בידול תאי קודמן עצבי הנגרמת על ידי שדה חשמלי בהתקנים מיקרופלואידיים

מחקר זה מציג פרוטוקול לבידול של תאי מבשר עצביים הנגרמים אך ורק על ידי גירוי דופק זרם ישיר במערכת מיקרופלואידית. טכניקה זו מספקת גישה מועילה להפחתת זמן ההתקנה הניסיוני, נפח הדגימה ונפח ריאגנט. יתר על כן, שבב MOE מתאים לתצפיות מיקרוסקופיות קונפוקאליות.

טיפול דופק זרם ישיר פשוט יכול לשלוט על גורלם של תאים מבשר עצבי העכבר והוא יכול לשמש לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עבור הפרעות במערכת העצבים. כדי להתחיל, צייר תבניות עבור שכבות PMMA בודדות והקלטת הדו-צדדית המשתמשת בתוכנה המתאימה. הפעל את סופר לייזר פחמן דו חמצני ולחבר אותו למחשב אישי.

פתח את קובץ התבנית המעוצב באמצעות התוכנה. הנח את יריעות ה- PMMA או את הסרט הדו-צדדי על הפלטפורמה של סופר הלייזר ולאחר מכן מקד את הלייזר על פני השטח של יריעות PMMA או על הקלטת הדו-צדדית באמצעות כלי המיקוד האוטומטי. בחר את סופר הלייזר כמדפסת ולאחר מכן השתמש בסופר הלייזר כדי להפעיל את ההבלציה הישירה בגיליון PMMA או בקלטת דו-צדדית.

הסר את סרט המגן מסדיני PMMA ולנקות את פני השטח באמצעות גז חנקן. עבור מליטה יחד שכבות מרובות של יריעות PMMA, מחסנית שלוש חתיכות של יריעות PMMA מילימטר אחד לקשר אותם תחת לחץ של חמישה קילוגרמים לסנטימטר מרובע בונדר תרמי במשך 30 דקות ב 110 מעלות צלזיוס כדי ליצור את זרימת או הרכבת ערוץ גירוי חשמלי. הדבק 12 חתיכות של מתאמים לפתחים הבודדים בשכבה אחת של הרכבה שבב MOE עם דבק cyanoacrylate משחק מהיר.

לחטא את מצעי PMMA מילימטר אחד, את הקלטת דו צדדית, ואת PMMA כיתה אופטית שלושה מילימטר באמצעות הקרנה אולטרה סגולה במשך 30 דקות לפני הרכבת השבב. הדבק את מצעי PMMA מילימטרי אחד על PMMA כיתה אופטית שלושה מילימטר עם קלטת דו צדדית כדי להשלים את הרכבת PMMA. הדבק את כיסויי הכיסוי הנקיים להרכבת PMMA עם הקלטת הדו-צדדית.

אטמו את פתחי מתאמי גשר אגר עם תקעים לבנים צמודים לאצבע. חבר את המחבר התחתון השטוח למכלול שבב ה- MOE באמצעות מתאמי כניסת ושקע הבינוניים ולאחר מכן חבר את מתאם חרוט Luer למכלולי העצירה התלת-כיווניים. הוסף שני מיליליטר של פתרון 0.01%PLL באמצעות מזרק שלושה מיליליטר שמתחבר לעצירה תלת כיוונית של כניסת בינונית, ולחבר מזרק ריק שלושה מיליליטר לעצירה תלת כיוונית של השקע הבינוני.

מלא את אזורי תרבות התאים בתמיסת PLL, ולאט לאט לשאוב את פתרון הציפוי קדימה ואחורה. סגרו את שני העצירה המשולשת כדי לאטום את הפתרון בתוך אזורי התרבות. דגירה שבב MOE ב 37 מעלות צלזיוס לילה באינקובטור מלא 5% פחמן דו חמצני אטמוספירה.

פתח את שני stopcocks שלוש דרך לשטוף את בועות בערוצים על ידי שאיבה ידנית של פתרון הציפוי הלוך ושוב בערוץ באמצעות שני מזרקים. צייר שלושה מיליליטרים של מדיום שלם לתוך מזרק שלושה מיליליטר שמתחבר לעצירה תלת כיוונית של הכניסה הבינונית ולהוסיף אותו כדי להחליף את פתרון הציפוי באזורי תרבות התא. החלף את התקע הלבן ההדוק באצבע במתאם Luer והזרק 3% agarose חם כדי למלא את המתאם.

חבר את מזרק מנעול Luer למתאם Luer והזרק 3% חם agarose דרך באנג גומי שחור כדי למלא את מזרק מנעול Luer. אפשר 10 עד 20 דקות עבור agarose להתקרר ולחזק. התקן את שבב MOE זרע התא על תנור ITO שקוף כי הוא מהודק על שלב ממונע XYZ לתכנות נשמר ב 37 מעלות צלזיוס.

להחדיר את mNPCs על ידי שאיבה ידנית לתוך שבב MOE דרך השקע הבינוני, ולאחר מכן דגירה שבב MOE זרע התא על תנור ITO במשך ארבע שעות. השתמש בחוטי חשמל כדי לחבר מולטיפלקסר EF לשבב MOE באמצעות האלקטרודות בשבב. חבר מולטיפלקסר EF ומחולל פונקציות למגבר כדי ליצור פולסים DC של גל מרובע.

הסר את כל המחבר התחתון השטוח והמתאמים בשבב MOE ומלא את המתאמים ב- PBS ולאחר מכן אטום את פתחי המתאם בפרפילם. לאחר immunostaining, להתבונן בתאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. גירוי הדופק DC הביא MNPCs בו זמנית הבחנה לתוך נוירונים, אסטרוציטים, ו oligodendrocytes במדיום תחזוקת תאי גזע.

אחוזי הנוירונים, האסטרוציטים והאוליגודנדרוציטים בקבוצת הביקורת ובקבוצת הגירוי מוצגים כאן. לאחר טיפול הדופק DC, mNPCs הביעו מספרים גבוהים באופן משמעותי של נוירונים ב DIV שבע, אסטרוציטים ב DIV שלוש, ו oligodendrocytes ב DIV שבע ו DIV 14 היו נוכחים ברמות גבוהות יחסית בקבוצות הגירוי מאשר בקבוצת הביקורת. נוירוספרות שנוצרו על ידי 30 עד 40 תאים עדיפים על ייזום בידול mNPC.

גרימת יתר של mNPCs תפגע בהישרדות התאים במהלך תהליך הבידול.