סטפנו פומגלי הוא עמית של קרן Monzino.

<html> 1. Immunofluorescence הפרוטוקול הבא מבוצע על cryosections מוח העטרה שהתקבל בעכברים perfused transcardially (20 מיליליטר של PBS, 0.1 mol / ליטר, pH 7.4, ואחריו 50 מיליליטר של paraformaldehyde המצונן 4% ב-PBS). לאחר זלוף, המוח יוסרו בזהירות והועבר לסוכרוז 30% PBS ב 4 ° C למשך הלילה לcryoprotection. אז המוח מוקפא במהירות על ידי טבילה בisopentane ב-- 45 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות לפני שנחתם לתוך צלוחיות ומאוחסנים ב -70 ° C עד לשימוש. cryosections העטרה המוח (20 מיקרומטר) נחתכים באופן סדרתי וכפוף לפרוטוקול immunofluorescence 11, 6. להביא את כל חומרים כימיים ודגימות לטמפרטורת חדר לפני השימוש. אנא שים לב כי דילולים עובדים הציגו נוגדנים וסרום כתוצאה מניסויים שנעשו על מנת לקבל את הביצועים הטובים ביותר. כאשר נוגדנים וסרום שונים משמשים, הפרוטוקול צריך להיות מאומת. class = &quot;jove_content&quot;&gt; הערה שבגלל נוגדנים עיקריים הן אנטי CD11b ואנטי CD68 מבוצעים בעכברים, כדי למנוע אות צלב על ידי אנטי עכברוש אלקסה 546, השתמשנו דילול גבוה של אנטי CD11b אחרי ההגברה אות ניאון עם ערכת ה-TSA (Cy5 tyramide). הקמנו דילול העבודה האופטימלי עבור אנטי CD11b על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר פרט לצעד 1.17 ושימוש לפחות 7 דילולים שונים של אנטי CD11b כפי שדווח בטבלה 1. כתוצאה מכך, 1:30,000 נבחרו להיות הדילול רק השגת: 1) אות גלויה עם Cy5 בננומטר 646 גל העירור; 2) אין אות עם אלקסה 546 בגל עירור 532 ננומטר. בדרך זו, Alexa 546 אות ניאון קשורה באופן סלקטיבי עם ביטוי CD68. דילולים אופטימליים עבור אנטי CD11b ונוגדנים נגד CD68 עשויים להשתנות בהתאם לסוג של רקמה וחייבים להיות מוגדרים מראש כדי להתחיל את פרוטוקול שיתוף תיוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף cryosections המוח פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוךcryosections cubate למשך 5 דקות בPBS המכילות 1% H 2 O 2 (שלב נדרש מאז ההגברה הניאון צריכה דגירה עם חזרת peroxidase, streptavidin-HRP, ראה שלב 1.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 2X עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.3% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל עיקרי Ab עכברוש אנטי CD11b [1:30,000], NGS 10% ו0.3% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף cryosections 2x (5 דק &#39;) עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות המשני אנטי העכברוש Ab biotinylated [1:200] ו1% NGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 2X עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף cryosections עם TNT (טריס-HCl, NaCl, Tween: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל1.5 שעות בTNB (טריס-HCl-NaCl-חסימת חיץ: 0.1 M טריס-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.5% מגיב חסימה מערכה מתאימה (ראה טבלה של חומרים כימיים)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryo שטפי<html> סעיפי 3x פעמים עם TNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections בTNB מכיל streptavidin-HRP [1:100]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם TNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections במשך 8 דקות בהגברה ממסה המכילות Cyanine 5 tyramide [1:300]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות NGS 10% ו0.1% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ב 4 ° C למשך הלילה בPBS המכיל Ab העכברוש אנטי CD68 העיקרי [1:200], 3% NGS ו0.3% טריטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections ל60 דקות בPBS המכילות Ab Alexa 546 אנטי עכברוש fluorconjugated המשני [1:500] ו1% NGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה cryosections עבור 10 דקות בPBS המכילות מיקרוגרם / מיליליטר Hoechst 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cryosections לשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר cryosections בלהאריך את זהב. </li></ol> 2. רכישת תמונות תלת ממדיות על ידי מיקרוסקופיה confocal s = &quot;jove_content&quot;&gt; מיקרוסקופ משמש כאן היה מיקרוסקופ IX81 מצויד FV500 יחידת סריקת confocal עם 3 קווי לייזר: Ar-Kr (488nm), אדום הוא Ne-(646nm), וירוק הוא Ne-(532nm) ו דיודות UV. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לייזרי העירור בהתאם לאורכי הגל של צבעי ניאון כדי להיות נרגש (אדום הוא Ne-לCy5, CD11b; ירוק הוא Ne-לAlexa546, CD68 ודיודות UV לHoechst, גרעינים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את השילוב הטוב ביותר עבור מראה dichroic אוסף אותות אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רזולוציית תמונה במינימום של 800 600 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את תחומי עניין של באמצעות עלית הקרינה והדרגה להגדיל את ההגדלה לאובייקטיבית 40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לשיטת לייזר סריקה מיקרוסקופית (LSM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל סריקות חוזרות ונשנות כדי להתאים את מכפיל (PMT) ורווח לכל ערוץ. לייזרים יכולים להיות מופעלים בנפרד כדי להקל להגדיר. שמור על רווח נמוך ככל האפשר כדי להימנע מאותות שאינם ספציפיים לא רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם repetitive סריקה פועל, העבר את מוקד השליטה להגדיר קצוות העליונים ותחתונים של ציר Z (סה&quot;כ אורך ציר z = 10 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק סריקה חוזרת ונשנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת גודל צעד. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר לגודל פיקסל (0.225 מיקרומטר) כדי לקבל יחס של 1:1 בגודל סטנדרטי על ציר ה-z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מסנן קלמן לפחות 2 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מצב סריקה רציף כדי למנוע תופעות לדמם דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חצי דרך לאורך ציר z ולהריץ סריקה רציפה XY. בדוק את ההגדרה של PMT ורווח (יחס אות / רעש טוב). אם אינו משביע רצון, חזור על שלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל רכישת XYZ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא כקובץ multitiff. כל קובץ multitiff בדרך כלל מכיל 3 ערוצי צבע (כחול, ירוק ואדום) ו44 מטוסי מוקד. </li></ol> 3. צפו בתלת ממדי של רכישות Confocal ועיבוד תלת ממדי להעלות קבצי multitiff לתוכנת Imaris ולעבד אותם באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">תוכנה פתוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התצוגה לעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלה את קובץ multitiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הצבע הרצוי עבור כל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רעש מהרקע על ידי הגדלת הערך המינימאלי בלוח התאמת תצוגה. התאם כל ערוץ בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתצוגת הסעיף. לנוע לאורך ציר z מחפש שיתוף לוקליזציה (פיקסלים צהובים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על אזור צהוב כדי לראות אם colocalization נמצא לאורך ציר Z (כלומר שייך לאובייקט מוצק). תחזיות ציר ה-Z נראות בחלק הימני ותחתון של הדמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תמונת מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כדי לעלות תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבול 3D לבודד את תא או קבוצה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ אחד בלוח התאמת תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קבלן האלגוריתם לעלות / משטחים. צעדי אלגוריתם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סף (להשתמש באותו הערך מינימאלי בtהוא מציג פנל התאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שינוי הגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר החלקה (= 0.200 הטובים ביותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מראה צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של אלגוריתם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.12 לכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטלו את הבחירה ערוצי הקרינה בלוח התאמת תצוגה ולבחור את כל שלושה המשטחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העצמה כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תמונת מצב. </li></ol>

