وأيد هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، مركز لأبحاث السرطان؛ اتفاقية الأبحاث التعاونية بين لجنة التحقيق الوطنية وCalidris التداوي؛ جمعية السرطان الأمريكية منحة IRG 97-152-17 إلى OT؛ والأموال الاتحادية من المعهد الوطني للسرطان، المعاهد الوطنية للصحة، تحت HHSN26120080001E العقد.

1. إعداد الخلايا المحللة ويهدف هذا البروتوكول لخلايا ملتصقة تعرب عن أي بروتين GFP تنصهر. مطلوب عدد الخلايا يمكن أن تختلف من منخفضة تصل إلى 10 6 إلى ما يصل إلى 20 × 10 6 خلايا، اعتمادا على مستوى التعبير البروتين. على سبيل المثال، تم إعداد المحللة من كلوة الجنين البشري خلايا overexpressing GFP-STAT3 عن طريق علاج الخلايا المزروعة في 10 T75 القوارير إلى قرب 70٪ confluency مع 1 مل العازلة تحلل. ومع ذلك، كان هذا المحللة إلى أن تضعف 150 أضعاف لتوفير المستوى الأمثل من مضان لتجربة MST. بروتوكول تحلل الخلية يعتمد بقوة على خصائص وتوطين الخلايا من البروتين قيد التحقيق. في حالة استخدام منظفات غير مرغوب فيه بسبب عدم الاستقرار البروتين، وصفت صوتنة أدناه، يمكن أن يكون أفضل خيار. إضافات مختلفة يمكن أن تضاف إلى تحلل العازلة لمنع ردود الفعل التعديل البروتين: EDTA يمنع الفسفرة، فانادات الصوديوم يمنع البروتين phosphatases التيروزين، لذلكفلوريد المتوسط ​​أبعد هو المانع من السير / الثريونين phosphatases. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحلل. للاستخراج البروتينات سهلة حشوية على التشكيل التالي يعمل بشكل جيد: 25 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، والبروتيني كوكتيل المانع المخفف 100 أضعاف (سيغما الدريخ P2714، تتكون من 2 ملي AEBSF، 0.3 ميكرومتر أبروتينين، 130 bestatin ميكرومتر، 1 ملم EDTA، 14 ميكرومتر E-64، 1 leupeptin ميكرومتر). بدلا من ذلك، للبروتينات أقل القابلة للذوبان، يمكن للمرء استخدام العازلة RIPA التجارية مع مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل والمنظفات غير تغيير طبيعة. إبقاء العازلة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا لفترة وجيزة مع PBS الجليد الباردة باستخدام 10 مل من العازلة في قارورة T75. تبقي الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق، أو حتى تبدأ الخلايا فصل من القارورة. تتخلص الخلايا مع مكشطة الخلية لفصل إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 10 مل الجليد الباردة PBS ونقل إلى prechilled 14 مل جولة أسفل أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في XG 400-600 في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الجمع بين الخلايا من عدة قوارير في هذه النقطة أناحاجة F. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وطاف بيليه resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة تحلل الجليد الباردة، ونقل التعليق إلى ما قبل برود 1.5 مل أنبوب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبقي الخلايا على الجليد للحد من ارتفاع درجة الحرارة المحلية. ليز الخلايا مع 3X 10 ثانية نبضات من صوتنة في السعة 30٪، وذلك باستخدام 2-3 ملم غيض قبل المبردة. الحفاظ على معلومات سرية تحت سطح الأرض لتقليل مزبد. حذفت هذه الخطوة عند استخدام المنظفات التي تحتوي على العازلة واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصحيح الحل المحللة لاحتواء تركيز الملح الفسيولوجية (100 ملي مول كلوريد الصوديوم) إذا لزم الأمر استخدام 5 M كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع لست] بواسطة الطرد المركزي في حوالي 26،000 XG في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تخفيف المحللة الأمثل (كما هو موضح في القسم 3 أدناه) وكمية من المحللة اللازمة للمعايرة واحدة (عادة حوالي 300 ميكرولتر من المحللة ما قبل المخففة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة المحللة وتخزينها في درجة