טרשת נפוצה וYZ נתמכים על ידי studentships PhD KCL וKCL-סין. MO מומן על ידי מלגת לימודי דוקטורט ביוטכנולוגיה ומחקר מדעי הביולוגיה מועצה. אנו מודים מאסארו Okabe ויוני ichi מיאזאקי לפלסמיד PCX-EGFP ואלן Chedotal ויתנה Ypsilanti לייעוץ רב ערך על electroporation.

הליך זה הנו בהתאם לתקנות בבריטניה המשרד הביתית (חוק נהלי בעלי החיים מדעיים, 1986). מדענים צריכים לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו ואושרו על ידי ארגוני בעלי החיים שלהם מוסדיים ולאומיים רגולציה. 1. אחרי הלידה Electroporation 1.1. הכנת זכוכית נימים, ה-DNA הפתרון וelectroporator <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנימים משכו זכוכית (OD: 1.5 מ&quot;מ, מק&quot;ט: 0.86 מ&quot;מ) להזרקת ה-DNA. (הגדרות אינדיקטיביים לחולץ נימי סאטר P-97 הן: חום 283; משכו 50; Velocity 90; זמן 50). להטביע את חותמו על הנימים המקביל להיקף של כ 2 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המתח של electroporator ל5 פולסים מרובעים, 50 msec / דופק ב100 V, עם 850 מרווחים אלפיות שניים (100V, דופק על 50 אלפיות שני, דופק OFF 850 ​​אלפיות שני, דופק 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל טוהר גבוה (OD 260/280&gt; 1.80) פלסמיד דנ&quot;א ללא רעלן פנימי לריכוז סופי של 1-2 מיקרוגרם / μlעם רעלן פנימי לשחרר חיץ טריס-EDTA או PBS. מומלץ להוסיף 0.1% ירוקים מהירה לפתרון ה-DNA (הצבע צריך להתפשט בחדר כאשר הוא מוזרק בהצלחה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האלקטרודות מ&quot;מ 5-7, ג&#39;ל האלקטרודה ולחמם את כרית החימום. </li></ol> 1.2. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גור עכבר לאחר לידה יום 2 מכלוב ולהרדים אותו על ידי שאיפת isoflurane (בזרימה ~ 0.6 L / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 1 דקות, לקבוע את המצב של הרדמה באמצעות תגובת דחק רגל. אם אין תנועה מתרחשת, להמשיך בהזרקה תוך חדרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט נימים עם 1-2 μl של ה-DNA באמצעות צינור aspirator מחובר לנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מקור אור קר, להחזיק את הראש של הגור בין אגודל ואצבע מורה של היד פחות הדומיננטית שלך. מעט למשוך את העור בחזרה על הראש כדי לעזור לזיהוי של נקודת ההזרקה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו למשל קו וירטואלי בין העין ולאהוא craniometric מבדה ציון הדרך (איור 1 א). הכנס את מחט נימים כבשליש מאורכו של קו זה ממבדה (כ 1 מ&quot;מ מנקודת אמצע הקו) 15. הכנס את הנימים על 2 מ&quot;מ עמוק, והקפד להימנע מחדירה עמוקה במוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פלסמיד על ידי נשיפה לאט דרך פה (יכול לשמש גם מזרק מחובר לנימים). במהלך הליך זה, וודא שאצבעותיך אינן הפעלת לחץ רב מדי על המוח, כמו זה יכול למנוע הזרקת פלסמיד מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק הזרקה כאשר כמות מינימאלית של פתרון ה-DNA נשארה בנימים. מומלץ להזריק פחות מ 1 μl כדי למנוע עלייה מזיקה בלחץ תוך גולגולתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל שני אלקטרודות עם הג&#39;ל ומניחים אותם בצד החיובי בצד הלטרלי של האונה שבו את ה-DNA שהוזרקה (איור 1 א). לשילוב ה-DNA לתוך SVZ מקורי, אלקטרודות מקום מקורי מעטנקודת הזרקה. משתנה עמדת האלקטרודה יכול להשיג סגוליות אזורית של electroporation באזורים שונים של SVZ 22,25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום העברה שוטפת על ידי לחיצה על דוושת footswitch הדופק. כאשר electroporation יושלם, לבדוק את המתח בתצוגת electroporator (ערכי מתח לא צריכים להיות מתחת 90 ​​V, שכן ערכי מתח נמוך לתאם עם יעילות electroporation עני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיות מחדש את הגור תחת חמצן בכרית חימום לכמה דקות ולהחזיר אותו לכלוב, להניח אותו מאמו. ודא האם מאחזרת את הגור ומתאחדת זה עם שאר האשפה. לאחר electroporation, להשאיר גורים עם אמם ל4-7 ימים לפני השלב הבא. </li></ol> 2. הכנת תרבויות חריפות המוח פרוס 2.1. הכנה של פתרונות וכלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרונות הבאים נדרשים (אפשר גם להשתמש DMEM גבוה של גלוקוז ללנתח והדמיה17): נתיחה בינונית (500 מיליליטר) התקשורת מאוזנת של הגיי - 500ml גלוקוז 45% - 5 מ&quot;ל סרט בינוני (10 מיליליטר) גלוקוז 