MS와 YZ는 KCL과 KCL 중국 박사 studentships에 의해 지원된다. MO는 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회의 박사 과정 학생이기 의해 투자되었다. 우리는 일렉트로에 귀중한 조언을 마사루 오카베 및 월 이치 미야자키 PCX-EGFP 플라스미드 및 알랭 Chedotal와 아테나 입실 랜티 감사합니다.

이 절차는 영국 홈 오피스 규정 (동물 과학적인 절차의 법, 1986)에 따른다. 과학자들은 설립하고 자신의 기관 및 국가 동물 규제 기관에 의해 승인 된 지침을 따라야합니다. 1. 출생 에레 1.1. 유리 모세 혈관, DNA 솔루션 및 Electroporator의 준비 <ol><li> DNA의 주입 뽑아 유리 모세관 (0.86 mm : 1.5 mm, ID OD)를 준비합니다. (셔터 P-97 모세관 끌어 당기는에 대한 지표 설정은 다음과 같습니다 : 열 283, 50를 당겨, 속도 (90), 시간 (50)). 약 2 μL의 부피에 해당하는 모세 혈관에 표시를합니다. </li><li> 850 밀리 초 간격 (100 V, 50 밀리 초 ON 펄스, 850 밀리 초, 펄스 5 OFF 펄스)로, 100 V에서 5 평방 펄스, 50 밀리 초 / 펄스 electroporator의 전압을 설정합니다. </li><li> 1-2 ㎍ / μL의 최종 농도 고순도 (OD&gt; 1.80 280분의 260)를 희석하여 독소 프리 플라스미드 DNA독소와 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 또는 PBS를 무료. 그것은 DNA 용액 (성공적으로 주입했을 때 염료가 뇌실에 확산한다)에 0.1 % 빠른 그린을 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> , 5-7 밀리 전극을 준비 전극 젤 가열 패드를 따뜻하게. </li></ol> 1.2. 일렉트로 <ol><li> 케이지에서 생후 2 마우스 강아지를 제거하고 (~ 0.6 L / min의 유량) 이소 플루 란 흡입으로 마취. </li><li> 약 1 분 후, 다리 핀치 응답을 사용하여 마취 상태를 결정한다. 아무런 움직임이 발생하지 않으면, 뇌 실내 주사를 진행합니다. </li><li> 모세관에 연결 흡입기 튜브를 사용하여 DNA의 1-2 μL 모세관 바늘을 넣습니다. </li><li> 차가운 광원에서 엄지 손가락과 덜 지배적 인 손의 검지 손가락 사이의 강아지의 머리를 잡아. 약간 오른쪽 주입 지점을 식별 할 수 있도록 머리에 피부를 뒤로 당겨. </li><li> 눈과 t 사이에 가상의 선을 고려그는 랜드 마크 람다 (그림 1A)를 craniometric. 람다 (라인 중간 지점에서 약 1 ㎜) 15이 라인의 길이의 3 분의 1에 모세관 바늘을 삽입합니다. 뇌의 깊은 침투를 방지하기 위해 확인하고, 깊이 2mm에 대한 모세관을 삽입합니다. </li><li> 입으로 천천히 불어 플라스미드를 주입​​ (모세관에 연결된 주사기가 또한 사용될 수있다). 이 성공 플라스미드 주입을 방지 할 수 있습니다으로이 절차를 수행하는 동안, 손가락이 뇌에 너무 많은 압력을 적용하지 있는지 확인합니다. </li><li> DNA 용액의 최소량은 모세관 남아 때 주입을 중지. 그것은 두개 내 압력 해로운 증가를 방지하기 위해보다 1 μl를 주입하는 것이 바람직하다. </li><li> 코트 두 젤 전극과는 DNA가 (그림 1A)를 주입 반구의 측면에서 긍정적 인 측면으로 배치합니다. 에 주동이의 SVZ에 DNA의 설립을위한 장소 전극이 약간 주동이주입 지점. 전극의 위치를 변화 시키면 SVZ 22, 25의 다른 지역에있는 일렉트로의 지역 특이성을 달성 할 수있다. </li><li> 펄스 풋 페달을 눌러 현재의 전송을 시작합니다. 일렉트로가 완료되면 (더 낮은 전압 값이 열악한 전기 천공 효율과 상관 관계 이후 전압 값이 90 V 이하이어야한다) electroporator 디스플레이에 전압을 점검한다. </li><li> 몇 분 동안 가열 패드에 산소에서 강아지를 재 활성화하고 떨어져 어머니를 배치, 케이지로 돌아갑니다. 어머니가 강아지를 검색하고 쓰레기의 나머지와 재결합해야합니다. 일렉트로 후, 다음 단계 전에 4-7일에 대한 자신의 어머니와 함께 새끼를 떠난다. </li></ol> 2. 급성 뇌 슬라이스 문화의 준비 2.1. 