבוע דיסוציאציה, בחר &quot;שימוש ממוצע&quot;, ​​להיכנס ולתקן את ערך ריכוז המולקולה המסומן (סימון הריבוע &quot;הריכוז&quot; בתפריט חלון התאמה), ולהתאים את העקומה. ערך K D עם סטיית התקן שלה מופיע בחלון קופץ מידע נפרד. כדי להתוות לנכון להשתמש בשיטת היל, בחר &quot;ממוצע&quot;, ​​שיטת היל, ולאחר מכן להתאים את העקומה. ערך EC 50 הזיקה עם סטיית התקן שלה מוצג במקרה זה. התכונה של &quot;גבול&quot; K D או היל גם יכולה להיות מנוצל כאשר הרוויהבמצב הנכנס הוא לא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את נתוני הכושר הממוצעים בקובץ טקסט ולהעביר ל-Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נורמת עלילת F (הקרינה מנורמלת), ΔF נורמה (הבדל בקרינה מנורמלת אם ניסויים שונים בהשוואה), או כל חלק קשור (ראה בנוסחה הבאה) כפונקציה של הריכוז ללא תווית המולקולה (טיטרציה). </li></ol> שבריר Bound (חלק של מולקולות מורכבות ב) = (Therm (C), לא מאוגד) / (מאוגד-מאוגד), שבו Therm (ג) הוא thermophoresis נמדד C הריכוז, לא מאוגד הוא thermophoresis למדינה לא מאוגדת (כאשר מולקולות לא במתחם), וכרוך הוא thermophoresis למדינה מחויבת לחלוטין.

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. התוכן של פרסום זה לא בהכרח משקף את הדעות או מדיניות של מחלקת בריאות ושירותי אנוש, ואין אזכור של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מצביע על תמיכה על ידי ממשלת ארה&quot;ב.

ביטוי חלבון וטיהור הוא צעד מייגע ויקר, שהוא, לעומת זאת, יש צורך להגדרה של &quot;אינטראקציות K D על ידי שיטה הנפוצה ביותר כיום. יישום של MST מאפשר הימנעות טיהור חלבון ובכך לפשט באופן משמעותי ומאיץ אפיון כמותי של אינטראקציות. הוא מציג יתרונות משמעותיים במיוחד במקרה של ל...

