Stefano Fumagalli ist ein Fellow der Monzino Foundation.

1. Immunfluoreszenz Das folgende Protokoll wird koronalen Hirngefrierschnitten von Mäusen transkardial perfundiert (20 ml PBS, 0,1 mol / Liter, pH 7,4, gefolgt von 50 ml gekühltem Paraformaldehyd 4% in PBS) erhalten wurden. Nach Perfusion werden Gehirne vorsichtig abgenommen und in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C über Nacht zur Kryokonservierung übertragen. 45 ° C für 3 Minuten, bevor sie in Ampullen versiegelt und bei -70 ° C bis zur Verwendung gelagert - Die Gehirne werden dann schnell durch Eintauchen in Isopentan bei froren. Koronare Gehirn Gefrierschnitte (20 um) seriell zu schneiden und Immunfluoreszenz-Protokoll 11, 6 unterzogen. Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur gebracht. Bitte beachten Sie, dass die vorgestellten Arbeits Verdünnungen von Antikörpern und Serum ergaben sich aus Studien, um die beste Leistung zu erhalten, gemacht. Wenn verschiedene Antikörper und Serum verwendet werden, muss das Protokoll validiert werden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hinweis, dass da sowohl anti-CD11b-und Anti-CD68-Antikörper werden in primären Ratten gemacht, die grenzSignal durch anti-Ratte Alexa 546, verwendeten wir eine hohe Verdünnung von Anti-CD11b, gefolgt von Fluoreszenz-Signal-Amplifikation mit vermeiden TSA-Kit (Cy5 Tyramid). Wir haben die optimale Arbeitsverdünnung für Anti-CD11b durch die Durchführung der beschriebenen Protokoll außer Schritt 1.17 und unter Verwendung von mindestens 7 verschiedene Verdünnungen von anti-CD11b, wie in Tabelle 1 angegeben eingestellt. Als Ergebnis hat 1:30.000 gewählt, der einzige Verdünnung zu erreichen: 1) sichtbares Signal mit Cy5 bei Anregungswellenlänge 646 nm, 2) kein Signal mit Alexa 546 bei 532 nm Anregungswellenlänge. Auf diese Weise wird Alexa 546 Fluoreszenzsignal selektiv mit CD68-Expression assoziiert. Die optimale Verdünnung für die Anti-CD11b-und Anti-CD68-Antikörper können je nach der Art des Gewebes zu variieren und muss vor der Co-Markierungsprotokoll beginnen definiert werden. <ol><li> Zweimal waschen Gehirn Gefrierschnitte mit PBS. </li><li> Incubate Kryoschnitte für 5 min in PBS mit 1% H 2 O 2 (Schritt erforderlich, da die Fluoreszenzverstärkung benötigt Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin-HRP, siehe Schritt 1.12). </li><li> Wash Kryoabschnitte 2x mit PBS. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit 10% NGS und 0,3% Triton. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation bei 4 ° C über Nacht in PBS mit primären Ab Ratte anti-CD11b [1:30.000], 10% NGS und 0,3% Triton. </li><li> Wash 2x Gefrierschnitte (5 min) mit PBS. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit biotinylierten sekundären anti-Ratte Ab [1:200] und 1% NGS. </li><li> Wash Kryoabschnitte 2x mit PBS. </li><li> Mit TNT (0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20 Tris-HCl, NaCl, Tween) gewaschen Gefrierschnitten. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation für 1,5 h in TNB (Tris-HCl-NaCl-Blocking-Puffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% Blocking-Reagenz aus entsprechenden Kit (siehe Tabelle der Reagenzien)). </li><li> Wash KryoAbschnitte 3x mal mit TNT. </li><li> Inkubieren Gefrierschnitten in TNB enthält Streptavidin-HRP [1:100]. </li><li> Wash Kryoabschnitte 3x mit TNT. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation für 8 min in Amplification Diluent enthält Cyanine 5 Tyramid [1:300]. </li><li> Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit 10% NGS und 0,1% Triton. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation bei 4 ° C über Nacht in PBS mit primären Ab Ratte anti-CD68 [1:200], 3% NGS und 0,3% Triton. </li><li> Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS. </li><li> Gefrierschnitte Inkubation für 60 min in PBS mit fluorconjugated Sekundär Ab Alexa 546 anti-Rat [1:500] und 1% NGS. </li><li> Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS. </li><li> Gefrierschnitte inkubieren für 10 min in PBS mit Hoechst 1 ug / ml. </li><li> Wash Kryoabschnitte 3x mit PBS. </li><li> Montieren Gefrierschnitten in Prolong Gold. </li></ol> 2. Erwerb der dreidimensionale Bilder durch konfokale Mikroskopie <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Das hier verwendete Mikroskop war ein IX81-Mikroskop mit einem konfokalen Scaneinheit FV500 mit 3 Laserlinien ausgestattet: Ar-Kr (488 nm), He-Ne-rot (646nm) und He-Ne-Grün (532 nm) und eine UV-Diode ist. <ol><li> Aus den Anregungslaser in Abhängigkeit von den Wellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden (He-Ne rot für Cy5, CD11b, He-Ne-Grün für Alexa546, CD68 und UV-Diode für Hoechst, Kerne). </li><li> Wählen Sie die beste Kombination für dichroitischen Spiegel Lichtsignal-Sammlung. </li><li> Richten Sie die Bildauflösung auf mindestens 800 x 600 Pixel. </li><li> Identifizieren Sie einen Bereich von Interesse, indem Auflicht-Fluoreszenz und die schrittweise Erhöhung der Vergrößerung auf dem 40X-Objektiv. </li><li> Wechseln Sie in der Laser Scanning Mikroskopie (LSM) Modalität. </li><li> Führen repetitiven Scans, um die Photomultiplier (PMT) und die Verstärkung für jeden Kanal eingestellt werden. Laser können einzeln eingeschaltet, um die Einrichtung zu erleichtern. Halten Verstärkung so gering wie möglich, um unerwünschte nicht-spezifische Signale zu vermeiden. </li><li> Mit repebewerbs Scan läuft, bewegen Sie den Fokussteuerung, um untere und obere Extrem der z-Achse (z-Achse Gesamtlänge = 10 um) zu definieren. </li><li> Stoppen wiederholende Scan. </li><li> Definieren Sie die Schrittweite. Es sollte so nah wie möglich an die Pixelgröße (0,225 um), einen Standard 1:1 Größe-Verhältnis über die z-Achse zu erhalten. </li><li> Aktivieren Kalman-Filter mindestens 2 mal. </li><li> Aktivieren sequentiellen Scan-Modus zu bluten Durcheffekte zu vermeiden. </li><li> Gehen Sie auf halbem Weg entlang der z-Achse und führen Sie einen xy sequentiellen Scan. Überprüfen Sie die Einrichtung von PMT und Verstärkung (gutes Signal / Rausch-Verhältnis). Wenn nicht zufriedenstellend ist, wiederholen Sie Schritt 2.6. </li><li> Führen xyz Akquisition. </li><li> Exportieren von Daten als MultiTIFF Datei. Jeder MultiTIFF Datei enthält typischerweise 3 Farbkanäle (blau, grün und rot) und 44 Fokusebenen. </li></ol> 3. Dreidimensionale Ansicht der konfokale Akquisitionen und dreidimensionale Wiedergabe Galerie MultiTIFF Dateien Imaris Software und verarbeiten sie wie folgt: <ol><li>Offene Software. </li><li> Wählen Sie die Ansicht übertreffen. </li><li> Laden Sie die Datei MultiTIFF. </li><li> Wählen Sie die gewünschte Farbe für jeden Kanal. </li><li> Rauschen entfernen aus dem Hintergrund durch die Erhöhung der Mindestwert auf dem Display-Panel Einstellung. Stellen Sie jeden Kanal einzeln. </li><li> Gehen Sie auf die Schnittansicht. Bewegen sich entlang der z-Achse nach Co-Lokalisation (gelbe Pixel). </li><li> Klicken Sie auf eine gelbe Fläche, um zu sehen, ob die Co-Lokalisation entlang der z-Achse (dh gehört zu einem festen Objekt) vorhanden ist. Z-Achsen-Projektionen sind in der rechten und unteren Teil der Figur sichtbar ist. </li><li> Machen Sie einen Schnappschuss. </li><li> Gehen Sie auf Ansicht zu übertreffen. </li><li> Crop 3D, um eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen zu isolieren. </li><li> Wählen Sie einen Kanal auf der Displayanpassung Panel. </li><li> Wählen Sie die zu übertreffen / Oberflächen Algorithmus Builder. Algorithmusschritte: <ol><li> Wählen Sie Kanal. </li><li> Schwelle definieren (mit dem gleichen Mindestwert in ter angezeigt Anpassung Platte). </li><li> Definieren Sie Größenänderung. </li><li> Definieren Glättung (beste = 0,200). </li><li> Farbe definieren Aussehen. </li><li> End-Algorithmus. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.12 für jeden Kanal. </li><li> Deaktivieren Fluoreszenzkanäle auf dem Display-Panel Einstellung und wählen Sie alle drei Flächen. </li><li> Bewegen Sie die Lautstärke auf den besten Blick zu finden. </li><li> Machen Sie einen Schnappschuss. </li></ol>