حرارة مناسبة للبروتين تحت التحقيق (-80 ° C، في معظم الحالات). </li> &lt;/ OL&gt; 2. MST اختيار العازلة وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ تفاعلات البروتين يجند تعتمد على الظروف العازلة، يتم اختيار MST تكوين العازلة على أساس خصائص نظام معين. ومن المسلم به عموما من المفيد لاختبار اثنين على الاقل من مخازن مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 5X مخازن MST. كان لدينا تجارب جيدة مع هذه التراكيب اثنين: HEPES (250 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 و 25 ملي MgCl 2؛ 500 مم كلوريد الصوديوم؛ 0.25٪ NP-40) وتريس حمض الهيدروكلوريك (250 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4؛ 750 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl 2؛ 0.05٪ توين-20). بالإضافة إلى ذلك من BSA (5٪ في خليط نهائي ملزم) يمكن أن تساعد في منع التصاق البروتينات لأنابيب البلاستيك والزجاج الشعيرات الدموية. نان 3 (0.5 ملم) ويمكن أيضا أن يدرج لمنع نمو الكائنات الدقيقة. </li></ol> 3. تحديد الأمثل التخفيف المحللة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مصدر الإثارة LED مع الطول الموجي λ = 470 نانومتر على صك MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الشعيرات الدموية مع CEليرة لبنانية استخراج المخفف 2 و 10x مع MST العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء &quot;البحث الشعيرات الدموية&quot; العملية على برنامج حاسوبي لمراقبة وثيقة MST. مضان المدى الأمثل في المحللة المخفف هو من 400 إلى 1،500 وحدة مضان. </li></ol> 4. تحديد الأمثل يجند مدى تركيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعلى تركيز من يجند ينبغي أن يكون 20x وعلى الأقل أعلى من ثابت التفكك المتوقعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يكون أقل تركيز يجند أقل من تركيز المولي للبروتين فلوري. </li></ol> الرجوع إلى التكنولوجيات أداة الباحث عن تركيز NanoTemper لنطاق تركيز يجند تقدير. 5. إعداد الخلايا المحللة والتخفيفات يجند <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رف أنبوب مع العدد المطلوب (عادة 10-16) من 0.5 مل أنابيب الطرد المركزي LoBind على الجليد. ماصة 25 ميكرولتر من العازلة MST إلى الجزء السفلي من كل أنبوب. إضافة 25 ميكرولتر من محلول المخزون يجند إلى الحوض الأوله (# 1، يجند أعلى تركيز) وتنفيذ المسلسل التخفيف شقين ليجند باستخدام بقية الأنابيب. الحفاظ على الرف مع عينات يجند على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلية ذوبان الجليد المحللة ببطء على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا المحللة مع MST عازلة لتوفير المستوى الأمثل من البروتين الهدف الفلورسنت في ردود الفعل ملزم. وينبغي أن يكون تركيز البروتين النهائي على مقربة من المتوقع K D أو أقل. ينبغي تعديل ذلك للحصول على العدد اللازم من التهم مضان في الحل النهائي. لتحديد GFP-STAT3 التركيز في المحللة، ومعايرة أجهزة القياس مع مساعدة من فلوريسئين. تم تحديد تركيز المولي من GFP في المحللة باستخدام نسبة من فلوريسئين وEGFP الغلة الكم، 0.85 و 0.61 على التوالي. 15 </li></ol> 6. Thermophoresis الدراسات التجليد الميكروسكيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مصدر الإثارة LED مع λ = 470 نانومتر على صك MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 0.5 مل أنابيب LoBind في تييوب رف على الجانب الآخر من الأنابيب مع يجند مسلسل عينات التخفيف. بعناية إضافة 15 ميكرولتر من المحللة الخلية إلى أسفل كل أنبوب. حاول أن لا تلمس الجدران أنبوب لتجنب فقدان العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من العينة يجند مع أعلى تركيز (رقم 1) إلى أنبوب المقابلة # 1 مع المحللة الخلية. تخلط جيدا وتغيير تلميح ماصة. كرر هذه الخطوة مع بقية الأنابيب باستثناء آخر واحد، والتي ينبغي أن لا تحتوي على يجند. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من العازلة MST إلى أنبوب آخر وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ما يقرب من 2/3 من أول الشعرية مع الخليط ملزم من أنبوب # 1، والميل الى التحرك نحو الحل الوسط، ووضع شعري على علبة الشعرية إلى الموضع رقم 1 (أقرب موقف لافتتاح صينية) . كرر هذه الخطوة مع بقية الشعيرات الدموية. إنتهاء الشعرية يمكن توصيله مع الشمع للتجارب أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صينية داخل الصك MST وإغلاق الباب الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء &quot;البحث الشعيرات الدموية&quot;الأمر للسماح للأداة العثور على وظائف بالضبط من الشعيرات الدموية وقياس مضان من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنادا إلى شدة إشارة مضان، ضبط قوة الصمام (10-100٪) لجعله 400-1،500 وحدات الفاصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق زر &quot;ابدأ&quot; لتنفيذ التجربة thermophoresis. ويمكن اختيار أكثر من واحد قوة الأشعة تحت الحمراء ليزر للتجربة في أجل العثور على التدرج في درجة الحرارة المثلى لنظام معين. جمع البيانات 2-3 أشواط لنفس مجموعة من الشعيرات الدموية لضمان استنساخ القياسات. فإنه يأخذ 10-12 دقيقة لتشغيل مجموعة واحدة من 16 الشعيرات الدموية. </li></ol> 7. الميكروسكيل تحليل البيانات Thermophoresis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برنامج التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مجلد المشروع. في معلومات ظهرت عارض تشغيل حدد جمعها في معين يزر الأشعة تحت الحمراء منحنيات thermophoretic السلطة. هناك خيار لفتح كل آثار thermophoretic جمعها في ظل ظروف مختلفة مثل الطاقة يزر الأشعة تحت الحمراء، الصمام POWER، ودرجة الحرارة، والتركيز، وغيرها. في وقت واحد ومن ثم اختيار أي منحنيات للتحليل عن طريق التحول لهم وإيقاف (انقر على اسم التجربة ل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تقييم نقاط نافذة الرسم البياني، حدد thermophoresis أو thermophoresis مع T-القفزة. ضمان أن يتم وضع خطوط زرقاء وحمراء بشكل صحيح. للحصول على النقاط بلغ متوسط ​​مع الانحرافات المعيارية، حدد &quot;استخدام متوسط&quot; أو &quot;تميز يدير&quot; لأشواط منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرسم نوبة التفكك المستمر، حدد &quot;استخدام متوسط&quot;، أدخل وإصلاح جزيء قيمة تركيز المسمى (التحقق من &quot;تركيز&quot; مربع في القائمة إطار مناسبا)، وتناسب المنحنى. تظهر القيمة D K مع انحرافها المعياري في المعلومات نافذة منبثقة منفصلة. لرسم نوبة باستخدام طريقة هيل، حدد &quot;متوسط&quot;، طريقة هيل، ومن ثم تتناسب مع منحنى. يظهر EC 50 قيمة تقارب مع انحرافها المعياري في هذه الحالة. ويمكن أيضا ميزة من K D أو هيل &quot;الحدود&quot; أن تستخدم عندما تشبعفي حالة محددة لم يتم التوصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ البيانات متوسط ​​مناسبا في ملف نصي ونقل إلى Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مؤامرة القاعدة F (مضان تطبيع)، ΔF القاعدة (الاختلاف في مضان تطبيع إذا تم مقارنة تجارب مختلفة)، أو جزء ملزمة (انظر الصيغة أدناه) بوصفها وظيفة من توضيحها (معاير) تركيز جزيء. </li></ol> جزء منضم (جزء من الجزيئات في مجمع) = (ثيرم (C)، غير منضم) / (محكومة غير منضم)، حيث ثيرم (C) هو thermophoresis قياس لتركيز C، غير منضم هو thermophoresis للدولة غير منضم (عندما الجزيئات ليس في مجمع)، والالتزام هو thermophoresis للدولة ملزمة تماما.

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. محتوى هذا المنشور لا تعكس بالضرورة وجهات نظر أو سياسات وزارة الصحة والخدمات البشرية، ولا ذكر الأسماء التجارية، المنتجات التجارية، أو المنظمات لا تعني مصادقة من قبل الحكومة الأمريكية.

