אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. פרס אוקונור בזיל המלומד מן מצעד הפרוטות ואת פרס הקריירה מן הקרן הלאומית למדע כדי GAC, וכן מחקר לתואר ראשון במדעי תוכנית גרנט מן הווארד יוז רפואי במכון של אוניברסיטת אלבמה, לממן רגישות עצבית ו אפילפסיה מחקר מעבדה קולדוול.

Aldicarb פרדיגמה חשיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון, להבטיח כי לפחות שלושים צעירים בשלב הבוגר של תולעים גנוטיפ של לשכפל כל אחד יהיה זמין עבור מבחני aldicarb ביום השני. זה הכי טוב אם הנסיין בוחר חמישים או יותר תולעים בשלב L4 לצלחות NGM טרי (הכי טוב בלי nystatin), אשר מכילים E. coli (רצוי OP50) כמקור מזון, לגדל אותם במשך 12-24 שעות בטמפרטורת עקבית מתירני (20 ° C עד 22 ° C היא הטובה ביותר, למרות 25 מעלות זה בסדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השני, לעשות 100 מניות mM פתרון של aldicarb עם אתנול 70% (EtOH) ו -30% DDH 2 O. מורחים את הכמות המתאימה של aldicarb לצלחות NGM מינוס nystatin עם כמויות מוגדרות כדי להשיג את הריכוזים aldicarb הרצוי. אנחנו באופן עקבי להשתמש 0.5 aldicarb mM על ידי ציפוי 37.5 μL aldicarb של 100 מ&quot;מ על גבי צלחות 7.5 מ&quot;ל NGM. אפשר צלחות aldicarb להתייבש במשך כ 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אין צורך לפצח את העפעפיים. לחלופין, aldicarb ניתן להוסיף NGM ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כרכים, צלחת ייבוש עקבית של E. coli (רצוי OP50) על גבי במרכז כל צלחת aldicarb ויבש למשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אנחנו באופן עקבי צלחת 25 μL של OP50, אשר יוצרת הדשא מזון בגודל מספיק כדי לשמור על תולעים מרוכז במקום קטן בלי הצפיפות. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדשא מזון יבש, אפשר להמשיך עם מבחני aldicarb. בשל האופי הסובייקטיבי של מבחני aldicarb, מומלץ מאוד כי הניסויים יבוצעו &quot;בצורה עיוורת&quot;. עמיתו של הניסוי הראשוני יכול מחדש התווית המקורית צלחות עם תולעים להיות assayed. כמו כן, העמית יכול להעביר תולעים מהצלחות המקורי צלחות aldicarb מוצפנת מיד לפני תחילת טיימר. אם הנסיין צופה assaying זן מסוים של תולעים עם פנוטיפ אופייני, כגון uncoordination, אז חייב להיות גם שליטה עם פנוטיפ דומה כדי לצמצם הטיות. יתר על כן, עדיף אם הנסיין מבחני זן wild-type, כמו גם זן עמיד זן רגיש, במקביל כדי לסייע לתקנן ניסויים. הנסיין צריך לשאוף לנתח מספר עקבית של תולעים עבור לשכפל כל אחד. אנחנו באופן עקבי לנתח thirty תולעים של גנוטיפ אחד עבור כל לשכפל. אנחנו גם לבצע לפחות שלוש משכפל עבור כל ניסוי. הנסיין מנוסה אמור להיות מסוגל לנתח לפחות ששה זנים בכל פעם. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תולעים משותק על ידי דרבון באופן עקבי כל תולעת עם חוט פלטינה. אנחנו באופן עקבי לדרבן תולעים שלנו פעמיים על הראש ופעמיים על הזנב כל 30 דקות עבור סכום כולל של שלוש שעות. הפסקת השאיבה בלוע עשוי לשמש גם כדי להגדיר שיתוק, אבל רק אם הנסיין מעסיקה הגדרה עקבית של שיתוק על כל מבחני. כמו כן, ראוי לציין כי חלק תולעים, במיוחד אלה עמידים aldicarb, עשויים לנסות לזחול מעל צלחת. במקרה זה, הניסוי עלול להתפשט כמות קבועה של חומצה פלמיטית, מכשול פיזי כדי תנועה תולעת, סביב צלחות aldicarb. פרשנו 25 μL של 10 מ&quot;ג חומצה פלמיטית / mL EtOH. </li></ol> PTZ פרדיגמה חשיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון, להבטיח כי לפחות שלושים צעירים בשלב הבוגר של תולעים גנוטיפ של לשכפל כל אחד יהיה זמין עבור מבחני PTZ ביום השני. זה הכי טוב אם הנסיין בוחר חמישים או יותר תולעים בשלב L4 לצלחות NGM טרי (הכי טוב בלי nystatin), אשר מכילים E. coli (רצוי OP50) כמקור מזון, לגדל אותם במשך 12-24 שעות בטמפרטורת עקבית מתירני (20 ° C עד 22 ° C היא הטובה ביותר, למרות 25 מעלות זה בסדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השני, ליצור 0.5 גרם PTZ / mL DDH פתרון 2 O המניות של PTZ. מורחים את הכמות המתאימה של PTZ על NGM מינוס צלחות nystatin עם כמויות מוגדרות כדי להשיג את בריכוזים PTZ הרצוי. כי אנחנו מעדיפים מנה תגובה עבור מבחני PTZ, אנו צלחת כמויות משתנות של PTZ על צלחות 7.5 מ&quot;ל NGM. לדוגמה, אחד עשוי צלחת 37.5 μL הפתרון מניות PTZ לצלחת mL 7.5 NGM לעשות PTZ 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון. אפשר צלחות PTZ להתייבש במשך כ 60-120 דקות בטמפרטורת החדר. אין צורך לפצח את העפעפיים. לחילופין, ניתן להוסיף PTZ ישירות NGM, אך יש להשתמש מיד לאחר לחיזוק עבור מבחני. יציבות PTZ היא הרבה פחות מזה של aldicarb. לכן, מבחני עם מבוגרים צלחות PTZ מהימנים פחות. PTZ צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות ייבוש עם סוכן ייבוש לפני השימוש. אנחנו מעדיפים להתעלם PTZ כחודשיים לאחר הפתיחה כדי להבטיח יציבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כרכים, צלחת ייבוש עקבית של E. coli (רצוי OP50)על גבי במרכז כל צלחת PTZ ויבש עוד 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אנחנו באופן עקבי צלחת 25 μL של OP50, אשר יוצרת הדשא מזון בגודל מספיק כדי לשמור על תולעים מרוכז במקום קטן בלי הצפיפות. &nbsp;</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדשא מזון יבש, אפשר להמשיך עם מבחני PTZ. למרות מבחני PTZ הן סובייקטיביות פחות מבחני aldicarb, הוא עדיין מומלץ מאוד לבצע ניסויים &quot;באופן עיוור&quot;. עמיתו של הניסוי הראשוני יכול מחדש התווית המקורית צלחות עם תולעים להיות assayed. כמו כן, העמית יכול להעביר תולעים מהצלחות המקורי צלחות PTZ מוצפנת מיד לפני תחילת טיימר. אם הנסיין צופה assaying זן מסוים של תולעים עם פנוטיפ אופייני, כגון uncoordination, אז חייב להיות גם שליטה עם פנוטיפ דומה כדי לצמצם הטיות. יתר על כן, עדיף אם הנסיין מבחני זן wild-type, כמו גם זנים עם גוף מלא עוויתות קדמית או, במקביל כדי לסייע לתקנן ניסויים. הנסיין צריך לשאוף לנתח מספר עקבית של תולעים עבור לשכפל כל אחד. אנחנו באופן עקבי לנתח thirty תולעים של גנוטיפ אחד עבור כל לשכפל. אנחנו גם לבצע לפחות שלוש משכפל עבור כל ניסוי. הנסיין מנוסה אמור להיות מסוגל לנתח לפחות שלושה זנים בכל פעם. עם זאת, התדירות והעוצמה של PTZ-Induced עוויתות השיא בדרך כלל בין 15-30 דקות של חשיפה, ולאחר מכן להחליש כמו תולעים להיות משותק או, במקרים מסוימים, להסתגל לתרופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת &quot;דמויי אפילפסיה&quot; עוויתות תולעים כל 30 דקות עבור סכום כולל של שעה אחת. זה הכי טוב כדי להבקיע את מספר תולעים עם עוויתות הקדמי, שאנו מכנים &quot;הראש מיטלטל&quot;, בנפרד במספר תולעים עם גוף מלא, עוויתות, שיתוק גוף מלא, שאנו מכנים &quot;טוניק&quot;, או שילוב של עוויתות קדמית עם שיתוק BWM, שאנו מכנים &quot;טוניק-clonic&quot;. רוב התולעים של גנוטיפ אחד התערוכה רק סוג אחד של פרכוס. עם זאת, טוניק-clonic תולעים לעתים קרובות להיות טוניק לחלוטין, ולכן יש להמשיך את assay בעבר 30 דקות, גם אם כל התולעים הפגינו כבר עוויתות. כמו כן, ראוי לציין כי תולעים מסוימים עשויים לנסות לזחול מעל צלחת. במקרה זה, הניסוי עלול להתפשט כמות קבועה של חומצה פלמיטית סביב צלחות PTZ. פרשנו 25 μL של 10 מ&quot;ג חומצה פלמיטית / mL EtOH. </li></ol> תגובות התנהגותיות של מוטאנטים C. elegans נבחרים הילוכים Synaptic כדי Aldicarb ו PTZ <table style="height: 157px;;text-align:right;direction:rtl" border="1"><tbody><tr><th> Mutant שם </th><th> Synaptic תפקיד </th><th> התנהגות ללא תרופות </th><th> תגובה התנהגותית כדי Aldicarb (בהשוואה ל wild-type N2) </th><th> תגובה התנהגותית כדי PTZ </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> מעכב הולכה סינפטית </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור משופרת של שיתוק </td><td> נבדל wild-type </td></tr><tr><td> UNC-43 (n498n1186) </td><td> מורכב </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור משופרת של שיתוק </td><td> גוף מלא עוויתות </td></tr><tr><td> UNC-25 (e156) </td><td> מקדם תמסורת GABA </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור משופרת של שיתוק </td><td> עוויתות הקדמי, גוף מלא שיתוק </td></tr><tr><td> snb-1 (md247) </td><td> מקדם ההולכה הסינפטית </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור מופחת של שיתוק </td><td> קדמית עוויתות </td></tr><tr><td> UNC-4 (E120) </td><td> מקדם תמסורת ACH </td><td> ללא תיאום </td><td> שיעור מופחת של שיתוק </td><td> נבדל wild-type </td></tr></tbody></table> שני ממריצים עצבית, מעכב acetylcholinesterase, שנקרא aldicarb, וכן אנטגוניסט לרצפטור GABA, שנקרא pentylenetetrazole (PTZ), ניתן להשתמש באופן משלים לאפיין C. elegans מוטנטים בשידור סינפטי. אצטילכולין מעוררים עודף (ACH) מצטבר בגוף התולעת קיר neuromuscular צמתים (NMJs) מן המוטציות המזיקות של הרגולטורים שלילית של אח השידור (למשל tom-1 ו-UNC-43) או רגולטורים חיוביים של השידור GABA מעכבות (למשל, UNC-25). לעומת זאת, מעוררים רמות אח בבית NMJs תולעת הם פחתה על ידי מוטציות מזיקות ב הרגולטורים חיובי של שידור הסינפטי כללי (למשל, snb-1) או אח העברת גנים ספציפיים (למשל UNC-4). כאשר בהשוואה ל wild-type תולעים N2, תולעים מוטציה עם שידור גבוהות אח מעוררים ב NMJs התערוכה שיעורי מוגברת של שיתוק aldicarb-Induced, ואילו תולעים מוטציה עם הילוכים הוריד אח מעוררים להפגין מוזלים של שיתוק aldicarb-Induced. למרות PTZ משבש בתיאום עצבי ב C. elegans קיר השרירים בגוף, שלא כמו aldicarb, PTZ גם מהופך GABA מעכבות ב C. elegans שרירי הראש. כתוצאה מכך, הרגישות aldicarb לא יכול לחזות במדויק את הרגישות PTZ. תולעים Mutant עם פגמים ספציפיים regul חיובית או שליליתation של שידור אח הם נבדלים מן wild-type תולעים N2 בנוכחות PTZ, ואילו תולעים מוטציה עם ליקויים בוויסות החיובי של שידור הסינפטי כללית או פגמים ספציפיים בתערוכה מעכבות השידור GABA חזקים PTZ-Induced עוויתות הקדמי. יתר על כן, UNC-43-הפסד של פונקציה מוטנטים להציג גוף מלא עוויתות בנוכחות PTZ וסביר יש הפרעות בשידור סינפטי נוספים, אשר תורמים התגובות הייחודי שלהם לסמים.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