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+in+stroke:+therapeutic+targets.">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li><li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma.">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li><li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment.">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373 (2007).</li><li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype.">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943 (2011).</li><li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages.">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li><li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury.">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir präsentieren hier Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept für Lokalisierung und Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker in den ischämischen Bereich (für eine detaillierte Analyse vgl. Rz 6) zu untersuchen. Dieses Verfahren vereint eine spezifische Färbung der entsprechenden Markierung der M / M-Aktivierung mit dreidimensionaler konfokaler Bildgebung. Die Feinabstimmung von Antikörpern, Serum und fluorconjugated Arbeits...

Nach einer akuten Hirnverletzung, sind Mikrogliazellen aktiviert und schnell unterziehen dramatische morphologische und phänotypische Veränderungen 3.1. Diese Eigen Antwort wird an die Einstellung von Blut geboren Makrophagen, die in das verletzte Gehirnparenchym 4,5 migrieren verbunden. Die Rolle der Mikroglia und Makrophagen, die antigen unterscheidbar sind nicht in Hirn-Trauma wird noch diskutiert (im Folgenden als M / M bezeichnet). Eine wachsende Zahl von Studien zeigen, dass, ähnlich wie bei peripheren Makrophagen beschrieben, Mikroglia und Gehirn rekrutiert Makrophagen können verschiedene Phänotypen, deren Extrema entsprechen klassischen proinflammatorischen toxisch (M1) oder entzündungshemmende Schutz (M2) Phänotyp annehmen. Die verschiedenen Aktivierungszustände, einschließlich Sekretion von pro-oder anti-entzündliche Faktoren werden Freisetzung von neurotrophen Moleküle und lysosomale Aktivität von einem bestimmten Muster der phänotypischen Marker, deren Expression ist abhängig von der zeitlichen gekennzeichnetEntwicklung der umliegenden Umgebung. Die Charakterisierung dieser M / M Phänotypen im verletzten Gehirn ist immer noch spärlich. Wir haben ein gut etabliertes Mausmodell der pMCAo bis M / M-Expression und Evolution nach Schlaganfall analysieren. Immunfluoreszenz-basierte Protokolle hier vorge zielen auf immer Einblick in den Auftritt von spezifischen M / M-Phänotyp-Marker, deren Lokalisierung und zellulären Co-Expression in den ischämischen Bereich. Wir untersuchten, ein paar Moleküle zu unterschiedlichen Aktivierungszustand oder Phänotyp assoziiert, nämlich CD11b, ein Oberflächenmarker von Leukozyten und einer weit verbreiteten Markierung von M / M Aktivierung / Recruitment 8.6 ausgedrückt, CD68 ein Marker für Lysosomen 6,7 und YM1 eine sekretorische Protein durch alternativ aktiviert (M2) Makrophagen exprimiert und zur Erholung und Wiederherstellung 9-10 Funktion verbunden. Wenn zwei Markierungen werden durch die gleiche Zelle, aber in unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten exprimiert wird, kann Kolokalisation allein nicht viel informative. In diesem Fall kann die Analyse durch Coexpression mit einzelnen Draufsicht und von dreidimensionalen Renderings durchgeführt werden. Wir beschreiben ein Protokoll, um eine gründliche dreidimensionale Analyse von Marker-Co-Expression zu erhalten.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD11b</td>
			<td>Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD68 </td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA 1957</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>1404</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td>
			<td>CHEMICON</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biotinilated Goat Anti-Rat antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-065-143</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TSA Cyanine 5 System </td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL705A001KT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Prolong Gold </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rat alexa 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11081</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti mouse Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vectors Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tritin X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat CM1850</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Olympus IX81 confocal microscope </td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AnalySIS software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaris software 5.0</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Photoshop cs2</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software packages GraphPad Prism version 4.0</td>
			<td>GraphPad Software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury

