אנו מכירים Juliann Jaumotte לרעיון של שמירה על הכרכים של חומרים כימיים בassay-ATP. אנחנו אסירי תודה לתמיכה ניהולית המעולה של מרי קארוזו, דב ווילסון וג&#39;קי Farrer ולבית הספר לרוקחות Mylan למתן תמיכה כספית למחקרים אלו. תודה גם למחלות Hunkele המפחיד הקרן ופרקינסון והפרעות תנועת קרן לתמיכה הכספית שלהם מהמחקרים עצביים העיקריים.

אף אחד מהמחברים יש התנגשויות לחשוף.

מצאנו כי עוצמת אות בכל שלושת מבחני הכדאיות היא ליניארי ומתואם עם צפיפות ציפוי. עם זאת, לא כל מבחני הם לא פחות רגישים לפי 2 או שינויים 1.5 פי בצפיפות ציפוי. לתאי N2a, מבחני אינפרא אדום רגישים פחות assay-ATP, במיוחד בצפיפויות ציפוי נמוכות יותר. למרות שמבחני אינפרא אדום רגישים פחות מאשר ה-ATP, מבחני DRAQ5 + ספיר ומבחני α-טובולין הם בהסכם טוב בכך שהם חושפים את ההשפעה המגנה ביותר של N-אצטיל ציסטאין. היה ירידה במינון תגובה של אות אינפרא אדום עם שני מבחני וכל שלוש עקומות הכדאיות הוזזו לימין עם N-אצטיל ציסטאין. חפיפה זו לא תמיד נצפתה עבור כל סוגי טיפולים של תאי N2a, כפי שנראים מבחני α-טובולין ו-ATP להיות יותר רגיש לתרכובות כגון אמוניום כלוריד מ DRAQ5 + assay ספיר (ראה איור 4 בUnnithan et al. 8 ). לפיכך, phenotyp כדאיותes לא תמיד מיוצג באופן שווה על ידי כל שלושת מבחני. למרות assay ATP היה בפרופורציה טובה יותר למספר של תאי N2a מצופים מ α-טובולין וDRAQ5 + מבחני ספיר, בהנחה שעוצמת האות משקפת מספרים סלולריים לא תמיד נפגש לאחר טיפול הרעלן. רמות ה-ATP עלו בריכוזים רעלן שלא לעורר עלייה דומה באות במבחני אינפרא אדום. נתונים אלה מראים שינויים מטבוליים מפצים בתאי N2a בתגובה לעיכוב הפרוטאזום ושימושיים בזכות עצמם. עקומת מנת התגובה בצורת U-ATP היא אופיינית לתופעה הנקראת hormesis. Hormesis מוגדר כתגובות ביולוגיות חיוביות לחשיפה ברמה הנמוכה לרעלים וגורמי לחץ אחרים 40-42. לתאי עצב, DRAQ5 + כתם ספיר היה רגיש פחות MAP2 ומבחני ה-ATP בצפיפויות ציפוי גבוהות. עם זאת, DRAQ5 + ספיר, MAP2, ומבחני ה-ATP היו גם באופן יחסי לceמספר ll בנוירונים בקליפת המוח העיקרי בבית או מתחת 100k תאים לכל טוב. אנו צלחת הנוירונים ב100k תאים לכל טוב. נוירונים מקליפת המוח אינם ידועים לשכפל, ולכן, היינו מודאגים יותר ליניאריות ב100k או נמוך צפיפות ציפוי. DRAQ5 + assay ספיר היה פחות רגיש להבדלים בין קליפת המוח וallocortex מאשר כל אחד MAP2 או ה-ATP בריכוזים מתחת 50 H 2 O 2 מיקרומטר. יתר על כן, רמות ה-ATP לא נפלו באופן דרמטי על H 2 O 2 טיפול כאות אינפרא אדום בשני מבחני האחרים, מה שמרמז אולי שוב עליות מפצות בפלט ה-ATP. הפערים בין שלושה מבחני בתאי N2a ונוירונים עיקרי עשויים לשקף כי תפקודים תאיים יכולים לשנות לפני מבנים אנטומיים גולמי מושפעים, וכי מבני תא, כוללים חלבוני cytoskeletal, יכולים להיות מושפעים הרבה לפני שהתאים עצמם הולכים לאיבוד. נתונים אחרונים במבחני כדאיות זמנית על ידי גילברט ועמיתיו בצורה משכנעתלהמחיש כי צעדי כדאיות שונים כגון צביעה גרעינית Hoechst ומדידות ATP להניב מידע על מאפיינים תאיים ספציפיים שרק באופן חלקי ובאופן עקיף משקפים כדאיות בכללות 26. לכן אנו ממליצים לבצע את כל שלושת מבחני בו זמנית ולא להסתמך על assay יחיד לכדאיות טבולי פרסומים כפי שעושים רבים. לקבלת מידע נוסף על כל אחד מהאמצעים אלה, אנו ממליצים ספירת תאים בודדים ולאחר מכן הערכת ביטוי חלבון cytoskeletal ורמות ה-ATP כפונקציה של מספר