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+in+stroke:+therapeutic+targets.">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li><li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma.">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li><li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment.">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373 (2007).</li><li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype.">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943 (2011).</li><li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages.">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li><li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury.">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

אנו מציגים כאן פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M לאזור איסכמי (לניתוח מפורט יותר ראה נ&quot;צ 6). שיטה זו משלבת מכתים ספציפי של סמן הרלוונטי של הפעלת M / M עם confocal הדמיה תלת ממדית. ה...

לאחר פגיעה מוחית חריפה, מיקרוגליה במהירות מופעלים ולעבור מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים משתנים 1-3. תגובה מהותית זה קשור לגיוס של מקרופאגים יליד דם אשר נודדים לתוך 4,5 parenchyma המוח נפגע. התפקיד של מיקרוגליה ומקרופאגים אשר antigenically לא להבחין (המכונה מעתה כז / ז) בפגיעה מוחית עדיין במחלוקת. מספר גדל והולך של מחקרים מצביע על כך, באופן דומה למה שתאר למקרופאגים היקפיים, מיקרוגליה ומוח מגויסים מקרופאגים יכולים להניח פנוטיפים שונים קיצוניות שמתאימה לרעיל קלאסי הפרו דלקתי (M1) או הפנוטיפ אנטי דלקתי מגן (M2). מצבי ההפעלה השונים, כולל הפרשה של גורמים פרו או אנטי דלקתיים, שחרורו של מולקולות נוירוטרופי ופעילות lysosomal מתאפיינים בדפוס מסוים של סמנים פנוטיפי, ביטוי שתלוי בזמןאבולוציה של הסביבה. האפיון של פנוטיפים M / M אלה במוח נפגע הוא עדיין מועט. אנחנו השתמשנו במודל עכברי מבוסס היטב של pMCAo לנתח ביטוי M / M ואבולוציה לאחר שבץ. פרוטוקולי Immunofluorescence מבוססים שהוצגו כאן שואפים לקבל תובנה המראה של סמנים ספציפיים M / M פנוטיפ, הלוקליזציה שלהם ושיתוף ביטוי סלולארי באזור איסכמי. אנחנו בדקנו כמה מולקולות הקשורות למצב הפעלה שונה או פנוטיפ, כלומר CD11b, סמן משטח לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות וסמן בשימוש נרחב של הפעלה / גיוס M / M 6-8, CD68 סמן של lysosomes 6,7 וYm1 הפרשה חלבון לידי ביטוי על ידי מקרופאגים מופעלים לחלופין (M2) וקשורה להחלמה ושיקום תפקוד 9-10. כאשר שני סמנים באים לידי ביטוי על ידי אותו התא, אך בתאי subcellular שונים, colocalization לבד לא יכול להיות הרבה informative. במקרה זה, ניתוח של coexpression יכול להתבצע על ידי שימוש בתצוגת מישור אחד וע&quot;י הדמיות תלת ממד. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול כדי להשיג ניתוח תלת ממדים יסודי של coexpression סמן.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD11b</td>
			<td>Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD68 </td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA 1957</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>1404</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td>
			<td>CHEMICON</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biotinilated Goat Anti-Rat antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-065-143</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TSA Cyanine 5 System </td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL705A001KT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Prolong Gold </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rat alexa 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11081</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti mouse Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vectors Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tritin X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat CM1850</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Olympus IX81 confocal microscope </td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AnalySIS software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaris software 5.0</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Photoshop cs2</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software packages GraphPad Prism version 4.0</td>
			<td>GraphPad Software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury

לאחר מיקרוגליה שבץ המוחי / מקרופאגים (ז / ז) עובר שפעול מהיר עם שינויים מורפולוגיים ופנוטיפי דרמטיים הכוללים ביטוי של פני השטח אנטיגנים רומן וייצור של מתווכים כי לבנות ולתחזק את התגובה הדלקתית. ראיות מצביעות על כך שמתעוררים M / M הם תאי פלסטיק מאוד שיכול להניח הפעלה קלאסית פרו דלקתית (M1) או חלופית אנטי דלקתית (M2) לאחר פגיעה מוחית חריפה. עם זאת אפיון של ביטוי M / M סמן פנוטיפ, colocalization והתפתחות הטמפורלית במוח נפגע מלא עדיין חסר. פרוטוקולי Immunofluorescence במיוחד מכתימים סמנים רלוונטיים של הפעלת M / M יכולים להתבצע במוח איסכמי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדי כגישה רבת עוצמה כדי לחקור את הדפוס של לוקליזציה ושיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ M / M כגוןCD11b, CD68, Ym1, במודל של עכברים של איסכמיה מוקד הנגרמת על ידי חסימה קבועה של עורק המוח האמצעי (pMCAO). ניתוח דו ממדי של האזור המוכתם מגלה כי כל סמן קשור למורפולוגיה M / M מוגדר ויש לו לוקליזציה נתון בנגע איסכמי. דפוסים של שיתוף ביטוי סמן פנוטיפ M / M ניתן להעריך על ידי confocal הדמיה תלת ממדית באזור איסכמי. ניתן לרכוש תמונות על נפח מוגדר (10 מיקרומטר Z-ציר וגודל צעד 0.23 מיקרומטר, המקביל ל 180 x 135 x 10 מיקרומטר נפח) עם מצב סריקה רציף כדי למזער את ההשפעות לדמם דרך ולהימנע מגל חופף. אז תמונות מעובדות להשיג הדמיות תלת ממדיות באמצעות תוכנת Imaris. השקפה מוצקה של שלוש הדמיות ממדיות מאפשרת ההגדרה של ביטוי סמן באשכולות של תאים. אנחנו מראים שיש לי M / M היכולת להבדיל כלפי מספר רב של פנוטיפים, תלוי במיקום באתר הנגע וtiשלי אחרי פציעה.

דוגמא לתוצאות המתקבלות כאשר פרוטוקולי תיוג ורכישות confocal מתבצעים לאזור איסכמי מתוארת באיורים 1 א ו-1B. צפו בשני ממדים של תמונות שנרכשו עולה כי בעשרים וארבע שעות לאחר איסכמיה (א &#39;), CD68 סמן lysosomal (הירוק) בא לידי ביטוי בתאי hypertrophic ameboid CD11b (אדום) נמצאים בלי?...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury at JoVE.com

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד.

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.5K Views.  IRCCS - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri.  דרך להשיג תובנות חדשות על המורכבות של התגובה הדלקתית במוח מוצגת. אנו מתארים פרוטוקולים מבוססי immunofluorescence אחרי ניתוח confocal תלת ממדים כדי לחקור את הדפוס של שיתוף ביטוי של סמני פנוטיפ מיקרוגליה / מקרופאג במודל של עכברים של איסכמיה מוקד. 

Video: Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

אוטומטיות והרצתי ניתוח אצל עכברים עם פציעה כרונית הכיווץ

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

השרשה כרונית של מערך שלם-קורטיקליים Electrocorticographic ב המרמוסט נפוצות

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

מידול צורה תלת מימדי וניתוח מבני המוח

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...