עבודה זו נתמכת על ידי משרד של מדינת ניו יורק למדע, טכנולוגיה ומחקר אקדמי (NYSTAR) (בצורה של מרכז עבור טכנולוגיה מתקדמת מענק), וכן על ידי מענקים ממרכז Nanobiotechnology (NBTC), תוכנית STC הלאומי קרן המדע על פי הסכם מס &#39;ECS-9876771, והמוח האמריקאי גידול עורכי הדין בניו יורק, האקדמיה לרפואה (ג&#39;ב).

נוהל ציפוי שקופיות עם פיברונקטין לפני ההרכבה של המכשיר microfluidic, לעקר שקופיות הזכוכית עם פיברונקטין. המעיל שקופיות biohood לשמור על סטריליות. יישר spacer סטרילי PDMS בשולי השקופית ולסמן את הצד שהוא פונה כלפי מעלה עם סמן קבע. פיפטה 1 מ&quot;ל של פתרון מיקרוגרם / 5 מ&quot;ל של פיברונקטין (Sigma) בתוך spacer PDMS על מכלול שקופיות הזכוכית. השאירו את השקופיות ללא הפרעה במשך שעה, ואז להתייבש לחלוטין באמצעות אקדח 2 N. השקופיות ניתן לאחסן 4 o C עבור ניסויים מאוחר יותר. הרכבת מכשיר פרוטוקול כולו הרכבה המכשיר נעשית biohood בתנאים סטריליים, באמצעות הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את המאסטר סיליקון עם microchannels בדוגמת עליה על ידי מנגב אותו עם אתנול 70% וייבוש עם האקדח N 2. מניחים spacer סטרילי PDMS גובה 1 מ&quot;מ באמצעות מלקחיים סביב התכונות הקלה של המאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את הג&#39;ל agarose השתמשו במכשיר על ידי במשקל 0.3 גרם של אבקת agarose (פישר סיינטיפיק) ו 10 מ&quot;ל CO 2-מדיה עצמאית (Invitrogen) בכוס 50 מ&quot;ל. מערבבים את התערובת עם מרית חום במיקרוגל למשך 20 שניות על HIGH. אם גרגרי שלא נמס נוכחים, חום את התערובת למשך 10 שניות מערבולת את התערובת החמה להיפטר הגרגרים האחרון שנותר. חזור על התהליך עם זמן חימום של 8 שניות, ולאחר מכן 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לשפוך את הפתרון agarose על המאסטר סיליקון מוקף spacer PDMS ומיד לכסות את התערובת agarose עם שקופיות זכוכית סטרילית. החלת לחץ מתמיד, עדין לשקופית כ -2 דקות על מנת להבטיח כי agarose יהיה ג&#39;ל כדי באותו גובה 1 מ&quot;מ קבוע כשומר PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;לים agarose, לקלף agarose בדוגמת ג&#39;ל עם spacer PDMS מן האדון סיליקון להעביר שקופיות הזכוכית פיברונקטין מצופה microchannels בתוך הג&#39;ל agarose מול שקופית. השתמש קצה המזרק 16 מד לנקב חורים לתוך האזורים מאגר של microchannels עבור כניסת כניסות ו לשקע. הוסף 500 μl של CO 2-מדיה עצמאית על agarose בדוגמת ג&#39;ל בשקופית כדי למנוע התייבשות של microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את סעפת אקריליק בשימוש במכשיר עם אתנול 70% ולשטוף עם מים די. יישר את החורים הרבים עם החורים אגרוף לתוך הג&#39;ל agarose עם microchannels. ואז, ליישר את סעפת עם הג&#39;ל, spacer PDMS, ואת החלק פיברונקטין עם מסגרת המתכת של המכשיר. המקום ברגים לתוך המכשיר והדק עד כדי התנגדות באמצעות מברג. הדבר נעשה על מנת להבטיח כי המכשיר אינו מעל התהדקו עד כדי לעוות את microchannels ב agarose. הדקו את הברגים כדי השעון כדי להבטיח את הג&#39;ל בתוך המכשיר אינו משמרת. בדוק את המכשיר עבור דליפות חסימות microchannels שימוש במזרק 1ml. מזרק מצויד בצינור Tygon עם קצה ג&#39;ל טעינת פיפטה בסוף בצינור להזריק 2-CO מדיה עצמאית ב microchannels. Microchannel נחשבת נוצר בהצלחה כאשר התקשורת היא נצפתה רק יציאה משקע של microchannel כאשר התקשורת מוזרק לתוך מפרצון המקביל. עכשיו, המכשיר מוכן לשימוש. </li></ol> הכנה מתזמן את התאים למכשיר כאשר התאים מגיעים 70% (צפיפות התאים סביב 100,000 תאים / מ&quot;ל) confluency, הם מוכנים להיות seeded לתוך המכשיר. נושא התאים לשני DPBS (Invitrogen) שוטף. הוסף 200 μl של טריפסין-EDTA (Invitrogen) לנתק את התאים. העברת התאים צינור המכיל 15 מ&quot;ל צנטריפוגות 5 מ&quot;ל של התקשורת M2 המכילה סרום להשבית טריפסין. Centrifuged התקשורת צמיחה עם התאים על 1000 סל&quot;ד במשך 5 דקות. Aspirated את supernatant ו resuspend גלולה של תאים 5 מ&quot;ל של DPBS. צנטריפוגה התאים DPBS שוב באותם תנאים. Aspirated את supernatant שוב, resuspend גלולה של תא 500 μl של CO 2-מדיה עצמאית. זרעים ההשעיה וכתוצאה מכך התאים למרכז microchannel