המחברים מודים רונלד פ רנזי ומייקל ס Bartsch על תרומתם לעיצוב והפיתוח של מכשירי DMF ורכזת DMF. מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי מעבדת מחקר בימוי ותכנית פיתוח במעבדות הלאומית Sandia. Sandia היא מעבדה תכנית רבת מנוהלת ומופעלת על ידי חברת Sandia, חברה בת בבעלות מלאה של החברה לוקהיד מרטין, למחלקה הלאומי לביטחון הגרעיני של מנהל האנרגיה האמריקנית תחת חוזה DE-AC04-94AL85000.

פרוטוקול כללי זו נועד לתמוך ביישום של הפלטפורמה למגוון רחב של מחקרים; היבטים ספציפיים למחקר הנציג תואר בדו&quot;ח זה מופרדים בסוגר איור 2 ממחיש מחקר נציג מתבצע באמצעות הפרוטוקול.. יצוין, כי בפרוטוקול, כל פקודות &quot;להורות&quot; הן אוטומטיות באמצעות שימוש בסקריפטים שנקבעו מראש. שימו לב גם שניתן לבצע את שלב 2 במקביל עם שלב 1 (לדוגמה, במהלך שלבי 1.7 ו -1.8), ובשלב זה הוא לעתים קרובות עקף 2.1 (כי ניתן לכבס צלחות מכשיר DMF דוגמת / מצופים ושימוש חוזר; ראה שלב 5.2) . 1. להרכיב ולאכלס את צ&#39;יימברס הזילוף הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל המשטחים הפנימיים של עיקור microcapillaries (autoclaved) (סיליקה התמזגו-; 679 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 534; אורך 15 ס&quot;מ) עם פיברונקטין, על ידי מורה משאבת המזרק לצייר פתרון פיברונקטין סטרילי (30 μl של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לכל אחדmicrocapillary, דוגרים (37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2), מורה למשאבת המזרק למשוך את הפתרון, ולתת יבשים microcapillaries (טמפרטורת חדר (RT) עבור 6 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אחד (חדר זלוף) microcapillary פיברונקטין מצופה לצינורות פוליקרבונט (500 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 100) וצינורות למשאבת מזרק יציאות מרובות, תוך שימוש באבזרי CapTite (6 תאי זלוף, 8 יציאות משאבת מזרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטת, לאבטח את גופו של כל תא זלוף לגוש חום המוגדר לטמפרטורה רצויה (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף במאגר (צינור microcentifuge או microtiter צלחת היטב) (תאים המכילים P388D.1 מקרופאגים העכבריים) המושעים במדיום גידול טרי (RPMI-1640, 10% FBS, 500 יחידות / מיליליטר פניצילין, 500 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל) בריכוז רצוי (10 6 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להורות למשאבת המזרק לצייר תאים (10 μl, 10 4 תאים) לתוך כל חדר זלוף אחריו מספיק AIR כדי להעביר את התקע הנוזלי (~ 4.5 ס&quot;מ) לסעיף מאובטח לגוש החום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לדבוק במשטחי הפנים פיברונקטין מצופים של תאי זלוף (37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 1 שעה). בינתיים, להעביר את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף ממאגר התאים למאגר חדש המכיל מדיום גידול טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדבקות, להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (תקשורת ממוזגות ותאים פנויים) לבזבז, לסגת בינונית טרי (10 μl), ופעל עם מספיק אוויר כדי למקם את האטמים הנוזליים החדשים (בינונית טרי) על דבק תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לבצע חילופי בינונית (כלומר חזור על שלב 1.7) במרווחי זמן קבועים (כל שעה 2) עד שאוכלוסיות התאים הן מספיק equilibrated ומורחבים (16 - 24 שעות של אוכלוסיות שנוצרו תרבות מיקרו בקנה מידה של כ -1,000 תאים / קאמרית). </li></ol> 2. לפברק התקני DMF ולהרכיב אדריכלות Hub <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lאני&gt; כפי שתוארתי קודם לכן 14,29, דפוס את צלחת תחתית מכשיר DMF עם ארבעים ושש תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) אלקטרודות (נהגים של אגל actuation) על ידי photolithography ותחריט, ואת מעיל עם 5 מיקרומטר של Parylene-C ו -50 ננומטר של טפלון AF. טופס הצלחת העליונה של מכשיר DMF על ידי ציפוי מצע זכוכית איטו unpatterned עם טפלון AF, כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במסגרות דחיסת מתכת, לתקן את צלחות DMF ליציקת פולימר 14,30 עם גומחות, כי לשמור על מרווח בין 400 מיקרומטר בין הלוחות; מרווח זה, בשילוב עם גודל אלקטרודה actuation (2.5 מ&quot;מ 2), מגדיר את נפח הטיפה (2.5 μl לאלקטרודה). שים לב שיכולה להיות מושלמת DMF הרכבה באמצעים פשוטים יותר 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה מצופה טפלון ההעברה microcapillaries (360 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 100; 3.5-4.0 סנטימטר) אל תוך החלל בין לוחות DMF, מיצוב כל אחד להארכה לקצה האלקטרודה actuation מאותו המקור שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לen ההפךד של כל העברה להדביק microcapillary הולם CapTite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעסיק את המחברים החשמליים לאספקת מתח לאלקטרודות איטו. רצפי הפעלת האלקטרודה הם אוטומטיים באמצעות שימוש בממשק אלקטרוני מבוקר מחשב פועל תסריטים שנקבעו מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: העבר את רכזת DMF התאסף על הבמה translational של מיקרוסקופ (SZ-6145TR (אולימפוס, יפן)) מצוידת במכשיר תשלום מצמיד (CCD) מצלמה (DCR-HC96 (סוני, יפן)) כדי להקל על המעקב של טיפות 31. </li></ol> 3. חברו את צ&#39;יימברס הזילוף לרכזת DMF ולעורר את אוכלוסיות התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף מהמאגר הבינוני (ראה שלב 1.6) ולהכניס אותם לתוך אבזרי CapTite מודבקים לקצות microcapillaries העברת רכזת DMF (ראה שלב 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (תקשורת ממוזגות) בתאי זלוף לבזבז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Instruct רכזת DMF לצייר גירוי (E. coli BioParticles ב 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל במדיום טרי עם 0.1% Pluronic F127 w / V) ממאגר על לוח ולספק טיפה בגודל המתאים (10 μl) לכל העברה microcapillary . המאגרים על הלוח מורכבים מתאים בצורת גלילית (1.5 x 1.5 ס&quot;מ כל אחת) ומחוברים לרכזת DMF דרך צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להורות למשאבת המזרק כדי לצייר את הגירוי מתחבר לmicrocapillaries ההעברה, ופעל עם מספיק אוויר כדי למקם את האטמים על אוכלוסיות תאים בתאי זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם גירוי (37 מעלות צלזיוס למשך 4 - 1 שעה). אופציונלי: Exchange לגירוי טרי (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4) במרווחי זמן קבועים. </li></ol> 4. לסיים את גירוי ולשחזר lysates תא לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: אם נדרש תקופה שלאחר גירוי, להחליף את אטמי הנוזל המכיל-גירוי למדיום חדש (חזור על שלבים כלומר 3.2-30.4, החלפת מדיום חדש לגירוי), ותמשיך לדגור ולהחליף במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את התקעים הנזילים בתאי זלוף לחיץ לשטוף (הצפת מודול תמוגה ישירה פרלוד ב) (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4, החלפת חיץ לשטוף לגירוי), ודגירה לפי צורך (5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את התקעים הנוזליים (לשטוף חיץ) לפתרון תמוגה (חיץ מודול תמוגה ישירה פרלוד עם 0.1% Pluronic F127 w / V) (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4, החלפת פתרון תמוגה לגירוי), ודגירה לפי הצורך (5 דקות) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (lysates תא) לרכזת DMF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את רכזת DMF, להסיר את הצלחת העליונה של מכשיר DMF (באמצעות טיפול לא כדי להטות את הצלחת הצידה, כמו זה יכול לגרום לטיפת ערבוב), ולאסוף את lysates באמצעות Pipetman או מזרק לניתוח פלטפורמה (את פרופיל ביטוי גנטי דרך qPCR). </li></ol> 5. פלטפורמת חומרה נקיות עבורלהשתמש שוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול microcapillaries ההעברה ואבזרי CapTite באקונומיקת 10% (V / V במים) במשך 10 דקות ב RT, לשטוף היטב עם מים deionized, ויבש באמצעות גז חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את צלחות מכשיר DMF באקונומיקת 10% במשך 10 דקות ב RT, יש לשטוף היטב עם isopropanol ואחריו המים deionized, ושימוש בגז חנקן יבש ואחרי האפייה ב 160 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור פוליקרבונט של משאבת המזרק, וצוות שחקני הפולימר של מכשיר DMF ומסגרת דחיסה, יכולים להיות שימוש חוזרים בלי ניקוי. זלוף קאמרי microcapillaries מבוטלים לאחר כל ניסוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments.">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li><li>Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+bioapplications.">Microfluidic devices for bioapplications.</a> Small. 7, 12-48 (2011).</li><li>Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-contained+microfluidic+cell+culture+system.">A self-contained microfluidic cell culture system.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).</li><li>Skafte-Pedersen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-contained,+programmable+microfluidic+cell+culture+system+with+real-time+microscopy+access.">A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access.</a> Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).</li><li>Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+complete+mammalian+cell+culture.">A microfluidic platform for complete mammalian cell culture.</a> Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).</li><li>Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Openly+Accessible+Microfluidic+Liquid+Handlers+for+Automated+High-Throughput+Nanoliter+Cell+Culture.">Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture.</a> Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).</li><li>Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+cell+array+with+individually+addressable+culture+chambers.">A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).</li><li>Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+culture+of+droplet-confined+cell+arrays.">Dynamic culture of droplet-confined cell arrays.</a> Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).</li><li>Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+perfusion+microfluidic+cell+culture+array+for+high-throughput+cell-based+assays.">Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).</li><li>King, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+real-time+gene+expression+living+cell+array.">A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array.</a> Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).</li><li>G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile,+fully+automated,+microfluidic+cell+culture+system.">Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system.</a> Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).</li><li>Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+-+Putting+electrowetting+to+work.">Chemistry - Putting electrowetting to work.</a> Science. 322, 539-540 (2008).</li><li>Gong, J., Kim, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-electronic+droplet+generation+on-chip+with+real-time+feedback+control+for+EWOD+digital+microfluidics.">All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 898-906 (2008).</li><li>Choi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+field+effect+transistor-based+biosensors+with+a+digital+microfluidic+device+for+a+lab-on-a-chip+application.">Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application.</a> Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).</li><li>Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+cell-based+assays.">Digital microfluidics for cell-based assays.</a> Lab Chip. 8, 519-526 (2008).</li><li>Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modifications+designed+to+improve+peptide+stability:+incorporation+of+non-natural+amino+acids,+pseudo-peptide.">Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide.</a> 16, 3185-3203 (2010).</li><li>Miller, E. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+microfluidic+approach+to+homogeneous+enzyme+assays.">A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays.</a> Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).</li><li>Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics:+a+versatile+tool+for+applications+in+chemistry,+biology.">Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology.</a> 12, 2452-2463 (2012).</li><li>Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Microfluidic+Magnetic+Separation+for+Particle-Based+Immunoassays.">Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays.</a> Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).</li><li>Sista, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+immunoassays+using+magnetic+beads+on+a+digital+microfluidic+platform.">Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform.</a> Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).</li><li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochip+functionalization+using+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidics+for+surface+plasmon+resonance+imaging+detection+of+DNA+hybridization.">Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).</li><li>Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+digital+microfluidics+for+enhanced+surface+plasmon+resonance+imaging.">Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).</li><li>Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidic+method+for+protein+extraction+by+precipitation.">Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Nelson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incubated+protein+reduction+and+digestion+on+an+electrowetting-on-dielectric+digital+microfluidic+chip+for+MALDI-MS.">Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS.</a> Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).</li><li>Mousa, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-scale+estrogen+assays+in+breast+tissue,+blood,+and+serum.">Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum.</a> Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).</li><li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+microfluidic+method+for+dried+blood+spot+analysis.">A digital microfluidic method for dried blood spot analysis.</a> Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).</li><li>Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics.">Digital microfluidics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).</li><li>Jebrail, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Microfluidics+for+Automated+Proteomic+Processing.">Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing.</a> J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).</li><li>Thaitrong, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Control+of+Next+Generation+Sequencing+Library+through+an+Integrative+Digital+Microfluidic+Platform.">Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform.</a> , (2012).</li><li>Shin, Y. J., Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+vision+for+digital+microfluidics.">Machine vision for digital microfluidics.</a> Review of Scientific Instruments. 81, (2010).</li><li>Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+minimally+disturbed+synchronous+cultures+of+hematopoietic+cells.">Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells.</a> BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).</li><li>Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+adhesion+of+hematopoietic+cells+to+culture+dish+induces+endomitosis+and+polyploidy.">Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy.</a> Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).</li><li>Raje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charged+nylon+membrane+substrate+for+convenient+and+versatile+high+resolution+microscopic+analysis+of+Escherichia+coli+&amp;+mammalian+cells+in+suspension+culture.">Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli &amp; mammalian cells in suspension culture.</a> Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).</li><li>Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+microfluidics+with+nonaqueous+solvents+and+solutions.">Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions.</a> Lab Chip. 6, 199-206 (2006).</li><li>Perroud, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-based+cell+sorting+of+Francisella+tularensis+infected+macrophages+using+optical+forces.">Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces.</a> Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).</li><li>Malone, J. H., Oliver, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays,+deep+sequencing+and+the+true+measure+of+the+transcriptome.">Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome.</a> BMC Biology. 9, (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidically-unified+cell+culture,+sample+preparation,+imaging+and+flow+cytometry+for+measurement+of+cell+signaling+pathways+with+single+cell+resolution.">Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution.</a> Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).</li><li>Srivastava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+platform+enabling+automated+phosphoprofiling+of+macrophage+response.">Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response.</a> Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).</li><li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics.">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פיתחנו פלטפורמה אוטומטית פשוטה ותכליתית לתרבית תאים בקנה מידה מייקר ניסויים וגירוי. הפלטפורמה מאפשרת לנו לעבוד עם כמויות קטנות תרבות ואוכלוסיות תאים (1 - 20 μl ו100 - 2,000 תאים, לכל תא); גדלי התרבות יכולים להיות מופחתים עוד יותר באמצעות שימוש בmicrocapillaries של קוטר קטן יותר...