תא. אמנם יש מבחני אחרים לכדאיות חילוף חומרים, כגון MTT, היתרון של assay ATP טמון ברגישות שלו וטווח דינמי. Assay MTT יכול להעריך את מספר תאי קיימא בהשוואה למדידות ה-ATP ותערוכות IC 50 שהוא פי שתיים גבוה יותר 43. יתר על כן, פטי ועמיתים דיווחו כי assay ATP יכוללזהות את הגבול התחתון של 1563 תאים לכל טוב ואילו assay MTT לא יכל לזהות פחות מ 25k תאים / היטב 12. יחס אות לרעש (אות מבארות עם תאי חיים מול בארות ללא תאים) הוא רק 7 לMTT אבל 230 עבור ה-ATP 44. יתרון נוסף של מבחני ה-ATP זורח מעל MTT הוא שזמן הדגירה הוא הרבה יותר קצר. בנוסף, assay MTT מPromega עולה 0.28 ¢ לכל טוב ואילו תא assay כייל Glo מאותו היצרן עולה 0.09 ¢ לכל טוב בדילולים המומלץ שלנו. עם זאת, יש מגבלות לכל מבחני חילוף החומרים; פעילות המטבולית יכולה להיות מנותקת מהישרדות, במיוחד בנימק. אם זה חשש, מבחני בדו&quot;ח הנוכחי ניתן לשלב עם מדידות של שחרור לקטט דהידרוגנז לברר אובדן שלמות הממברנה. זה לא יגרום לשום צלחות נוספות, כמו מדידות לקטט דהידרוגנז פשוט עשו במדיום תאי. למרות שאנו מציגים מבחני אלה כחלופות לספירה ידנית על המיקרוסקופ, האחרון יכול להיות אמצעי רגיש ומדויק מאוד של מספר תא דגימה אם נערך כראוי. ואכן, אנו צופים כי סעיפים של גרעינים צבעוניים Hoechst יהיו רגישים יותר לשינויים קטנים במספר תא N2a מ DRAQ5 + assay ספיר. כאשר כל מבחני נכשלים במבחן ליניאריות, ספירה ידנית הן חיוניות. דוגמא טובה לכך היא המודל שלנו בתרבית הראשונית astrocyte, שבו אנו מבצעים את הוראות מייגע יותר סופרים 45. עם זאת, ההטיות הטבועות של ספירה ידנית חייבים לזכור בעת פירוש נתוני ספירת תאים, בדיוק כמו הפגמים הטבועים של מבחני ממוחשבים לא חייבים להיות מוברשות בצד. מספר היתרונות והחסרונות של מבחני כדאיות לכן הם יתוארו להלן. ראשית, אם כתמי DAPI או Hoechst מועסקים, גרעינים מצומקים ומהווים לעתים קרובות כאזוראפופטוטיים 1. עם זאת, גודל תא ועיבוי של גרעינים לשקר לאורך רצף חלק. לעומת זאת, חיים ומוות הם תופעות סותרות, בינארי. אלא אם כן שתי קבוצות מאוד מובחנות של תאי חיים או מתים הם נצפו, נראה הטובים ביותר כדי לספור את כל התאים מתחת לקוטר גרעין סף אפופטוטיים כמו עם תוכנת הדמיה כגון MetaMorph או ImageJ ולא על ידי העין. כמובן, בחירת קוטר סף היא שרירותית, כי אנחנו לא יודעים באיזה שלב מפל אפופטוטיים בלתי הפיך הוא יזמה. יתר על כן, על פי הגדרתו, גם תאים עם caspase הופעל 3 הם לא בהכרח בדרך למוות וצריכים אולי להיות נחשב עדיין בחיים בעת הקיבוע 46. מבחני אינפרא אדום שלנו למנוע חששות אלה על ידי טיפול בכל התאים המחוברים לצלחת בעת הקיבוע כעדיין לחיות. רק תאים שרחפו משם נספרים כמת. זה מציב את תאים לתוך אחד משתי קטגוריות נפרדות ונמנע מהמלכודות של שימוש בשיתוףmplex, פונקציה רציפה כמו קוטר גרעיני. שנית, ספירה ידנית בדרך כלל לטעום חלק קטן מכל טוב. זה יכול להוביל להטית דגימה, ולעתים, שגיאות ברמה גבוהה של הממוצע. עם מבחני הכדאיות שלנו, כולו גם ידגם עבור ה-ATP וקרוב לכל גם ידגם עם מבחני אינפרא אדום. דפוס דגימה זו מגדיל את גודל מדגם וימנע את ההחלטה לפעמים השרירותית של איפה בבאר כדי לצלם לספירה ידנית. אם תמונות נלקחות מהמרכז כן, יש לזכור כי אזור זה הוא מקום שבי את לשטוף-רוב התאים מתרחש, מה שמוביל למגזים בהערכת פוטנציאל של רעילות. לעומת זאת, מבחני אינפרא אדום לזרוק רשת על גבי התמונה של צלחת 96 היטב שרק אינה כוללת את