של המכשיר באמצעות זרימת הכבידה מונע. מוסיפים את כניסת ו לשקע של מרכז microchannel עם 60 μl של השעיה על התא 20 μl של המדיום 2-CO עצמאיים, בהתאמה. שים לב מרכז microchannel תחת מיקרוסקופ brightfield לחפש הידבקות התא. התאים בדרך כלל לדבוק אחרי 10 דקות. אחרי התאים להיצמד לתחתית הערוץ בצפיפות ראויה, pipeted את ההשעיה תא שנותרו כניסת ואת התקשורת לשקע. מקום 60 μl של CO2 עצמאית התקשורת וגם לשקע כניסת הערוץ למרכז. המקום משתרע על פני ה PDMSדואר כניסת מרכז לשקע כדי למזער את התאדות של התקשורת מערוץ מרכז. הדמיה התאים למכשיר לפני ההרכבה של המכשיר, החוט צינורות peristaltic סטרילית דרך תחנת מזג האוויר של המיקרוסקופ (אולימפוס X81) ולהתחבר עם המשאבה peristaltic (ווטסון, מרלו 205U/CA). פלאש PBS דרך צינורות בשיעור של 4 סל&quot;ד. לאחר ההרכבה של המכשיר, להכין ריכוזים מתאימים של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) (Sigma) פתרונות של 2-CO מדיה עצמאית ב 15 מבחנות צנטריפוגה מ&quot;ל. וורטקס EGF פתרונות עבור 5 שניות להתחבר עם צינור. חבר את tubings המסומנים ריכוזי EGF המתאים למכשיר. זה לוקח בערך שעה עבור EGF כדי מפוזר על פני הרכס ערוץ ולהקים שיפוע כימי יציב. תוכנת הדמיה, Slidebook, הוא נהג לקחת סדרה של תמונות על כל 10 דקות במשך כ 5 שעות בטווח ניסיונית. השלב xy אוטומטי מתוכנת כך כי שני אזורי משנה (כל אחד עם שטח של x400μm 400μm) של הערוץ אותו מוקד, וכן סך של שלושת הערוצים הם צילמו במרכז בנקודת זמן נתונה. תאים ערוצי מרכז שונים (בדרך כלל 3 בטווח אחד) יש ריכוזים EGF שונים, המסומנים על הצינור. חומרים וציוד שורות תאים: תאים C17.2 NSCs נגזר השכבה החיצונית של המוח הקטן נבטי עכבר הלידה 6, 7. באמצעות קו זה התא, פיתחנו שני האחרים Murine בתאי גזע קווי transfection באמצעות שיטת רטרווירוס. שתי השורות הללו ביציבות התא transfected הם (1) wtEGFR - כי מעל מבטא את EGFR אדם סוג בר, (2) ΔEGFR - כלומר מוטציה EGFR פעיל constitutively. על מנת להקל על הזיהוי, רטרווירוסים לשאת השדרה עם הגן של אינטרסים ואחריו אתר פנימי מחייב ריבוזומלי (IRES) לבין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). Cell תרבות: C17.2 העכבר NSCs וגירסאות שלהם גדלו צלחת 6-באר M2 מדיה (DMEM (Invitrogen) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) (Invitrogen), סוס בסרום 5% (ש&quot;מ) (Invitrogen ), ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen).) תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס באוויר 80% ו 5% CO 2. המכשיר microfluidic: סעפת פלסטיק, spacer PDMS, ואת מסגרת נירוסטה להחזקת המכשיר במקום. הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה (אולימפוס IX-81) משמש, בקשר עם CCD התעצמה המצלמה (אורקה, Hamamatsu). המכשיר microfluidic הוא רכוב על הבמה XYZ אוטומטיות, והשלב מוקפת קאמרית סביבתיים שומרת על טמפרטורה של 37 o C. בדרך כלל יש 3-4 מכשירים על אותו שבב זה יהיה מצולם בנקודת זמן זהה באמצעות הבמה אוטומטיות xyz. שמירה על תזרים המשאבה peristaltic עם 8 קווים מקבילים (ווטסון, מרלו 205U/CA) אוטומטי משמש כדי לשמור על תזרים בכל הכיור ערוצי מקור. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="איור 1" width="573" height="414" /> איור. 1 תנועתיות של שלושה זנים NSC (הורים, wtEGFR, ו-D-EGFR) בריכוזים שונים EGF כל מסלולי לקוחים מעקב סרט של 5 שעות (למעט wtEGF 100ng/ml, 4hour), וכן את המקור של כל המסלולים היו מיקומו בבית (0,0) לצורך השוואה. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="איור 2" width="576" height="546" /> איור. 2 מתאם של רמת ביטוי EGFR ו - תנועתיות (א) שתי תמונות של NSCs wtEGF על פני השטח של ערוץ microfluidic עם 100ng/ml EGF. התמונה השמאלית היא תמונה ניאון, והזכות היא תמונה משודרים שדה בהיר. סרגל מידה הוא 100μm, ואת רוחב הערוץ הוא 400 מיקרומטר. תאים מופרדים לשתי האוכלוסיות על ידי בהירות ה-GFP הביעו. תאים בחוגים כחול הם עמומים, ובכך יש רמת ביטוי EGFR פחות; ותאי בחוגים באדום brigher, ובכך יש ביטוי ברמה גבוהה EGFR. (ב) מסלולים של תאים עם רמה נמוכה וגבוהה ביטוי EGFR. מסלולים אלו לקוחים מתוך סרט באורך שעה ארבע.