솔루션 및 도구 준비 <ol><li> 다음 용액은 (는 해부 및 이미징 고 글루코스 DMEM을 사용하는 것도 가능하다 필요17) 해부 매체 (500 ㎖) Gey의 균형 미디어 - 500ML 45 % 포도당 - 5 ㎖ 영화 매체 (10 ㎖) 45 % 포도당 - 0.110 ML HEPES 1 M - 0.100 ML 펜 / Strep의 - 0.100 ML FCS - 0.500 ML B27 - 0.100 ML 글루타민 - 0.200 ML 둘 베코 수정 이글 중간 (페놀 레드 무료) - 8.89 ㎖의 </li><li> 37 ° C에서 따뜻한 영화 매체 </li><li> 배치 밀리 셀은 37 ° C / 5 % CO 2에서 가습 인큐베이터에서 영화 매체와 장소 1 ㎖를 포함하는 35mm 유리 바닥 문화 요리에 삽입합니다. </li><li> vibratome 액세서리 (드라이버, 실, 면도날, 접착제)를 준비합니다. </li><li> 가위, 작은 주걱, 직선 겸자 : 해부 도구를 준비합니다. </li><li> 조각을 처리하기위한 도구를 준비 작은 붓이나 부드러운 접종 루프 (크기 : 10 μL), 플라스틱 파스퇴르 피펫, 아이스 박스와 여러 6cm 플라스틱 접시. </li><li> 해부 매체를 Precool2-4 ° C에서 </li></ol> 2.2. 뇌 조각의 준비 <ol><li> 예냉 해부 매체 6cm 접시를 입력하고 (갓 잘라 조각을 유지하기 위해) 얼음에 놓습니다. </li><li> 자궁 경부 전위 다음, 마우스 강아지 목을 벨 가위를 사용합니다. , 메스로 두피를 제거 소뇌에 OB에서 중간 시상 봉합 따라 두개골을 잘라 조심스럽게 집게를 사용하여 두개골 뚜껑을 제거합니다. 뇌 전체가 노출되어 있는지 확인하고 신중하게 조직을 손상하지 않도록 특별한주의를 가지고, 주걱을 사용하여 해부. 절개는 신중하게 수행되어야하지만 동시에 매우 신속하게 (가능한 분 미만). 약물 / 가스 마취제와 터미널 마취가 neuroblasts과 동물의 희생을 다음과 같은 상대적으로 신속하게 이미지화 할 필요가 뇌 슬라이스 문화의 건강한 상태의 이동성 특성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 경추 탈구는 우리가 선호하는 방법입니다. </li><li> 말이 맞아 함께 뇌를 Hemisect또는 블레이드 (그림 2). uninjected 반구를 폐기하거나 다른 실험을 위해 사용합니다. </li><li> vibratome 홀더 테이프의 작은 조각을 놓고 그 위에 뇌 반구 (그림 2)를 연결하는 접착제의 최소한의 필요한 양을 사용합니다. 이는 반복되는 접착제 응용 프로그램에 홀더 표면의 손상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 접착제가 몇 초 동안 건조시킵니다. </li><li> 예냉 해부 솔루션으로 가득 vibratome 트레이에 홀더를 배치합니다. 잎으로 후각 망울 (그림 2)를 가리 킵니다. </li><li> 적절한 설정을 사용하여 뇌의 반구를 절단 시작합니다. 다음 매개 변수를 사용하는 것이 좋습니다 : 슬라이스 두께 300 μm의, 속도 ~ 3-5, 주파수 ~ 9. 높은 주파수와 낮은 속도는 슬라이스의 손상을 방지하는 것이 좋습니다. </li><li> 작은 붓이나 부드러운 접종 루프를 사용하여 조각을 수집합니다. 만 볼 수 OB (보통 2 ~ 3 조각 / 뇌)로 조각을 유지합니다. 일반적으로 RMS의 대부분을 포함하는 슬라이스는 캘리포니아N 바닥면에서 ~ 300 μm의에서 찾을 수. </li><li> (양쪽면에 형광을 확인을 뒤집어 확인하는) GFP 신호에 대한 표준 형광 현미경으로 조각을 확인하고, RMS의 대부분을 따라 밝은 형광을 나타내는 사람을 선택합니다. </li></ol> 2.3. 배양 뇌 조각 <ol><li> 세포 배양 후드에서, 뇌 슬라이스의 가장 꼬리 제를 버려야 정밀 직선 핀셋이나 미세 절제 메스를 사용하는 접착제의 흔적을 제거합니다. </li><li> 섬세 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이스를 대기음 (더 큰 구멍을 만드 피펫의 끝을 잘라을,이 조각의 손상을 방지한다) 및 삽입 데워진 밀리 셀의 중앙에 놓습니다. </li><li> 밝은 형광 신호면이 밀리 셀은 (거꾸로 현미경과 영상을 위해) 삽입과 접촉에 배치되어 있는지 확인합니다. </li><li> 피펫 삽입물의 상단에 초과 해부 솔루션을 제거합니다. </li><li> 에 슬라이스 문화를 남겨이미징 전에 적어도 1 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 정착. </li></ol> 3. Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상 <ol><li> 적어도 2 시간 이미징 전에 상수로 설정 하마 마츠 C10600-10B (ORCA-R2)의 디지털 CCD 카메라를 냉각 퍼킨 엘머 UltraViewVoX 공 촛점 회전 디스크 시스템, 반전 니콘 티-E 현미경 및 난방 시스템 (솔 렌트 과학)를 켭니다 37 ° C의 온도 </li><li> Volocity 소프트웨어 획득 모듈을 열고 &quot;즉&quot;버튼을 클릭 이미징 레이저 (들)을 선택합니다. </li><li> 뇌 슬라이스 제제 2 시간 이내에, 현미경 스테이지 촬상 챔버 뇌 슬라이스를 포함하는 유리 바닥 접시를 배치. </li><li> 이미지를 만들 조각의 영역 (예를 들어, 그냥 주사 부위 후 RMS의 첫 번째 하강 부분, 또는 ELBO을 선택하고 초점을 적절한 형광등 아래에서 니콘 CFI 슈퍼 계획 형석 ELWD 20X/0.45 목표를 사용RMS의 지역 W, 또는 neuroblasts가 OB를 입력하기 전에 팔꿈치 후). </li><li> 다음 작업으로 시간 경과 영상을 설정합니다 : <ol><li> 현미경에서 샘플의 레이저 스캐닝을 허용하도록 L100 버튼을 클릭합니다. </li><li> Volocity에서 적절한 레이저 (GFP에 대한 예를 들어, 488 nm의 레이저)를 선택하여 UltraVIEW 레이저 체인저를 엽니 다. </li><li> 형광 신호의 강도에 따라 노출 시간 (일반적으로 100 ~ 500 밀리 초 사이) 및 레이저 강도 (일반적으로 20 ~ 30 %)을 설정한다. </li><li> 세포의 시각화를 개선하기 위해 이미지를 디지털 게인을 조정합니다. </li><li> 뇌 조각 내부의 이미지에 Z-스택 간격 (보통 이상 100 ~ 120 μm의 간격)을 선택합니다. (이것은 이후의 추적 분석을 용이하게한다)를 최대한 중첩 가능한 피하기 절연 세포의 적절한 개수와 간격을 선택한다. </li><li> 각각의 Z-스택 이미지 (보통 2-4 μm의) 사이의 간격을 선택합니다. </li><li> 시간 INT 선택각각의 Z-스택 캡처 (예 : 3 분) 및 총 이미징 기간 (예 : 3 시간) 사이 erval. </li><li> 영상 매개 변수에 대한 변경 사항을 저장하기 위해 &quot;저장&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 영상을 시작 녹음 버튼을 누릅니다. </li></ol></li><li> 제어 및 실험 샘플의 다른 영상 같은 날에 걸쳐 (예를 들어, 차량 / 약물 치료 또는 다른 일렉트로 플라스미드에 대한). </li></ol> 4. Neuroblast 마이그레이션 분석 <ol><li> Volocity 정량 모듈에서 시간 경과 실험을 완료 한 후 생성 된 원하는 라이브러리를 엽니 다. 왼쪽 상단 상자 (그림 4A, 단계 1)에서 &quot;확장 포커스&quot;를 선택합니다. </li><li> (그림 4A, 2 단계) 측정 창을 표시하려면 &quot;측정&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> 작업 목록이 화면의 왼쪽 하단에 표시됩니다. 드래그 &quot;트랙&quot;( &quot;기타&quot;에서 현재는 하단에 제목위의 공간에있는 목록). 이 화면의 왼쪽 상단 부분에서 &quot;트랙&quot;이라는 새로운 창 열기 (그림 4A, 3 단계)를 묻는 메시지가 표시됩니다. </li><li> 트랙 창에서 &quot;입력&quot;탭 (그림 4A, 4 단계)에서 &quot;포인트&quot;를 선택합니다. </li><li> 포인트 도구에 (그림 4A, 5 단계)를 클릭합니다. </li><li> 전지 본체의 중앙 영역에 마우스로 클릭하여 마이그레이션 neuroblast 추적을 시작하고 시간 경과의 마지막 시점까지 세포의 움직임을 추적하는 것을 계속할 도달 (3 시간 길이의 영화에 대한 예를 포인트 번호 (61)) . </li><li> 데이터 선택 얻으려면 측정 메뉴 (그림 4B, 6-7 단계)에서 &quot;측정 항목을 확인합니다.&quot; 창은 화면의 중앙에 표시됩니다. </li><li> 이 창에서 &quot;라는 새로운 측정 항목 :&quot;를 선택하고 (그림 4C, 8 단계)의 이름을 입력합니다. 홍보 전에 &quot;모든 timepoints&quot;옵션을 선택해야합니다싱 OK (그림 4C, 9 단계). 측정 항목 파일은 시간 경과 파일 아래에 나타납니다 및 정량 분석을위한 매개 변수 (예 : 마이그레이션 거리, 속도, 변위, 변위 속도)가 포함됩니다. </li><li> 창 (그림 4D, 10 단계)로 열 측정 항목 파일을 두 번 클릭합니다. </li><li> 분석 세포의 하나의 트랙을 시각화 &quot;디스플레이&quot;옵션 (그림 4D, 11 단계)에서 &quot;트랙 포인트&quot;를 선택합니다. </li><li> 오른쪽 측정 항목 파일을 클릭 한 다음 마이그레이션 매개 변수를 분석 할 수있는 엑셀 같은 프로그램에서 가져올 수있는 텍스트 파일로 내 보냅니다. </li><li> , 촬영 기간 동안 각 셀에 의해 측정 항목 파일에서 &quot;디스플레이&quot;옵션 &quot;포인트&quot;또는 &quot;집단&quot;에서 선택 (모든 트랙이 고유 한 ID를 가지고) ID를 클릭 연속 프레임과 일시 정지 사이의 움직임을 측정합니다. 진행에 의해 생성 된 파일을 내 보냅니다단계 4.10에 설명 된대로 보내고. </li></ol>