המחקר של תאים נשמר בתרבות (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה רבת ערך לעקרונות היסוד והמנגנונים מולקולריים השולטים במערכות ביולוגיות מורכבות ועל בריאות אדם. את השיטות המקובלות לתרבות, גירוי, ואוסף של תאים לניתוח, אשר מנצלים צלחות פטרי וצלחות microtiter, נועדו למחקר של אוכלוסיות גדולות של תאים (≥ 10 5) בכרכי תרבות מ&quot;ל בקנה מידה (≥ 0.1 מ&quot;ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם רק כמויות מוגבלות של תאים זמינות (תאים ראשוניים לדוגמה), או אוכלוסיות קטנות של תאים רצויים (לדוגמה, כדי להפחית את התא אל תא השתנות פני האוכלוסייה), או חומרים כימיים הנדרשים הם קשים להשגה או יקר מדי (למשל גורמים מטוהרים תא מופרש). בעיות מסוג זה יכול להיות מטופל בהצלחה על ידי שינוי קנה מידה למטה גודל התרבות, שבו יש לו היתרון נוסף של הפחתת הצריכה של כלחומרים כימיים הנדרשים לניתוח ב1,2 המבחנה. לרוע המזל, ציוד ושיטות קונבנציונליים אינם תומכים במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות בקנה מידת מיקרו והמערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע 3-11 הם מורכבים ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים הרכבה ושימוש בפלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 - 2000 תאים) בכמויות בקנה מידת מיקרו (1 - 20 μl). ארכיטקטורת הפלטפורמה (איור 1) היא מודולרי בעיצוב: קבוצה של פיברונקטין מצופה microcapillaries (&quot;תאי זלוף סלולריים&quot; מודול) משמש כאתר להקמה, תחזוקה, וגירוי של תרבויות מיקרו בקנה מידה; ומיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF ) מכשיר 12,13 לבוש עם &quot;העברה&quot; microcapillaries (מודול &quot;המרכזי רכזת&quot;) 14,15 תאי מסלוליםוריאגנטים ומתאי זלוף. DMF מאפשר למשתמש לטפל בנפרד טיפות מרובות בו זמנית ולשנות מחדש או להזמין את המניפולציות (רכבות עיבוד מדגם להגדיר מחדש כלומר) מבלי לשנות את חומרת המכשיר. הגמישות העצומה שלו באה לידי ביטוי בהופעה האחרונה שלה כטכנולוגיה מרכזית במגוון רחב של יישומים, כולל תא תרבות 16,17, מבחני אנזים 18,19, 20,21 immunoassays, ה-DNA ניתוח 22,23, עיבוד חלבון, 24,25 ועיבוד דגימה קליני. 26,27 המוקד המרכזי שלנו מנצל את הגמישות המובנית למכשירי DMF, ומשפר עוד יותר אותו באמצעות תוספת של ממשקי microcapillary, אשר מספק הזדמנות לבצע את משנה של מניפולציות (תרבית תאים לדוגמה) בהיקפי מיוחד מודולים, ולא על המכשיר עצמו. DMF מידור של רכבות עיבוד בדרך זו גם מפשט את התכנון של PLAtform ארכיטקטורה (אין צורך לבנות מכשיר DMF שיכול לבצע את כל פעולות העיבוד) ומאפשר ההתפתחות שלה כפונקציות חדשות נדרשות (פשוט לשלב מודולים חדשים פריפריה בהתאם לצורך). הובלה של תאים ריאגנטים בתוך המוקד המרכזי היא מונע על ידי כוחות חשמלית הנוצרים על ידי הפעלה רציפה של אלקטרודות בתוך מכשיר DMF 13,28; תחבורה ל, מ, ובתוך תאי זלוף הוא מופעל על ידי שינויים בלחץ שנוצרו על ידי מזרק דיוק גבוה משאבה. כל תנועות של נוזלים אלה נשלטים באמצעות ממשק אלקטרוני פשוט ואוטומטי באמצעות שימוש בסקריפטים שנקבעו מראש. כדוגמה מייצגת, אנחנו מדגימים את השימוש בפלטפורמה למחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים (איור 2). ביצוע ניסויים אלה על הפלטפורמה אפשר לנו לעבוד עם מספר קטן של תאים (~ 1,000 לניסיונימצב טל), למזער את שונות ניסוי לניסוי, ריאגנטים לשמר, ומחדש ישירים הידיים על העבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, וכן הנגישות והצדדי שלה, פלטפורמה זו צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים ולהוכיח שימושי במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים הזמינים רק בכמויות מוגבלות.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prelude Direct Lysis Module</td>