45% - 0.110 מיליליטר 1 HEPES M - 0.100 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס - 0.100 מיליליטר FCS - 0.500 מיליליטר B27 - 0.100 מיליליטר גלוטמין - 0.200 מיליליטר נשר בינוני Dulbecco שונה (אדום ללא פנול) - 8.89 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחמם בינוני סרט ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח Millicell מוסיף למנת תרבות תחתית כוס 35 מ&quot;מ המכילה 1 מיליליטר של מדיום קולנוע ומקום בחממה humidified על 37 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן vibratome אביזרים (מברג, קאמרי, סכיני גילוח, דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכלים לנתיחה: מספריים, מרית קטנה, מלקחיים ישרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכלים לטיפול בפרוסות: מכחול קטן או inoculating לולאה רכה (גודל: 10 μl), טפטפות פסטר מפלסטיק, תיבת קרח וכמה צלחות פלסטיק 6 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool המדיום לנתיחהב2-4 ° C. </li></ol> 2.2. הכנת פרוסות המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת 6 סנטימטר עם מדיום לנתיחה precooled ולמקם אותו על קרח (כדי לשמור על פרוסות טריות חתוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות נקע בצוואר הרחם, להשתמש במספריים כדי לערוף את גור העכבר. הסר את הקרקפת עם אזמל, לחתוך את הגולגולת לאורך תפר אמצע sagittal מOB למוח הקטן ולהסיר בעדינות את דשי הגולגולת באמצעות מלקחיים. ודא שכל המוח חשוף ובזהירות לנתח אותו בעזרת מרית, מטפלת מיוחדת שלא לפגוע ברקמות. הנתיחה צריכה להיעשות בזהירות, אבל באותו הזמן מהר מאוד (פחות מדקה במידת האפשר). נקע בצוואר הרחם הוא השיטה המועדפת שלנו בגלל הרדמה מסוף עם הרדמה סמים / גז יכולה להשפיע על מאפייני הנדידה של neuroblasts והמצב בריא של התרבויות הפרוסה המוח, אשר צריכה להיות צילמו במהירות יחסית לאחר הקרבת בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect המוח עם רזאו להב (איור 2). השלך חצי כדור uninjected או להשתמש בניסויים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה קטנה של סרט על בעל vibratome ולהשתמש בכמות המינימלית הכרחית של דבק לצרף את האונה במוח על גבי זה (איור 2). זה מונע פגיעה של פני השטח בעל בשל יישומי דבק חוזרים ונשנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לדבק להתייבש במשך כמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעל במגש vibratome מלא פתרון לנתיחה precooled. כוון את הנורה חוש הריח לכיוון הלהב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין חיתוך האונה המוח באמצעות הגדרות מתאימות. הפרמטרים הבאים מומלצים: עובי פרוס 300 מיקרומטר; מהירות ~ 3-5; תדירות ~ 9. תדר גבוה ומהירות נמוכה מומלצים כדי למנוע נזק לפרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פרוסות באמצעות מכחול קטן או inoculating לולאה רכה. לשמור רק פרוסות עם OB הגלוי (בדרך כלל 2-3 פרוסות / מוח). בדרך כלל, ca הפרוסה המכילה את רוב RMSn ניתן למצוא ב ~ 300 מיקרומטר מהמשטח התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו פרוסות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי עבור אות ה-GFP (לוודא כדי להעיף אותם כדי לבדוק את הקרינה משני הצדדים), ולבחור את אלה המראים הקרינה בהירה לאורך רוב RMS. </li></ol> 2.3. פרוסות מוח Culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע בתרבית תאים, לחתוך את הזנב השלישי ביותר של פרוסת המוח ולהסיר כל עקבות דבק באמצעות פינצטה ישר קנס או אזמל microdissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשאוב פרוסה בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק (לחתוך את הקצה של פיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר, זה לא לגרום הניזק לפרוסה) ולמקם אותו במרכזו של Millicell prewarmed להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהצד עם אות הניאון הבהירה ממוקם במגע עם Millicell להכניס (להדמיה עם מיקרוסקופ הפוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון לנתיחה עודף על גבי להכניס את עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר תרבויות פרוסה ללהתיישב בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות במשך שעה לפחות 1 לפני ההדמיה. </li></ol> 3. זמן לשגות הדמיה של הגירת neuroblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות 2 שעות לפני ההדמיה, להפעיל את מערכת פרקין אלמר UltraViewVoX ספינינג confocal הדיסק, מיקרוסקופ ניקון Ti-E ההפוך, האמאמטסו C10600-10B (ORCA-R2) מקוררת מצלמת CCD דיגיטלית, ומערכת חימום (Solent המדעית) נקבעה על הקבוע טמפרטורה של 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המודול רכישת תוכנת Volocity ולחץ על כפתור &quot;דהינו&quot; ובחר את הלייזר (ים) להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך 2 שעות של הכנת פרוסה מוח, למקם את צלחת תחתית זכוכית המכילה פרוסת המוח בחדר ההדמיה על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אובייקטיבי Nikon CFI Super תכנית פלואוריד ELWD 20X/0.45 תחת אור הניאון המתאים כדי לבחור ולהתמקד באזור של הפרוסה שיהיה צילם (למשל חלק יורד הראשון של RMS רק לאחר הזריקה, או אלבוw האזור של RMS, או רק אחרי המרפק לפני neuroblasts להיכנס OB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הזמן לשגות הדמיה עם הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיקרוסקופ, לחץ על כפתור L100 כדי לאפשר סריקת לייזר של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בVolocity, פתח UltraView לייזר מחלף על ידי בחירה בלייזר המתאים (למשל לייזר ננומטר 488 לGFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זמן החשיפה (בדרך כלל בין 100-500 האלפיות שני) ואת עוצמת הלייזר (בדרך כלל 20-30%) בהתאם לעוצמת אות הניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הרווח דיגיטלי תמונה כדי לשפר את ההדמיה נייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מרווח Z-מחסנית לתמונה בתוך פרוסת המוח (בדרך כלל מעל 100-120 מרווח מיקרומטר). בחר מרווח עם מספר מתאים של תאים מבודדים, כדי למנוע אפשרי חופף ככל האפשר (זה יקל על ניתוח מעקב לאחר מכן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המרווח בין כל תמונת Z-מחסנית (בדרך כלל 2-4 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר int הזמןerval בין כל לכידת Z-מחסנית (למשל 3 דקות) ומשך ההדמיה הכולל (לדוגמא 3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על האייקון של &quot;השמור&quot; כדי לשמור את השינויים בפרמטרי ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן ההקלטה כדי להתחיל הדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה חלופית של דגימות בקרה וניסוי (למשל רכב / טיפול תרופתי או פלסמידים שונים electroporated) לאורך כל אותו היום. </li></ol> 4. ניתוח הגירת neuroblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במודול Volocity Quantitation, פתח את הספרייה הרצויה שנוצרה לאחר שסיים את ניסוי הזמן לשגות. בחר &quot;פוקוס מורחב&quot; מהתיבה השמאלית העליונה (איור 4 א, ​​שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;מדידות&quot; כדי להציג את חלון המדידה (איור 4 א, ​​שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשימת המשימות גלויה בפינה השמאלית התחתונה של המסך. גרור &quot;מסלול&quot; (הווה תחת &quot;שונים&quot; כותרת בתחתיתהרשימה) על השטח הנ&quot;ל. פעולה זו תנחה את הפתיחה של חלון חדש בשם &quot;מסלול&quot; בחלקו השמאלי העליון של המסך (איור 4 א, ​​שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;נקודות&quot; מכרטיסיית &quot;הקלט&quot; בחלון המסלול (איור 4 א, ​​שלב 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כלי הנקודות (איור 4 א, ​​שלב 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל מעקב neuroblast נודד על ידי לחיצה עם העכבר על האזור של גוף התא המרכזי ולשמור על מעקב אחר תנועת התא עד לנקודת הזמן האחרונה של הזמן לשגות הוא הגיע (לדוגמה מספר נקודה 61 לסרט באורך שעות 3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל נתונים לבחור &quot;הפוך פריט מדידה&quot; מתפריט המדידות (איור 4 ב &#39;, על השלבים 6-7). חלון יופיע במרכז המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון זה, בחר &quot;פריט חדש מדידה הנקרא:&quot; והקלד שם (איור 4C, שלב 8). זכור לבחור באפשרות &quot;כל הנקודות הזמן&quot; לפני יחסי הציבורEssing על אישור (איור 4C, שלב 9). קובץ פריט מדידה יופיע תחת קובץ הזמן לשגות ויכיל פרמטרים לניתוח כמוני (לדוגמא מרחק הגירה, מהירות, עקירה, ושיעור תזוזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על