تعبير البروتين وتنقية هو خطوة شاقة ومكلفة، والتي، مع ذلك، من الضروري لتحديد التفاعلات &#39;K D بواسطة الأسلوب الأكثر المستخدمة حاليا. تطبيق يسمح MST تجنب تنقية البروتين وبالتالي تبسيط بشكل كبير وتسريع توصيف الكمي من التفاعلات. أنه يقدم مزايا كبيرة خاصة في حالة يصع?...

توصيف الكمي للتقارب من التفاعلات بين الجزيئات مهم في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية. ملزمة التفكك المستمر (K D) أمر ضروري ليس فقط في اكتشاف المخدرات وإنما هو أيضا معلمة هامة في توصيف أي تفاعل ثنائي في أي نظام بيولوجي. أساليب الكيمياء الحيوية المستخدمة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات، مثل مناعي والخميرة شاشات هجين اثنين، لم يكن لاعلامنا على كيفية ضيق هي تلك التفاعلات، في حين يحدد ما إذا كان هذا التقارب مجمع خاص موجود تحت ظروف معينة في الجسم الحي. في عملية اكتشاف المخدرات، والتنمية مقايسة ملزمة هي واحدة من اللازم وغالبا من أشد الخطوات تستغرق وقتا طويلا. الأساليب الأكثر استخداما من K D عزم تشمل الاستقطاب مضان، 1 سطح مأكل صدى (SPR) والتكنولوجيا، 2 اللاجن ملزم، 3 متساوي الكالوري المعايرة، 4 equilibriأم غسيل الكلى (ED)، 5 الترشيح الفائق (UF) و 5 و تنبيذ فائق (UC). 6 فجميعها تتطلب كميات كبيرة من البروتين النقي الهدف. thermophoresis الميكروسكيل (MST) هي طريقة سريعة النمو الذي يكشف حركة موجهة من الجزيئات في التدرج في درجة الحرارة المجهرية. أي تغييرات من قذيفة الماء من الجزيئات الحيوية نتيجة في التغير النسبي للحركة على طول التدرج في درجة الحرارة. يستخدم 7 MST لتحديد الانتماءات الملزمة وأنها طبقت لدراسة يجند ملزم للبروتينات fluorescently المسمى أو بروابط الفلورسنت لبروتين الهدف. 8، 9 MST يسمح قياس التفاعلات مباشرة في حل من دون الحاجة إلى تجميد على سطح (خالية من الشلل التكنولوجيا). عمليا، ويرافق أي ملزم عن تغيير في إشارة MST، على الرغم من أن حجم التغيير يختلف من نظام إلى نظام بشكل كبير. للكشف عن حركة جزيء بواسطة MST، فإنها يجب أن تكون يتألقNT. ويمكن تشغيل هذا القيد الرئيسي للطريقة إلى ميزة. إذا يتم التعبير عن بروتين كما التحام GFP في أي نظام، وسوف يكون جزيء نيون فقط، وبالتالي يمكن دراستها دون بمعزل عن المحللة الخلية أو نظام خالية من الخلايا التعبير. توليد لست] الخلية التي تسمح للظروف ملزمة مع الحد الأدنى من القطع الأثرية هو التحدي الرئيسي. نحن هنا وصف بروتوكول من إعداد المحللة الخلية والتجربة MST التي يمكن استخدامها للعديد من البروتينات القابلة للذوبان والغشاء. هي كامنة البروتينات STAT عوامل النسخ حشوية تفعيلها من خلال الفسفرة التيروزين في استجابة لإشارات خارج الخلية وتشارك في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك الحصانة، تكون الدم، والالتهابات، والتنمية 10 في الثدييات، وتتكون الأسرة من STAT STAT 1، 2، 3، 4 ، 5A، 5B، و 6. ومن المعروف أن جميع الإحصائيات تفعيلها لربط تسلسل الحمض النووي نفسه، ما يسمى عزر GAS، الإنترفيرون جاما تنشيط تسلسل. ومع ذلك، فإن transcriآثار ptional من الإحصائيات المختلفة هي مختلفة جدا. 11 وعلى الرغم من تورط في العديد من العمليات المرضية ودراسات مستفيضة مما أسفر عن أكثر من 17،000 المنشورات، لم يتم تحديد K D من التفاعلات STAT مع تسلسل الحمض النووي مختلفة. وقد اتسمت فقط تقارب النسبي للإحصائيات مختلفة لأنواع من عزر الغاز. صعوبات