 <td>NuGEN</td>
 <td>1400-24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue (0.4% w/v)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15250-061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Stripper</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>25-056-C1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ovation PicoSL WTA</td>
 <td>NuGEN</td>
 <td>3310-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agencourt RNAClean XP</td>
 <td>Beckman Coulter Genomics</td>
 <td>A63987</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pHrodo BioParticles</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P35361</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCL4 TaqMan qRT-PCR assay</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Mm00443111_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCL5 TaqMan qRT-PCR assay</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Mm01302428_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Mm00478374_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNF TaqMan qRT-PCR assay</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Mm00443258_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GAPDH TaqMan qRT-PCR assay</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Mm99999915_g1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F127</td>
 <td>Sigma Chemical</td>
 <td>2594628</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorinert FC-40</td>
 <td>Sigma Chemical</td>
 <td>51142-49-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Parylene C dimer</td>
 <td>Specialty Coating Systems</td>
 <td>28804-46-8</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Teflon-AF</td>
 <td>DuPont</td>
 <td>AF1600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyimide tape</td>
 <td>ULINE</td>
 <td>S-11928</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates </td>
 <td>Delta Technologies </td>
 <td>CB-40IN-1107</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries</td>
 <td>Polymicro Technologies</td>
 <td>TSU100375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber microcapillaries</td>
 <td>Polymicro Technologies</td>
 <td>TSP530700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubing and microcapillary fittings</td>
 <td>Sandia National Laboratories</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate tubing</td>
 <td>Paradigm Optics</td>
 <td>CTPC100-500-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 &mu;l capacity) syringes</td>
 <td>Hamilton Company</td>
 <td>54848-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Parylene-C vapor deposition instrument</td>
 <td>Specialty Coating Systems</td>
 <td>PDS 2010 Labcoter 2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-voltage function generator</td>
 <td>Trek</td>
 <td>615A-1 615-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MVX10 microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIClick digital CCD camera</td>
 <td>QImaging</td>
 <td>QIClick-F-CLR-12</td>
 <td>Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