Nach Schlaganfall Mikroglia / Makrophagen (M / M) zu unterziehen schnelle Aktivierung mit dramatischen morphologischen und phänotypischen Veränderungen, die die Expression von neuen Oberflächenantigene und Produktion von Mediatoren, die aufbauen und pflegen die entzündliche Reaktion umfassen. Anzeichen dafür zeigt, dass M / M sind hochKunstStoffZellen, die klassischen pro-inflammatorische (M1) oder alternative anti-inflammatorische (M2)-Aktivierung nach akuter Hirnverletzung annehmen kann. Jedoch eine vollständige Charakterisierung von M / M Phänotyp Markerexpression, ihre Co-Lokalisation und zeitlichen Entwicklung im verletzten Gehirn fehlt noch. Immunfluoreszenz-Protokolle spezifische Färbung relevanten Marker der M / M-Aktivierung kann in der ischämischen Gehirn durchgeführt werden. Hier präsentieren wir Immunfluoreszenz-basierte Protokolle, gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse als ein leistungsfähiges Konzept, um das Muster der Lokalisierung und der Co-Expression von M / M-Phänotyp-Marker wie untersuchenCD11b, CD68, YM1, im Mausmodell der fokalen Ischämie durch permanente Okklusion der mittleren Hirnarterie (pMCAO) induziert. Zweidimensionalen Analyse des verschmutzten Bereich zeigt, dass jede Markierung zu einem definierten M / M Morphologie zugeordnet wird und eine bestimmte Lokalisierung in der ischämischen Läsion. Muster der M / M-Phänotyp-Marker co-Expression kann durch dreidimensionale konfokale Bildgebung in den ischämischen Bereich zu beurteilen. Bilder können über einen definierten Volumen erfasst werden (10 um z-Achse und einer Schrittweite von 0,23 &amp;mgr; m, was einer 180 x 135 x 10 um das Volumen) mit einer sequentiellen Abtastmodus um Durchbluten Effekte zu minimieren und überlappenden Wellenlängen zu vermeiden. Bilder werden dann verarbeitet, um dreidimensionale Darstellungen mittels Imaris Software zu erhalten. Festansicht des dreidimensionalen Renderings erlaubt die Definition von Markerexpression in Zellhaufen. Wir zeigen, daß M / M haben die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Phänotypen differenzieren, abhängig von der Position in der Läsion und timich nach der Verletzung.

Ein Beispiel der erhalten wird, wenn die Kennzeichnung Protokolle und konfokalen Nahmen sind in den ischämischen Bereich durch Ergebnisse ist in den 1A und 1B dargestellt. Eine zweidimensionale Ansicht der aufgenommenen Bilder zeigt, dass 24 Stunden nach der Ischämie (A), der lysosomalen Marker CD68 (grün) in hypertrophen amöboider CD11b-Zellen (rot) in der ischämischen Kern vorhanden ausgedrückt. In der Grenzzone (B) CD11b-positiven Zellen anzuze...

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Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Ein Weg, um neue Einblicke in die Komplexität des Gehirns Entzündungsreaktion gewinnen wird vorgestellt. Wir beschreiben Immunfluoreszenz-basierte Protokolle gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse, um die Muster der Co-Expression von Mikroglia / Makrophagen-Phänotyp-Marker in einem Mausmodell der fokalen Ischämie zu untersuchen.

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.5K Aufrufe.  IRCCS - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri.  Ein Weg, um neue Einblicke in die Komplexität des Gehirns Entzündungsreaktion gewinnen wird vorgestellt. Wir beschreiben Immunfluoreszenz-basierte Protokolle gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse, um die Muster der Co-Expression von Mikroglia / Makrophagen-Phänotyp-Marker in einem Mausmodell der fokalen Ischämie zu untersuchen. 

Serie: Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Forschung

Neurowissenschaften

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Automatisierte Ganganalyse bei Mäusen mit chronischen Verengung Verletzungen

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Chronische Implantation des gesamten kortikalen Electrocorticographic Arrays in der Weißbüschelaffe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Dreidimensionale Formmodellierung und Analyse von Gehirnstrukturen

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Elektromagnetisch gesteuertes Closed-Head-Modell für leichtes Schädel-Hirn-Trauma bei Mäusen

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...