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

איור. 1 מראה מסלולים של שלושה זנים NSC, התאים הורית, wtEGFR ואת ΔEGFR (שליטה). כל סט של מסלולי התקבלו בסרט 5 שעות ארוכות. עבור תאים הורית, תנועתיות התא הגיע לשיאו כאשר ריכוז EGF היה ~ 10ng/ml; עבור תאים wtEGFR, תנועתיות שיא התא עבר 100ng/ml או לעיל; עבור תאים ΔEGFR, תנועתיות התא היה עצמאי של ריכוז EGF כצפוי. </p...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

בעוד הטכנולוגיה microfluidic הוא להגיע לרמה חדשה של בגרות עבור מבחני macromolecular, מבוססי תאים מבחני נמצאים עדיין בשלב תינוק 1. זהו בעיקר בשל הקושי שבה ניתן ליצור microenvironment תא תואם ויציב באמצעות טכניקות microfabrication קונבנציונאלי וחומרים. אנו לטפל בבעיה זו באמצעות הקדמה של חומר microfabrication רומן, agarose ג&#39;ל, כחומר בסיס עבור המכשיר microfluidic. Agarose ג&#39;ל הוא נזיל מאוד, החדיר את גז וחומרים מזינים הנחוצים להישרדות התא, ובכך חומר אידיאלי עבור מבוססי תאים מבחני. הראינו בעבר כי agarose מכשירים מבוססי ג&#39;ל הצליחו ללמוד נדידת תאים חיידקיים נויטרופילים 2. בדו&quot;ח זה, בשלושה ערוצים מקבילים microfluidic הם בדוגמת בקרום ג&#39;ל agarose בעובי 1 מ&quot;מ בערך. תזרים קבוע עם התקשורת / חיץ נשמרים בשני ערוצי הצד באמצעות משאבת peristaltic. תאים נשמרים בערוץ במרכז לצורך השגחה. מאז מזינים וכימיקלים בערוצים לוואי לשדר כל הזמן מהצד למרכז הערוץ, את הסביבה הכימית של הערוץ במרכז נשלטים בקלות באמצעות זרימת לאורך תעלות הצד. שימוש במכשיר זה, אנו מראים כי תנועת בתאי גזע עצביים ניתן לנטר אופטית בקלות בתנאים כימיים שונים, את תוצאות הניסוי הראו כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים. תנועתיות של בתאי גזע עצביים הוא סמן חשוב להערכת האגרסיביות תאים, ובכך גורם tumorigenic 3. פיענוח המנגנון הבסיסי תנועתיות NSC תניב תובנה הן הפרעות התפתחות סרטן עצביים אל המוח הפלישה בתאי גזע.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device at JoVE.com

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג&#39;ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

assessing-neural-stem-cell-motility-using-an-agarose-gel-based

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Cornell University. אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא ?...

Video: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

Non-Bonding פלזמה של PDMS עבור ייצור זולה של מכשירים microfluidic

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.