הפינות הקיצוניות של הבארות. אם כך רצוי, פינות הבארות יכולות להיכלל על ידי הגדלת הקוטר של החוגים ברשת. שלישית, הצלם ודלפק התא צריך גם להיות עיוור בספירה ידנית. עם זאת, ברגע שהם תאים שטופלו עם רעלים, הם מניחים לעתים קרובות שינויים מורפולוגיים כי הם די ברורים גם לעין בלתי מנוסה. זה הופך את זה הרבה יותר מאתגר להישאר בלתי משוחד. עיוורון הוא לא דרישה למבחנים שלנו. הרביעית, ספירה ידנית גוזל זמן ותעלה החוקר הראשי יותר במשכורת. משכורות הן אחת העלויות הגבוהות ביותר של מחקר. זמן הסריקה לצלחת אחת באודיסיאה הוא רק 8 דקות ארוכות על &quot;האיכות בינונית&quot; הגדרה וניתן להוריד עוד יותר על ההגדרה &quot;באיכות נמוכה&quot;. יש לציין כי Imager אודיסיאה הוא יקר, גם כאשר אחד קונה גרסת הדגמה משומשת, אבל זה עלות קבועה חד פעמית. מצד השני, אחד יש גם להשקיע במיקרוסקופי epifluorescence יקרים יחסית לספירת תאים ידנית של DAPI או Hoechst צבעוני גרעינים. למרות העלות הראשונית, Imager אודיסיאה הוא מכונה רב תכליתי שמודד גם immunoblots המערבי באופן כמותי 47,48. יש לנו להתאים שימוש באודיסיאה לquantifications של immunostaining במבנים מוחיים מקרוסקופיים כגון חולדה או סטריאטום עכבר או telencephalic קליפת המוח. גישה זו שימשה גם על ידי אחרים 49. חולשה אחת של Imager אודיסיאה להדמית רקמות היא שהרזולוציה הגבוהה ביותר היא רק 21 מיקרומטר. לכן זה לא יכול לספור תאים בודדים ולא נועד כדי להמחיש פרטים עדינים אנטומיים. לבסוף, מבחני אינפרא אדום לא יכולים להיות רגישים כמו לשינויים קטנים במספר תא כספירה ידנית. IC 50 ערכים ולכן לא יכולים להיחשב כמראים את הריכוז שמעורר אובדן דווקא 50% ממספרים סלולריים, אבל רק כריכוז שמעורר אובדן 50% מאות אינפרא אדום. אזהרה זו כנראה חלה עלכל מבחני הכדאיות כי לעקוף ספירת תאים בודדת על ידי מיקרוסקופ ולדגום את כולו גם בבת אחת. חוסר הדיוק הקשורים למבחנים כאלה עשוי להיות פונקציה של היפרטרופיה, ניוון, או שינויים אחרים במראה המשפיעים על עוצמת אות. לדוגמא, עם כמה רעלים, α-טובולין immunoreactivity בכל תא עשוי לעלות כפונקציה של רעילות. יש לנו בתופעה זו, בתאים שטופלו בN2a ריכוזים גבוהים מאוד של MG132 8. אם זה של דאגה, חלבונים אחרים cytoskeletal סמן, כגון β-אקטין או GAPDH ניתן להשתמש. יתר על כן, הדגיש תאי N2a נוטים ליצור תהליכים דו קוטביים 8,50,51. עם שינויים בגודל תא, פלט אות ניאון לכל תא יהיה גם שונה בכל קבוצות טיפול. אנו ממליצים כי תאים שטופלו ברעלן ייבחנו על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה הסטנדרטי הבאה immunocytochemistry עבור אותו סמנים כפי שהוא משמש ב- Cell המערבי. אם הציטופלסמה משנה באופן משמעותי בגודלם על טיפול, אךגרעין לא, אנו ממליצים להשתמש בכתם DRAQ5 בלי ספיר לכמת גרעינים בלבד. מחקרים עתידיים עם צבעים שונים ועם חלבונים בשפע cytoskeletal או אחרים אחרים הם ערובה כדי להתגבר על המכשולים הללו. אנו מסיקים כי כל מבחני סובלים מאזהרות והעלו חששות לגבי רגישות, ליניאריות, טעות דגימה, יחס אות לרעש, הטיה או הסובייקטיביות אנושית, זמן ועלות. יתר על כן, כל מבחני מסתמכים על הנחות שלא תמיד מתקיימות. לכן, אנו ממליצים להשתמש לפחות בשני מבחני כדי לתאר את ההשפעות של טיפול בתרביות תאים, אחד המודד את בריאות חילוף חומרים ואחד שמסתמך על יכולת קיום אנטומי. בדרך זו, ניתן באופן יעיל יותר לבדוק אם תרכובות טיפוליות להגן הן על מבנה ותפקוד.