פרוטוקולים נוכחי לחשיפה aldicarb עם C. elegans אינם מאפשרים להבחין בין הנסיינים מוטנטים עם גירעונות ספציפיים שידור ACH ו מוטנטים עם גירעונות כללית בשידור סינפטי, כמו גם סוגים של מוטציות התערוכה התנגדות aldicarb. כמו כן, aldicarb לא ניתן להשתמש כדי לקבוע אם יש גירעונות מוטנטים ספציפיים השידו...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

נמטודות, Caenorhabditis elegans, הפך מודל רצוי ללימוד עצבית. סי אלגנס הוא ייחודי בין במודלים של בעלי חיים, כמו אנטומיה קישוריות של מערכת העצבים שלו נקבע מן micrographs אלקטרונים ומעודן ידי מבחני תרופתי. בסרטון הזה, אנו מתארים כיצד שני ממריצים עצביים משלימה, מעכב acetylcholinesterase, שנקרא aldicarb, וכן חומצה גמא-aminobutyric (GABA) אנטגוניסט לרצפטור, שנקרא pentylenetetrazole (PTZ), יכולים להיות מועסקים במיוחד כדי לאפיין איתות ב C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) ולהקל על ההבנה שלנו של מעגלים עצביים אנטגוניסטית. מתוך 302 C. elegans נוירונים, אלף תשע GABAergic D-סוג מנוע נוירונים קיר innervate גוף שרירי (BWMs), בעוד ארבעה נוירונים GABAergic, שנקרא RMEs, שרירי הראש innervate. לעומת זאת, 39 הנוירונים המנוע לבטא את הגירוי העצבי, אצטילכולין (ACH), ואת להרגיז השידור GABA על BWMs לתאם תנועה. טבע אנטגוניסטית של נוירונים מנוע GABAergic ו cholinergic ב NMJs הגוף קיר נקבע בתחילה על ידי אבלציה לייזר חיזקה מאוחר יותר על ידי חשיפה aldicarb. חשיפה אקוטית aldicarb תוצאות שיתוק זמן מנות או מנה תגובה ב wild-type תולעים. עם זאת, הפסד של שידור אח מעוררים מקנה עמידות aldicarb, כמו אח פחות מצטבר ב NMJs תולעת, המוביל גירוי פחות BWMs. ההתנגדות aldicarb אפשר לראות עם אח ספציפי או כללי מוטנטים פונקציה הסינפטי. בהתאם GABA אנטגוניסטית ו ACH השידור, אובדן השידור GABA, או כישלון שלילי להסדיר אח שחרורו, מקנה רגישות יתר aldicarb. למרות החשיפה aldicarb הוביל לבידוד של homologs תולעת רבים של גנים עצבית, חשיפה aldicarb לבדו לא יכול לקבוע ביעילות תפקידים הרווחת עבור גנים מסלולים ספציפיים C. elegans נוירונים המנוע. לשם כך, יש לנו הציגה גישה ניסויית משלימים, אשר משתמשת PTZ. מוטנטים עצבית להציג פנוטיפים ברורים, להבדיל משיתוק aldicarb-Induced, בתגובה PTZ. Wild-type תולעים, כמו גם מוטנטים עם inabilities ספציפי לשחרר או לקבל אח, לא מראים רגישות ברור PTZ. עם זאת, מוטציות GABA, כמו גם מוטנטים בכלל פונקציה הסינפטי, להציג עוויתות הקדמי באופן זמן או כמובן במינון תגובה. מוטאנטים שלא ניתן לווסת באופן שלילי שחרור הנוירוטרנסמיטר כללי, ולכן מפרישים כמויות עודפות של אח על BWMs, הפך משותק PTZ. PTZ-Induced פנוטיפים של כיתות מוטציה בדידה עולה כי גישה משלימים עם aldicarb ו פרדיגמות PTZ החשיפה C. elegans עשוי להאיץ את הבנתנו עצבית. יתר על כן, קטעי וידאו המדגים כיצד אנו מבצעים מבחני תרופתי צריך להקים שיטות עקבית למחקר C. elegans.

Watch this Scientific Journal Video about Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants at JoVE.com

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

וידאו זה מדגים כיצד להעסיק two ממריצים עצביים, aldicarb ו pentylenetetrazole (PTZ), בדרכים משלימות ללמוד לתפקד סינפטיים של נמטודות, C. elegans. גישה זו משלימה עשוי לשמש גם כדי לשפוך אור על מנגנוני שמור באבולוציה עבור בתיאום ויסות עצבי ויש לו השלכות על אפילפסיה והתקפים.

פרדיגמות אפיון תרופתי של C. elegans מוטאנטים הילוכים Synaptic

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  University of Alabama. וידאו זה מדגים כיצד להעסיק two ממריצים עצביים, aldicarb ו pentylenetetrazole (PTZ), בדרכים משלימות ללמוד לתפקד סינפטיים של נמטודות, C. elegans. גישה זו משלימה עשוי לשמש גם כדי לשפוך אור על מנגנוני שמור באבולוציה עבור בתיאום ויסות עצבי ויש לו השלכות על אפילפסיה והתקפים.

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...