a versatile automated platform for micro-scale cell stimulation experiments

מחקר של תאים בתרבית (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה חשובה לתוך מערכות ביולוגיות מורכבות. שיטות וציוד קונבנציונליות לניתוח במבחנה מתאימות גם ללמוד ממספר גדול של תאים (≥ 10 5) בכמויות בקנה מידת מ&quot;ל (≥ 0.1 מ&quot;ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם הוא נחוץ או רצוי להקטין גודל התרבות כדי להפחית את הצריכה של התאים של ריבית ו / או חומרים כימיים הנדרשים לתרבות שלהם, גירוי, או עיבוד. למרבה הצער, גישות קונבנציונליות אינן תומכות במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות מיקרו בקנה מידה, ואת המערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע הם מורכבות ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו פלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 - 2000 תאים) בנפח מיקרו בקנה מידהs (1 - 20 μl). הפלטפורמה מורכבת מסדרה של microcapillaries פיברונקטין מצופה (&quot;תאי זלוף תא&quot;), שבתוכה תרבויות מיקרו בקנה מידה שהוקמה, מתוחזק, והמגורה; התקן דיגיטלי מיקרופלואידיקה (DMF) לבוש עם &quot;העברה&quot; microcapillaries (&quot;מוקד המרכזי &quot;), שבו תאי מסלולים וריאגנטים ומתאי זלוף; משאבת מזרק דיוק גבוה, אשר סמכויות הובלה של חומרים בין תאי זלוף והמוקד המרכזי; וממשק אלקטרוני המספק שליטה על הובלה של חומרים, שהוא תיאם ואוטומטי באמצעות תסריטים שנקבעו מראש. כדוגמה, השתמשנו בפלטפורמה כדי להקל על מחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים. שימוש בפלטפורמה אפשרה לנו להפחית את הצריכה של תאים ריאגנטים, למזער את שונות ניסוי לניסוי, ומחדש ישירות הידיים על עבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, כמו גם הנגישות שלה ורבגוניות, oפלטפורמת ur צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים, ולהיות שימושית במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים שאינם זמינים בכמויות מוגבלות בלבד.

כהדגמה של הפלטפורמה האוטומטית, השתמשנו בו כדי לבצע את המחקר שבו אוכלוסיות קטנות של תאים חיסוניים גדלו בתרבויות בקנה מידת מיקרו, תיגר עם חיידקים, וlysed לניתוח את הפלטפורמה של תגובות פרו דלקתיות (איור 2 ). כל אחד משישה תאי זלו...

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments at JoVE.com

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

a-versatile-automated-platform-for-micro-scale-cell-stimulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.5K Views.  Sandia National Laboratories. אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים י?...

Video: A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.
GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of &tilde;10 pure enzymes requires less than 100 &mu;g of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).
Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are "mixture" experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.
All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For "core" enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as "accessory" are set to 0%. "Core" and "accessory" are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (&beta;-glucosidase), EX3 (endo-&beta;1,4-xylanase, GH10), and BX (&beta;-xylosidase).
<div id="myEventWatcherDiv">
	 </div>

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) is an automated platform for discovery and optimization of enzyme cocktails for biomass degradation. It can be adapted to multiple feedstocks and mixtures of enzymes containing multiple components.

GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...