Assay הכדאיות הנפוץ ביותר במדעים הביולוגיים כרוך בספירת תאים. עדות לכך הוא על ידי ניתוח של 200 הפרסומים (האחרונים) העליונים שהופיעו בPubMed עם אחת ממילות המפתח &quot;במבחנה&quot; או &quot;תרבות&quot; ב2013/04/29 ו2013/4/30. פרסומים אלה, מבחני 23.5% משמשים ספירת תאים, כוללים ספירת מספר תאים ידנית, מספר תאים אוטומטי סופרים עם תוכנת הדמיה, והדרה כחולה Trypan. Assay חי / המלח שימש ב1% מפרסומים אלה. מספר הפרסומים באמצעות MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay לכדאיות טבולים היה 11%. סקר זה של הספרות גם מראה כי מספר הפרסומים באמצעות מבחני כגון MTT בשיתוף עם מבחני ספירת תאים היה רק ​​.3.5%. למרות המגמה להשתמש assay כדאיות אחד בפני עצמו, הערכת תפקוד תאי בשילוב עם מספר תא נראית הבחירה הטובה ביותר להערכתי סלולריתntegrity. ספירת תאים על ידי עצמם אינן מספיקות, כי התאים שנותרו לא יכולים להיות פונקציונליים או בריאים, למרות שהם נמצאים בבאר 1,2. לעומת זאת, אמצעי פונקציונלי, כגון ATP עשוי להגדיל או להקטין בהיעדר שינויים מקבילים במספר התאים. שחרר את הסוגר של צגי בקרת חילוף חומרים ממספר התא עולה כי אף פעם לא צריכים לשמש מבחני ה-ATP וMTT כassay הכדאיות הבלעדי. בדו&quot;ח הנוכחי, שלושה מבחני כדאיות שיסקרו שני מבנים תאיים ותפקוד מטבולים מתוארים, לתמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בפני עצמו יכול להרשות לעצמו. שניים מהמבחנים שלנו דורשים תרמי אינפרא אדום שמודדת הקרינה ב700 ו800 ערוצי ננומטר. רעש הוא נמוך באורכי הגל אינפרא אדום, מה שמוביל ליחסי אות לרעש גבוהים יותר 3. תרמי אודיסיאה שאנחנו משתמשים יש טווח דינמי 4.5 יומן וקצת מעמיקה של 16, translatinגרם ל2 16 או 65,536 גוונים של אינפרא אדום. זה יכול להיות בניגוד להדמיה בצבע של 8 ביט, אשר רק מאפשרת 2 8 או 256 גוונים של צבע לכל אורך גל. לפיכך, יש הדמיה 16 סיביות רזולוציה עדינה. יש לציין שהתמונות אינפרא אדומות המקוריות לעתים קרובות pseudocolored ירוק (800 ננומטר) ואדום (700 ננומטר) בדוחות שפורסמו למצגת. הדמית אודיסיאה משמשות בדרך כלל גם למערבי סופג ובתוך תא המערבונים 4-7. ב- Cell מערבונים על תאים קבוע פורמלדהיד להשתמש נוגדנים ראשוניים כנגד כל חלבון של עניין ולתייג אותם בתורו עם נוגדנים משני ניאון אינפרא אדום. טכניקה זו ידועה להיות שימושי במיוחד עבור נקודות קצה זירחון 6. ב- Cell המערבונים שלנו, אנחנו להכתים תאים קבועים לחלבוני cytoskeletal α-טובולין או microtubule העצבי החלבון קשור 2 (MAP2) בערוץ 800 ננומטר. חלבונים אלה נמצאים בשפע מספיק כדי להניב יחס אות לרעש גבוה. אנחנו גם להכתים הצלחות שלנו ב700ערוץ ננומטר לגרעינים עם כתם DRAQ5 ולציטופלסמה עם כתם ספיר. שני חלבוני cytoskeletal וDRAQ5 + כתמי ספיר ובכך משקפים את המבנים הסלולר. Assay הכדאיות השלישי מודד תפקוד מטבולים והוא נקרא &quot;תא כייל Glo&quot;. ב assay מבוסס לוציפראז זה, ערכי הארה הם ביחס ישירים לרמות ה-ATP. מבחני ה-ATP משמשים בדרך כלל כדי לכמת תאי קיימא 8-12. עם זאת, כולל את המילה &quot;כייל&quot; בשמו של assay הוא קצת מטעה, כי פלט ה-ATP לכל תא יכול להשתנות כפונקציה של טיפולי רעל ולכן הוא לא תמיד באופן יחסי לתא מספר 8. יכולות גם להיות מושפעות רמות ה-ATP על ידי מקצבי היממה 13 ועל ידי חלוקת תא ותא 14 בידול 15. אף על פי כן, assay-ATP שמוצג כאן הוא פשוט לביצוע ושימושי כי ה-ATP הוא מדד חזק של חילוף חומריםכדאיות 16-21, אם לא מספר סלולרי כשלעצמה. שימוש assay זה כדי להשלים את האינפרא אדום ב- Cell מערבונים לכן מניב תמונה מקיפה יותר של יושרה סלולרית מכל assay אחד בלבד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Cell Titer Glo</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:93px;">G7572</td>