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R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone.">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li><li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy.">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li><li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington's+disease.">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain.">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

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RMS를 따라 신경 전구 세포의 효율적인 마이그레이션 기능 신경 (10)에 자신의 후속 성숙을 보장합니다. OB 향하는 신경 전구 세포의 탁월한 스트림은 인간의 초기 단계에 볼 수 있습니다 초기 출생 후의 인간의 두뇌 발달 (27)에 중요한 역할을 할 가능성이있다. 또한,이 세포는 손상과 신경 퇴행의 4,28에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로 할 수 있습니다. 실시간으로 n...

포유 동물의 뇌에 새로운 뉴런 (신경)의 발생은 주로 두 지역에서 출생 후 발생, 해마 1의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 좌우 심실과 subgranular 영역의 subventricular 영역 (SVZ). 최근 몇 년 동안 수집 된 증거는 해마와 후각 망울 메모리 기능 1-3 출생 후 신경을위한 중요한 역할을 지원합니다. 중요한 것은, 출생 후 신경은 치료 때문에 퇴행성 신경 질환과의 관계의 가능성, 뇌 4-6 부상 사이트를 마이그레이션 할 neuroblasts의 능력을 보유하고있다. subventricular 영역 (SVZ)는 최근 중요한 신경성 틈새 시장으로 떠오르고있다. SVZ 파생 neuroblasts이 출생 후의 뇌 -1,7,8,8에서 가장 긴 마이그레이션 프로세스 만들기, 주동이의 철새 스트림 (RMS)를 통해 후각 망울 (OB)를 향해 이동한다. 포유류의 SVZ / RMS / OB 시스템이되고있다이러한 증식, 이동 및 분화 1,8 등의 신경에있는 다른 단계를 공부하는 유용한 모델. 많은 성장 인자와 세포 외 신호는 RMS를 따라 SVZ 신경과 이동을 조절하지만, 세포 내 분자 메커니즘은 지금까지 완벽하게되는 1.9을 이해합니다. RMS에 따라 적절한 이주 신생아 뉴런 (10)의 연속적인 성숙을 위해 매우 중요합니다. 또한, 일부 연구는 SVZ 파생 neuroblasts가 뇌 손상 사이트 4-6,11-13에 RMS 밖으로 마이그레이션 할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 신호 전달 메커니즘의 조절 neuroblast 마이그레이션을 조사하는 것은 신경을 이해할뿐만 아니라 기본적인뿐만 아니라 잠재적 인 치료 응용 프로그램입니다. 여기, 우리는 생체 내 출생을 전기 SVZ 신경 전구 세포를 라벨 및 시간 경과 회전 디스크 공 촛점 microsco를 사용하여 급성 뇌 슬라이스 문화의 RMS를 따라 그들의 이동을 감시하기위한 세부 프로토콜을 설명평. 일렉트로 널리 배아에서 성인 단계 (14-18)에 발달 연구에 사용됩니다. 그것은 SVZ 신경 전구 세포를 대상으로 조작 할 수있는 강력한 도구입니다 및 형질 전환 모델 1,15,19,20의 바이러스 성 벡터 또는 생성의 정위 주입 저렴하고 상당히 빠른 대안을 나타냅니다. 그것은 수술을 필요로하고 높은 생존율이없는 비교적 간단한 절차입니다. shRNA를 나에 loxP 시스템이 관심의 유전자를 대상으로하거나 SVZ 조상의 영구 라벨을 달성하기 위해, 따라서 성인 신경 연구 (21, 22)를위한 유용한 도구를 나타내는 데 사용할 수 있습니다 채용 마우스 유전자 모델에서 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로. 