קובץ פריט מדידה כדי לפתוח אותו כמו חלון (איור 4D, צעד 10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את שירים, אחד של תאים נותחו, לבחור &quot;נקודת מעקב&quot; מהאפשרויות &quot;התצוגה&quot; (איור 4D, צעד 11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה ימנית על קובץ פריט המדידה ולייצא אותו כקובץ טקסט, אשר לאחר מכן ניתן לייבא בתוכניות כמו Excel לניתוח פרמטרים הגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד תנועות בין מסגרות רצופות והפסקות שנעשו על ידי כל תא בתקופת הצילומים, בקובץ פריט המדידה בחרו מבין האפשרויות &quot;התצוגה&quot; &quot;נקודה&quot; או &quot;אוכלוסיות&quot; ולחצו על זיהוי (לכל מסלול זיהוי ייחודי). לייצא את הקובץ שנוצר על ידי להמשיךing כמוסבר בשלב 4.10. </li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain.">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li><li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions.">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li><li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain.">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb.">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury.">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li><li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury.">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li><li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury.">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883 (2008).</li><li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation.">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li><li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis,+spine+density,+synaptic+integration,+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons.">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174 (2012).</li><li>dal Maschio, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960 (2012).</li><li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).</li><li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+zone+cell+migration:+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy.">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30 (2011).</li><li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls:+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis.">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13 (2011).</li><li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone.">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li><li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy.">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li><li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington's+disease.">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain.">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הגירה יעילה של אבות עצביים לאורך RMS מבטיחה ההתבגרות הבאה שלהם לתוך הנוירונים פונקציונליים 10. בולטים זרמים של אבות עצביים מכוונים OB גלויים בינקות אדם ועשויים לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות המוח האנושי לאחר לידה המוקדמת 27. יתר על כן, תאים אלה מסוגלים למקד לאתרים ?...

במוח של היונקים, הדור של נוירונים חדשים (נוירוגנזה) מתרחש לאחר לידה בעיקר בשני אזורים, אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואזור subgranular ברכס משוננת של ההיפוקמפוס 1. ראיות רבות שנאספו בשנים האחרונות תומכת בתפקיד קריטי לנוירוגנזה לאחר לידה בתפקודי זיכרון הנורה בהיפוקמפוס וחוש ריח 1-3. חשוב לציין, נוירוגנזה לאחר הלידה גם בעל פוטנציאל טיפולי בגלל מערכת היחסים שלה עם הפרעות נוירולוגיות ניווניות, ואת היכולת של neuroblasts להגר לאתרים פגועים במוח 4-6. אזור subventricular (SVZ) התפתחה לאחרונה כנישת נוירוגנית מכרעת. neuroblasts נגזרת SVZ נודדות לכיוון הנורה חוש הריח (OB) דרך הזרם מקורי נודד (RMS), מה שהופך את זה לתהליך ההגירה הארוך ביותר ב1,7,8 המוח לאחר הלידה. / RMS / מערכת OB היונקים SVZ הפכהמודל שימושי ללמוד צעדים שונים בנוירוגנזה, כגון התפשטות, הגירה ו1,8 בידול. גורמי גדילה רבים ורמזים תאיים