			<td style="width:507px;">Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 &#176;C for at least 21 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">18% Formalin</td>
			<td style="width:112px;">Thermo-Shandon</td>
			<td style="width:93px;">9990244</td>
			<td style="width:507px;">Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sucrose</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S0389</td>
			<td style="width:507px;">It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Odyssey Block</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">927-40003</td>
			<td style="width:507px;">This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 &#176;C for long term use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">21568</td>
			<td style="width:507px;">We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S468</td>
			<td style="width:507px;">One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:93px;">S373</td>
			<td style="width:507px;">See above</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sodium Azide (250x)</td>
			<td style="width:112px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:93px;">7144.8-16</td>
			<td style="width:507px;">Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 &#176;C until they become contaminated with debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">T5168</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Mouse anti-MAP2</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">M9942</td>
			<td style="width:507px;">This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">800 nm Goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">926-32210</td>
			<td style="width:507px;">Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">DRAQ5</td>
			<td style="width:112px;">Biostatus</td>
			<td style="width:93px;">DR50200</td>
			<td style="width:507px;">This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:109px;">Sapphire</td>
			<td style="width:112px;">LI-COR</td>
			<td style="width:93px;">928-40022</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Luminometer</td>
			<td style="width:129px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:189px;">VICTOR3 1420 multilabel counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Odyssey Imager</td>
			<td style="width:129px;">LI-COR</td>
			<td style="width:189px;">9201-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:196px;">Shaker/Mixer</td>
			<td style="width:129px;">Research Products International</td>
			<td style="width:189px;">248555</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability assays for cells in culture

ספירת תאים ידנית על מיקרוסקופ הם אמצעי רגיש להערכת כדאיות סלולרית אבל הם גוזלים זמן ולכן יקר. מבחני כדאיות ממוחשבים הם יקרים במונחים של ציוד, אבל יכולים להיות מהיר יותר ואובייקטיבי יותר מספירת תאים ידנית. הדו&quot;ח הנוכחי מתאר את השימוש בשלושה מבחני כדאיות כזה. שניים ממבחנים אלה הם אינפרא אדום ואחד הוא זורח. שני מבחני אינפרא אדום להסתמך על Imager אודיסיאה 16 קצת. assay אינפרא אדום אחת משתמש כתם DRAQ5 לגרעינים בשילוב עם כתם ספיר לcytosol והיא דמיינו בערוץ 700 ננומטר. Assay אינפרא אדום האחר, ב- Cell מערבי, משתמש בנוגדנים כנגד חלבוני cytoskeletal (החלבון קשור α-טובולין או microtubule 2) ומתייג אותם בערוץ 800 ננומטר. Assay הכדאיות השלישי הוא assay זורח נפוץ עבור ה-ATP, אבל אנחנו משתמשים ברבע מהנפח המומלץ לחסוך בעלויות. מדידות אלה הן כל ליניארי ולתאם עם מספר ceLLS מצופה, אבל להשתנות ברגישות. כל שלושה מבחני לעקוף מיקרוסקופיה זמן רב ולדגום את כולו היטב, ובכך להפחית טעות דגימה. לבסוף, כל מבחני יכולים בקלות להסתיים בתוך יום אחד של סוף הניסוי, המאפשר למספר גדול יותר של ניסויים להתבצע בתוך פרקים זמן קצרים. עם זאת, כולם מסתמכים על ההנחה שמספרי תאים להישאר בפרופורציה לעוצמת אות לאחר טיפולים, מתוך הנחה שהוא לפעמים לא פגש, במיוחד עבור ה-ATP הסלולרית. יתר על כן, אם תאי גידול או קיטון בגודל לאחר טיפול, זה עשוי להשפיע על עוצמת אות מבלי להשפיע על מספר תא. אנו מסיקים כי כל מבחני הכדאיות, כוללים ספירה ידנית, סובלים ממספר האזהרות, אבל שמבחני הכדאיות ממוחשבים הם שווים את ההשקעה הראשונית. שימוש בכל שלושת מבחני יחד מניב תצוגה מקיפה של מבנה ותפקוד תאיים.

Watch this Scientific Journal Video about Viability Assays for Cells in Culture at JoVE.com

Viability Assays for Cells in Culture

תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מבנה ותפקוד באופן אובייקטיבי.

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

46.0K Views.  Duquesne University.  תרכובות טיפוליות לעתים קרובות נבחנות ראשון במבחנה עם מבחני כדאיות. ספירת תאים עיוורת על ידי צופה אנושי יכולה להיות רגישה מאוד לשינויים קטנים במספר תאים, אבל לא להעריך את התפקוד. מבחני כדאיות ממוחשבים, כפי שמתואר כאן, יכולים להעריך גם מ...

Video: Viability Assays for Cells in Culture

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...