في التعبير 11 البروتين وتنقية هي العوائق الرئيسية في توصيف الحمض النووي الانتقائية الإحصائيات &#39;ملزمة. على الرغم من أن الغالبية العظمى من الدراسات ركزت على دور الإحصائيات &quot;المنشط&quot;، الذي أصبح مرادفا للعامل النسخ صور-فسفرته، ودور الإحصائيات غير فسفرته (U-الإحصائيات) في تنظيم النسخ تبرز بسرعة 12 ومع ذلك، هذه الآليات غير مفهومة جيدا، ولكن لم يتضح ما إذا كانت U-الإحصائيات ربط الواقع على الحمض النووي أو التصرف من خلال التفاعلات مع عوامل النسخ الأخرى. لقد أظهرنا مؤخرا أن U-STAT3 يمكن ربط الحمض النووي sequenCES مختلفة من الزخارف الغاز مع أعلى حتى تقارب 13 هذه النتيجة لها انعكاسات كبيرة على فهمنا للالوظائف البيولوجية من هذا البروتين مهم. لقد طبقنا thermophoresis الميكروسكيل لتحديد الانتماءات النسبية للSTAT3 إلى الغاز وAT-S الغنية قليل النوكليوتيد +100 (الشكل 4). وقد استخدم بروتوكول متطابقة تقريبا لK D تقرير للربط ليجند STAT3 مختلفة، مثبط lipopeptide 14 لا ملزم للعامل النسخ ذات الصلة، GFP-STAT1 الذي تم استخدامه كعنصر تحكم سلبي يمكن أن يتم الكشف عن مما يؤكد الانتقائية من التفاعل. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

توصيف الكمي للتفاعلات البروتين ضروري عمليا في أي مجال من مجالات علوم الحياة، وخاصة اكتشاف المخدرات. معظم الطرق المتاحة حاليا من K D تقرير تتطلب الوصول إلى تنقية البروتين من الفائدة، الجيل الذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ومكلفة. لقد قمنا بتطوير البروتوكول الذي يسمح لتحديد تقارب ملزمة من قبل thermophoresis الميكروسكيل (MST) من دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. ينطوي على طريقة overexpression من البروتين GFP تنصهر وتحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف. تطبيق طريقة لSTAT3-GFP أعرب عابر في HEK293 الخلايا يسمح لتحديد لأول مرة تقارب من عامل النسخ مدروسة لأليغنوكليوتيد] مع سلاسل مختلفة. بروتوكول واضح وصريح ويمكن أن يكون لها مجموعة متنوعة من التطبيقات لدراسة التفاعلات بين البروتينات مع جزيئات صغيرة، الببتيدات، DNA، RNA، وProteins.

قياس تقارب من البروتين STAT3 غير فسفرته ملزمة لأليغنوكليوتيد]. واستخدمت HEK293 الخلايا معربا عن GFP STAT3-كمصدر للfluorescently المسمى STAT3 لفحص الحمض النووي ملزم. أعدت لست] الخلية باستخدام RIPA العازلة (20X10 6 خلية / مل). للدراسات ملزم، و?...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

thermophoresis الميكروسكيل (MST) يمكن استخدامها على نطاق واسع لتحديد تقارب ملزمة دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. البروتوكول ينطوي overexpression من البروتين GFP تنصهر، تحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف، والكشف عن إشارة MST في وجود تركيزات من يجند متفاوتة.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K Views.  National Cancer Institute. thermophoresis الميكروسكيل (MST) يمكن استخدامها على نطاق واسع لتحديد تقارب ملزمة دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. البروتوكول ينطوي overexpression من البروتين GFP تنصهر، تحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف، والكشف عن إشارة MST في وجود تركيزات من يجند متفاوتة.

Video: Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...