그대로 뇌 이미징 RMS의 neuroblast 마이그레이션은 여전히​​ 인해 현재 기술적 한계에 도전합니다. 그러나,이 공정은 적당한 SYST 제공 급성 뇌 조각의 촛점 회전 디스크 경과 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다EM은 밀접하게 약물 조작 (23, 24)에 또한 의무가 생체 내 조건을 닮은. 시간 경과 영상과 생체 출생 일렉트로의 커플 링 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고 뇌의 복구를 촉진하기 위해 새로운 접근 방법의 발전에 기여할 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

subventricular 영역 (SVZ)는 출생 후 뇌의 주요 신경 인성 틈새 시장 중 하나입니다. 여기에, 신경 전구 세포 증식과 후각 망울 (OB)으로 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 따라 이동할 수 neuroblasts에 상승을 제공합니다. 이러한 장거리 이동은 OB 신생아 신경의 후속 성숙에 필요하지만,이 과정을 조절 분자 메커니즘은 아직 불분명된다. neuroblast 운동성을 조절하는 신호 전달 경로를 조사하는 신경의 기본적인 단계를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라, 부상, 뇌졸중, 또는 변성에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로하도록 neuroblasts의 능력 부여, 치료 회생 가능성이 있습니다뿐만 아니라. 이 논문에서 우리는 생체 내 출생의 일렉트로 마우스 RMS의 neuroblast 마이그레이션 이후의 시간 경과 영상에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 출생 일렉트로 효율적 SVZ 조상 형질 할 수 있습니다다시 RMS를 따라 이주 neuroblasts을 생성하는 세포. 급성 뇌 슬라이스 문화의 디스크 시간 경과 현미경을 회전 공 촛점을 사용 neuroblast 마이그레이션 밀접하게 생체 조건과 유사한 환경에서 모니터링 할 수 있습니다. 또한, neuroblast 운동성 추적 및 정량적으로 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 RMS를 따라 이주 neuroblasts 레이블을 시각화하기 위해 GFP를 발현하는 플라스미드의 생체 내 출생의 전기 충격을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 에 loxP 시스템을 사용하는 조건부 녹아웃 마우스에 shRNA를 또는 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 또한 관심의 유전자를 대상으로 할 수 있습니다. 급성 뇌 슬라이스 배양 물의 약리 조작 neuroblast 이주 다른 시그널링 분자의 역할을 조사하기 위하여 수행 될 수있다. 시간 경과 영상과 생체 전기 충격에 결합함으로써, 우리는 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘을 이해하고 개발에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다소설의, 표준은 뇌의 복구를 촉진하기 위해 접근한다.

SVZ에서 파생 된 철새 neuroblasts의 레이블은 보통 4~8일 성공적인 일렉트로 (그림 1B) 후, RMS 함께 관찰 할 수있다. 긴 시간의 가볼만한 곳으로는 선택 될 수있다, 그러나 대부분은 OB를 입력 때문에 적은 세포는 RMS에서 찾을 수 있습니다. Neuroblasts 정도 2~3주 일렉트로 후 (도시하지 않음) OB에서 성숙 과립 세포의 전형적인 형태와 기능을 습득 시작합니다. ~ 1 시간 동안 배양 한 후, 일렉트로 ...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K 조회수.  King's College London.  Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다. 

비디오: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

연구

신경과학

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.