אפיון כמותי של זיקה של אינטראקציות מולקולאריים חשוב בתחומים רבים של המחקר ביו. מחייבים ניתוק קבוע (K ד &#39;) הוא חיוני לא רק בגילוי סמים, אבל הוא גם פרמטר חשוב באפיון של כל אינטראקציה בינארי בכל מערכת ביולוגית. שיטות המשמשות לזיהוי ביוכימיים של אינטראקציות בין חלבונים, כגון immunoprecipitation ושמרי מסכי שני היברידיים, לא להודיע ​​לנו על כמה חזק הן אינטראקציות אלה, תוך זיקה מגדירה אם מורכב מסוים זה קיים בתנאים שניתנו in vivo. בתהליך גילוי תרופות, פיתוח assay מחייב הוא אחד ולעתים קרובות יש צורך בצעדים שדורשים זמן רב ביותר. שיטות נפוצות ביותר של נחישות D K כוללות קיטוב הקרינה, טכנולוגית 1 plasmon פני תהודה (SPR), 2 radioligand מחייב, 3 קלורימטריה טיטרציה איזוטרמי, 4 equilibriאום הדיאליזה (ED), 5 ultrafiltration (UF), 5 וultracentrifugation (UC). 6 כל אחד מהם דורשים כמויות משמעותיות של חלבון המטרה מטוהר. thermophoresis microscale (MST) הוא שיטה המתפתחת במהירות שמזהה תנועה בבימויו של מולקולות בשיפוע טמפרטורה מיקרוסקופית. כל שינוי של מעטפת הלחות של ביומולקולות תוצאה בשינוי יחסי של תנועה לאורך שיפוע הטמפרטורה. 7 MST משמש כדי לקבוע זיקות מחייבות ויושם ללימוד יגנד מחייב לחלבוני שכותרתו fluorescently או ligands ניאון לחלבון המטרה. 8, 9 MST מאפשר מדידה של אינטראקציות ישירות בפתרון ללא צורך בקיבוע למשטח (טכנולוגיה ללא קיבוע). למעשה, כל מחייב מלווה בשינוי בMST אות, אם כי גודלו של השינוי שונה ממערכת למערכת באופן משמעותי. לצורך זיהוי של תנועת מולקולה על ידי MST, הם צריכים להיות לזרוחNT. מגבלה העיקרית של השיטה זו ניתן להפוך ליתרון. אם חלבון מתבטא כהיתוך GFP בכל מערכת, זה יהיה רק ​​מולקולת ניאון ובכך ניתן ללמוד ללא בידוד ממערכת ביטוי חופשי תא lysate התא או. הדור של lysates התא המאפשרים תנאים מחייבים עם ממצאים מינימאליים הוא האתגר הגדול. כאן אנו מתארים פרוטוקול של הכנת תא lysate וניסוי MST שיכול לשמש להרבה חלבונים מסיסים וקרום. חלבוני STAT טמונים גורמי שעתוק cytoplasmic מופעלים על ידי זירחון טירוזין בתגובה לאותות תאיים, והם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל חסינות, hematopoiesis, דלקת, ופיתוח. -10 ביונקים, משפחת STAT מורכבת מ1 STAT, 2, 3, 4 , 5A, 5B, ו -6. כל הנתונים הסטטיסטיים המופעלים ידועים להיקשר לאותו רצף ה-DNA, שנקרא כך מוטיב גז, IFN-גמא הופעל רצף. עם זאת, transcriהשפעות ptional של נתונים סטטיסטיים שונות הן שונים מאוד. 11 למרות המעורבות בתהליכים פתולוגיים רבים ומחקרים מקיפים מניב מעל 17,000 פרסומים, D K של אינטראקציות STAT עם רצפי DNA שונים לא נקבע. רק זיקה היחסית של נתונים סטטיסטיים שונים לגרסות שונות של מוטיב גז התאפיינה. 11 קשיים בביטוי חלבון וטיהור הם המכשולים העיקריים באפיון של ה-DNA המחייב סלקטיביות &#39;הסטטיסטיקה. על אף שרוב המחקרים התמקדו בתפקידו של סטטיסטיקה &quot;מופעלת&quot;, שהפך לשם נרדף לגורם שעתוק Tyr-phosphorylated, התפקיד של נתונים סטטיסטיים שאינו phosphorylated (U-stats) ברגולציה של שעתוק מתגלה במהירות. 12 עם זאת, מנגנונים אלה הם הבינו היטב, ולא היה ברורים אם U-STATS ממש להיקשר לדנ&quot;א או לפעול באמצעות אינטראקציות עם גורמי שעתוק אחרים. הראנו לאחרונה כי U-STAT3 יכול להיקשר ל-DNA sequenיש CES שונה ממוטיבי גז עם זיקה גבוהה אף יותר. 13 הממצא השלכות משמעותיות על ההבנה של התפקודים הביולוגיים של חלבון חשוב זה שלנו. יש לנו ליישם thermophoresis microscale לקבוע זיקות יחסיות של STAT3 לגז ו-AT עשיר oligonucleotide S 100 (איור 4). פרוטוקול כמעט זהה שימש במשך נחישות D K עבור קשירה של ליגנד STAT3 שונה, מעכב lipopeptide. 14 לא מחייב לגורם שעתוק קשור, ה-GFP-STAT1 ששימש כביקורת שלילית ניתן היה לזהות וכך אישר את הסלקטיביות של אינטראקציה. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

אפיון כמותי של אינטראקציות חלבון חיוני כמעט בכל תחום של מדעי חיים, ובמיוחד גילוי סמים. רוב השיטות הקיימים כיום של נחישות D K דורשים גישה למטוהרי חלבון של עניין, דור אשר יכול להיות זמן רב ויקר. פיתחנו פרוטוקול המאפשר לקביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis microscale (MST) ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. השיטה כרוכה בביטוי יתר של החלבון ה-GFP, התמזגו ותמוגה תא שבאינו denaturing תנאים. יישום השיטה לSTAT3-GFP transiently מתבטא בתאי HEK293 אפשרו לקבוע בפעם הראשונה את הזיקה של גורם השעתוק למד היטב לoligonucleotides עם רצפים שונים. הפרוטוקול הוא פשוט, ויכול להיות מגוון רחב של יישומים לחקר אינטראקציות של חלבונים עם מולקולות קטנות, פפטידים, DNA, RNA, ו-proteins.

מדידת הזיקה של חלבון STAT3 הלא phosphorylated מחייב oligonucleotides. HEK293 תאים לבטא STAT3-GFP שמשו כמקור STAT3 כותרתו fluorescently לassay מחייב ה-DNA. lysates התא הוכן באמצעות Ripa חיץ (20x10 6 תאים / מ&quot;ל). ללימודים מחייבים, את lysates דוללו 150X עם חיץ ה-DNA מחייב MST ?...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K Views.  National Cancer Institute. thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

Video: Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...