להסדיר נוירוגנזה SVZ והגירה לאורך RMS, אבל המנגנונים המולקולריים תאיים רחוקים מלהיות באופן מלא הבינו 1,9. הגירה נכונה לאורך RMS היא קריטית להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד 10. בנוסף, חלק מהמחקרים הראו כי neuroblasts נגזרת SVZ יכולה להעביר מתוך RMS לאתרי פגיעה מוחית 4-6,11-13. לכן, חוקר את נדידת neuroblast ויסות מנגנוני איתות הוא יסוד לא רק להבין נוירוגנזה אלא גם ליישומים טיפוליים פוטנציאליים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתייג אבות עצביים SVZ ידי in vivo electroporation לאחר הלידה ולעקוב אחר הנדידה שלהם לאורך RMS בתרבויות פרוס מוח חריפות באמצעות microsco confocal הדיסק מסתובב זמן לשגותpy. Electroporation נעשה שימוש נרחב במחקרים התפתחותיים מעובריים לשלבים בוגרים 14-18. זהו כלים רבי עוצמה כדי לכוון ולתפעל אבות עצביים SVZ ומהווה חלופה זולה יותר והרבה יותר מהר להזרקת stereotactic של וקטורים או דור ויראלי של מודלים מהונדסים 1,15,19,20. זהו הליך פשוט יחסית, שאינו זקוק לניתוח ויש לו שיעורי הישרדות גבוהים. Electroporation של shRNA או פלסמידים-להביע recombinase CRE במודלים גנטיים עכבר העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד גנים של עניין או להשיג תיוג קבוע של אבות SVZ, ובכך מייצג את כלי שימושי ללימודי neurogenesis למבוגרים 21,22. הגירת neuroblast RMS הדמיה במוח השלמה היא עדיין מאתגרת בשל מגבלות טכניות הנוכחיות. עם זאת, ניתן לנטר את התהליך הזה באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות ספינינג confocal דיסק של פרוסות מוח חריפות, המספקות syst מתאיםשלהם דומים מאוד מצב in vivo גם נתונים למניפולציה תרופתית 23,24. הצימוד ב electroporation vivo לאחר הלידה עם הזמן לשגות הדמיה יקל על ההבנה של המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוח גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

אזור subventricular (SVZ) הוא אחת מהנישות העצביות העיקריות במוח לאחר הלידה. כאן, אבות עצביים להתרבות ולהצמיח neuroblasts מסוגל לנוע לאורך הנחל מקורי נודד (RMS) לכיוון הנורה חוש הריח (OB). נדידה למרחקים ארוכים זו נדרשת להבשלה המאוחרת של נוירונים יילוד בOB, אבל המנגנונים המולקולריים המסדירים את התהליך הזה עדיין אינם ברורים. חוקר את מסלולי איתות שליטה תנועתיות neuroblast יכול לא רק לעזור להבין צעד מהותי בנוירוגנזה, אבל יש גם פוטנציאל התחדשות טיפולי, בהתחשב ביכולת של neuroblasts אלה כדי למקד לאתרים במוח מושפעים מפציעה, שבץ מוחי או ניוון. בכתב היד הזה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לin vivo electroporation לאחר הלידה והזמן לשגות ההדמיה הבאה של הגירת neuroblast בRMS העכבר. electroporation אחרי הלידה יכול ביעילות transfect אב SVZתאים, אשר בתורו ליצור neuroblasts נודד לאורך RMS. באמצעות confocal ספינינג מיקרוסקופיה זמן לשגות דיסק בתרבויות פרוסה מוח חריפים, הגירת neuroblast ניתן לנטר בסביבה הדומה למצב in vivo בשיתוף פעולה הדוק. יתר על כן, תנועתיות neuroblast יכולות להיות במעקב וכמותית מנותחת. כדוגמא, אנו מתארים כיצד להשתמש בvivo electroporation לאחר הלידה של פלסמיד-GFP-לבטא לתייג ולדמיין neuroblasts נודד לאורך RMS. גם electroporation של פלסמידים-להביע recombinase shRNA או CRE בעכברים בנוקאאוט מותנים העסקת מערכת LoxP יכול לשמש יעד הגנים של עניין. מניפולציה תרופתית של תרבויות פרוסה מוח חריפות ניתן לבצע כדי לחקור את התפקיד של מולקולות איתות שונות בהגירה neuroblast. על ידי צימוד ב electroporation vivo עם הזמן לשגות הדמיה, אנו מקווים להבין את המנגנונים המולקולריים שליטה תנועתיות neuroblast ולתרום לפיתוחment של גישות חדשות כדי לקדם את תיקון מוח.

תיוג של neuroblasts נודד נגזר SVZ ניתן לצפות יחד RMS, בדרך כלל 4-8 ימים לאחר electroporation מוצלח (איור 1). יכולות להיות גם שנבחרו נקודות זמן ארוכות יותר, אך פחות תאים יימצאו בRMS מאחר שרובם יהיה נכנסו OB. Neuroblasts להתחיל לרכוש מורפולוגיה ותכונות אופייניות של תאי גרגיר בוגרים בOB סבי...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices at JoVE.com

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K Views.  King's College London.  הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיק?...

Video: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...