העבודה נתמכה על ידי הפרס פיתוח מדען הקליני K08NS002083-NIH, גרנט Shervert פרייזר מכון המחקר, ופרס לחוקר צעיר NARSAD לאדגר א Büttner.

1. דיליי / הקטלני Assay התפתחותית: סוג Wild-(N2) ושני הזנים מוטנטים (Mut1 וMut2) נבדקים בריכוזי Clozapine שלושה בפלייט 12 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , ביום 1 לשפוך 2 מיליליטר NGM בינוני 10 לבאר כל צלחת 12 היטב (גם כל אחד בקוטר 2 סנטימטר) ולאפשר להקשות על הספסל בטמפרטורת חדר (RT) למשך לילה. באותו היום, לקחת מושבה של חיידקי OP50 Escherichia coli, להדביק בקבוק 50 פתרון מיליליטר LB, ותרבותה שייקרה 37 מעלות צלזיוס ב220 סיבוב סל&quot;ד לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, להעביר 20 תרבות חיידקי OP50 μl על מרכזו של כל NGM היטב. דגירה הצלחות בחממה 37 מעלות צלזיוס או להשאיר אותם על RT לילה כדי לאפשר את דשא החיידקים לגדול עבה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן פתרון מניות קלוזאפין 80 מ&quot;מ על ידי המסת קלוזאפין בDMSO (sulfoxide דימתיל) ממס. ואז להפוך את הפתרון עובד 80 μl עם פתרון המניות בדילול מלא ב1.7 מ&quot;מ ב חומצה אצטיתased בטבלה 1. הערה: הפתרון עובד לתרופה מסוימת של ריבית צריך להיקבע על ידי ביצוע סדרה של בדיקות ריכוז ראשוניות כדי למצוא את הריכוז המתאים ביותר להבחנה מהסוג בר מהמוטציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה 80 μl קלוזאפין עובדת פתרון לצלחת NGM seeded היטב ולערבל את הצלחת על מנת לאפשר הפתרון לחלק באופן שווה על פני השטח. חכה לצלחת לייבוש. השתמש בצלחת עבור assay באותו היום או למקם אותו בחממה 20 מעלות צלזיוס לשימוש ביום שלמחרת. הערה: הפתרון עובד הוא השעיית סמים בשל המסיסות הנמוכה של קלוזאפין, במיוחד בריכוז גבוה יותר. לכן, מערבולת הצינור לפני העברת הפתרון לצלחת התרופה על מנת להבטיח כי ריכוז התרופה הוא מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תולעים את צלחת 3.5 סנטימטר המכילה רבים מבוגרים הרה להולדת עם חיץ M9 ואז לסובב אותם בצינור 15 מיליליטרב2,000 סל&quot;ד דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. הוסף 5 מיליליטר פתרון אקונומיקה (NaOH: היפוכלוריט: 2 DDH O ב4:01:05) ולשבש את נמטודות בעדינות על ידי היפוך הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לבעלי החיים עד שהחצי מהם הם מומסים בסביבות 5 דקות. ספין למטה הביצים על 2,000 סל&quot;ד דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהוסיף 14 מיליליטר חיץ M9 במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה הביצים על 2,000 סל&quot;ד דקות 1 ולשאוב supernatant, עוזב כ 100 פתרון μl. ורטקס להשעות את הביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ביצי μl העברה תלויות בM9 על צלחת NGM קבועה כדי לבדוק כמה ביצים מועברים. כוון את עוצמת הקול של הביצים הושעו על מנת להבטיח כי ישנם כ 30-35 ביצים בכל העברה. העבר 30-35 ביצים היטב בכל צלחת assay, ואז דגירה בחממה 20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון של assay, ציון את מספר הביצים בקעו. התאם את המספר הכולל של בעלי חיים שבקעו ל25/well ידי picking את התולעים נוספים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בימים שלאחר מכן, לבחון את בעלי החיים ואת ציונם בכל שעה 24. שלב התפתחותי הוא הבקיע בהתבסס על גודלו של בעל החיים ואת הצורה של 11 הפות. הניסוי נמשך 5-6 ימים עם האפקט חזק ביותר שנראה בדרך כלל ביום השלישי או רביעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט את הנתונים לקובץ Excel ולחשב את האחוז של בעלי חיים בכל שלב התפתחותי, לכל יום של הניסוי. ליצור גרפים עם הפונקציה &#39;100% Stacked טור &#39;בעמודת &#39;2-D&#39; התפריט. </li></ol> 2. Assay שאיבת בלוע: בעלי חיים מבוגרים צעירים לWild-type וזנים מוטנטים האם קלעו על צלחות Clozapine Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת assay נעשתה בעקבות אותו הפרוטוקול המשמש עבור assay עיכוב / הקטלניות התפתחותית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 50 חיות L4 עבור כל זן לצלחות NGM seeded 24 שעות לפני assay דגירה התולעים ב20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 10 חיות לאסאy צלחת היטב. לאחר מכן לבחור 10 בעלי חיים ולכל דקות 15-20 הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי בעלי החיים בבאר הראשונה שנחשפו לתרופה ל30 דקות, להתחיל assay על ידי התבוננות שאיבת בלוע תחת מיקרוסקופ לנתיחה ואת ציון המשאבות ל20 שניות 9. פעם אחת שאיבת בלוע הוא הבקיע, להרים את התולעת מהצלחת. </li></ol>

<ol>
	<li>Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+adaptation+in+C.+elegans+produced+by+antipsychotic+drugs+requires+serotonin+and+is+associated+with+calcium+signaling+and+calcineurin+inhibition.">Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition.</a> Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clozapine+interaction+with+phosphatidyl+inositol+3-kinase+(PI3K)/insulin-signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).</li><li>Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+Caenorhabditis+elegans+genetics+for+understanding+human+psychiatric+disease.">The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease.</a> Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).</li><li>Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antipsychotic+drugs+disrupt+normal+development+in+Caenorhabditis+elegans+via+additional+mechanisms+besides+dopamine+and+serotonin+receptors.">Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors.</a> Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).</li><li>Karmacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+effects+of+clozapine:+involvement+of+trace+amine+pathways+in+C.+elegans+and+M.+musculus.">Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus.</a> Brain Res. 1393, 91-99 (2011).</li><li>Saur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans+Identifies+the+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Subunit+ACR-7+as+an+Antipsychotic+Drug+Target.">A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target.</a> PLoS Genet. 9, (2013).</li><li>Avery, L., You, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. 47, (2011).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).</li><li>Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans.">Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).</li><li>Kage-Nakadai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+very+long+chain+fatty+acid+acyl-CoA+synthetase+genes,+acs-20+and+acs-22,+have+roles+in+the+cuticle+surface+barrier+in+Caenorhabditis+elegans.">Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis.">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין סכסוך העניין המעורב.

כאן אנו מתארים שיטות לבדיקת ההשפעות של APDs על ההתפתחות וההתנהגות של ג elegans. DMSO או אתנול משמש כדי לפזר קלוזאפין, שכן התרופה היא יחסית בלתי מסיס במים. מכיוון שכבר דיווחו ממסים להשפיע ג הביולוגיה elegans 12, DMSO-לבד או בקבוצות שליטת אתנול לבד הן חיוניות. הריכ...

elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם גנטי פשוט נוח למסכים בקנה מידה גדולה קדימה לאחור גנטיים והמסכים גנטיים כימיים. ג elegans הוא רגיש לספקטרום רחב של תרכובות ביו ולכן שמש בהצלחה להגדיר את מנגנוני פעולה של מגוון רחב של תרכובות מסוג זה. לדוגמא, תרכובות ביו למדו באמצעות פרמקוגנטיקה התולעת כוללת אגוניסטים קולטן האצטילכולין (למשל levamisole, ניקוטין, morantel, וpyrantel), חומרי הרדמה (למשל halothane), קפאין, חוסמי כולינסטרז (למשל aldicarb, lannate, וtrichlorfon), פלואוריד, GABA-קשורים תרכובות (למשל GABA וmuscimol), ivermectin, Paraquat, אסטרים phorbol, ותרופות הקשורים לסרוטונין (למשל סרוטונין וimiprimine) 3. יתר על כן, ג elegans שמש במשך מסכי מולקולה קטנה בקנה מידה גדולה, המאפשר גילוי של מתחם ביו חדשים וזיהוי של מטרות גנטיות רומן 4. ג הגנום elegans כולל תרופה פוטנציאלית אנטיפסיכוטיות (APD) מטרות נשמרים בבני אדם, ובם גנים המקודדים חלבונים דרושים לסינתזת נוירוטרנסמיטר ולמבנה ותפקוד 5 הסינפטי. לכן, ג elegans Neurogenetics והצעת נוירוביולוגיה שיטות לגילוי מנגנונים מולקולריים רומן של פעולה של APDs. בנמטודות, חשיפת APD מוקדם בהתפתחות מייצרת עיכוב התפתחותי, ובריכוזים גבוהים יותר, קטלני 2,6. חשיפת APD במהלך הבגרות מייצרת פנוטיפים התנהגותיים. לדוגמא, חשיפת קלוזאפין מעכבת תנועה ושאיבת בלוע ומשפרת את הטלת ביצים 1,2,7. עיכוב התפתחותי מושרה APD וקטלני הם פנוטיפים רבי עוצמה למסכים גנטיים כימיים בקנה מידה גדולה. פנוטיפים אלה הם מורכבים במידה שסבירה להניח שיש להם בשיא יותר מפעם אחת תאי והגנטיs. לכן, מסכי גנטיים כגון צפויים להניב מגוון רחב של מטרות תרופה עקיפות. עם זאת, המעבדה שלנו ביצעה מסכי גן מועמד ומסך RNAi הגנום למדכאים של עיכוב התפתחותי מושרה APD והקטלניות והתאוששה בהצלחה גנים אשר צפוי לקודד יעדים ישירים, ובם דופאמין, אינסולין, וקולטני אצטילכולין ניקוטינית 2,8. גם מסכי גנטיים המבוססים על התנהגויות הנגרמות APD במבוגרים הביאו לזיהוי מטרות APD רומן, וכעת אנו מאמתים מטרות ממסכים הן התפתחות והתנהגות ביונקים 7. לפיכך, גישה חסר חוליות כימיות גנטית כדי לגלות את המנגנונים מולקולריים רומן של פעולה של APDs מופיעה להיות ריאלי 5,8. ג לוע elegans הוא איבר הכולל 20 נוירונים, 20 תאי שריר, ו20 תאי אבזר, עטופים בקרום במרתף. דומה ללב היונקים, הלוע הוא אוטונומיnd משאבות כל הזמן אוכל מהסביבה החיצונית 9. עיכוב של קצב שאיבת בלוע פשרות ספיגת מזון, וכך מוטציות או תרופות המעכבים עיכוב גורם שאיבת בלוע התפתחותית או לעצור 9. APDs לעכב את קצב שאיבת בלוע, והיוו בחלקו להשפעות שלהם על פיתוח ו1,2 כדאיות. כאן, אנו משתמשים קלוזאפין APD לא טיפוסי לדוגמא ירושלים להפגין מבחני תרופה לפיתוח נמטודות ושאיבת בלוע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>Clozapine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6305</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetic acid (HAC)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP2401</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0590-13</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">425044</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:236px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:188px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:200px;">5810 000.017</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Incubator shaker</td>
			<td style="width:188px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:200px;">M1246-0006</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:236px;">Low temperature incubator 815</td>
			<td style="width:188px;">Precision Scientific</td>
			<td style="width:200px;">J1790-1B</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:236px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:188px;">Olympus</td>
			<td style="width:200px;">SZX12</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:236px;">Petri dish 35 x 10 mm</td>
			<td style="width:188px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:200px;">NC9434271</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:236px;">12-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:188px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:200px;">REF 353043</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for studying the mechanisms of action of antipsychotic drugs in caenorhabditis elegans

elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם גנטי פשוט מקובל בקנה מידה גדולה קדימה לאחור מסכי גנטיים והמסכים גנטיים כימיים. ג הגנום elegans כולל תרופה פוטנציאלית אנטיפסיכוטיות (APD) מטרות נשמרים בבני אדם, ובם גנים המקודדים חלבונים דרושים לסינתזת נוירוטרנסמיטר ולמבנה ותפקוד הסינפטי. חשיפת APD מייצרת עיכוב ו / או קטלני בנמטודות התפתחותיים באופן תלוי ריכוז. פנוטיפים אלה נגרמים, בין שאר, על ידי עיכוב הנגרם APD של בלוע שאיבת 1,2. לפיכך, פנוטיפ התפתחותית יש בסיס התוקפת, מה שהופך אותו לשימושי ללימודי pharmacogenetic של נוירולפטיות. כאן אנו מדגימים נהלים מפורטים לבדיקת השפעות APD בפיתוח נמטודות ושאיבת בלוע. עבור assay התפתחותי, עוברים מסונכרנים מונחים על מדיום נמטודות צמיחת צלחות (NGM) המכילות APDs, והשלבים של פיתוח aniאז Mals הם הבקיע יומי. עבור assay קצב שאיבת בלוע, מבוים בעלי חיים מבוגרים צעירים נבדקים על צלחות NGM המכילות APDs. מספר משאבות בלוע ליחידת זמן הוא רשם, ושיעור השאיבה מחושב. מבחני אלה יכולים לשמש ללימוד סוגים רבים אחרים של מולקולות קטנות או אפילו מולקולות גדולות.

1. עיכוב התפתחותי / תוצאת assay הקטלניות תוצאה אופיינית לassay עיכוב / הקטלניות התפתחותית מודגמת באיורי 1 א ו 1 ב. כאשר חיות בר מסוג בקבוצת הביקורת גדלו השלב הרה להולדת למבוגרים (איור 1 א), חיות בר מהסוג שנחשפו לקל...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

גישות לבדיקת ההשפעות של תרופות אנטיפסיכוטיות (APDs) בelegans Caenorhabditis הם הפגינו. מבחני מתוארים לבדיקת השפעות תרופה בפיתוח וכדאיות ועל קצב שאיבת בלוע. שיטות אלה חלות גם על ניסויי pharmacogenetic עם כיתות סמים אחרות מאשר APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

methods-for-studying-mechanisms-action-antipsychotic-drugs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

11.4K Views.  Harvard Medical School.  גישות לבדיקת ההשפעות של תרופות אנטיפסיכוטיות (APDs) בelegans Caenorhabditis הם הפגינו. מבחני מתוארים לבדיקת השפעות תרופה בפיתוח וכדאיות ועל קצב שאיבת בלוע. שיטות אלה חלות גם על ניסויי pharmacogenetic עם כיתות סמים אחרות מאשר APDs. 

Video: Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות

א

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans