עבודה זו מומנה על ידי אמון פרויקט גרנט Wellcome הוענק לפ&quot;ד וGL (089236/Z/09/Z). SG נתמכה על ידי ביוטכנולוגיה ומלגת לימודים לתואר שלישי מחקר מדעי הביולוגיה מועצה. אנו מודים למתיו Vermeren על מתנת סוג של וקטור shRNA וג&#39;ניפר Shieh לייעוץ רב ערך על nucleofection neuroblast.

הליך זה הנו בהתאם לתקנות בבריטניה המשרד הביתית (חוק נהלי בעלי החיים מדעיים, 1986). מדענים צריכים לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו ואושרו על ידי ארגוני בעלי החיים שלהם מוסדיים ולאומיים רגולציה. 1. נתיחה ודיסוציאציה של neuroblasts RMS עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הנדרשים לנתיחה RMS ודיסוציאציה: </li></ol> מדיום לנתיחה (100 מיליליטר) תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) - 98.5 מיליליטר 5 M HEPES pH 7.4-0.5 מיליליטר פניצילין, סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מיליליטר ו -10,000 מיקרוגרם / מיליליטר) - 1 מיליליטר בינוני דיסוציאציה (2 מיליליטר) HBSS - 1.760 מיליליטר 10x טריפסין (2.5%) - 200 μl DNAse1 (1 מ&quot;ג / מיליליטר) - 40 μl השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) + 10% עגל בסרום עוברי (FCS) (40 מיליליטר) DMEM -36 מיליליטר FCS - 4 מיליליטר בינוני מלא (12 מיליליטר) בינוני neurobasal - 11.46 מיליליטר תוסף B27 - 250 μl L-גלוטמין (200 מ&quot;מ) - 125 μl גלוקוז (45%) - 165 μl 2. סנן לעקר FCS% DMEM + 10 ובינוניים המלא וpreequilibrate בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב המלטת P6-P7 חולדה (כ 12 גורים) על ידי נקע בצוואר הרחם ולערוף במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך anteroposterior בעור לאורך תפר אמצע sagittal מהאף למוח הקטן עם להב סכין מנתחים. לקלף את העור וחוזר על אותן החתך לאורך הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את דשי גולגולת עם מלקחיים ולהסיר בזהירות את המוח עם מרית, מקפיד לכלול את נורות חוש הריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את שליש הזנב ביותר של המוח וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצץ הרקמת מוח דואר ל1.4 מ&quot;מ פרוסות העטרה עבה באמצעות מסוק רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסות במאכלים המכילים מדיום לנתיחה קרה ולהפריד ביניהם בזהירות באמצעות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RMS מופיע כמשולש, אזור שקוף במרכז חלקי OB וכשטח קטן, עגול בפרוסות מוח הזנב יותר. חותכים את RMS מכל פרוסה עם סכין microsurgical, מקפיד להימנע מלכלול רקמה שמסביב. בגורי החולדה P7, בדרך כלל ~ 8 פרוסות מקורי ביותר (כולל OB) מכילות RMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את שברי RMS עם פיפטה פסטר מפלסטיק ומניח אותם בצלחת קטנה המכילה מדיום לנתיחה קרה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הנתיחה הושלמה, להעביר את שברי RMS לתוך צינור 15 מיליליטר עם טפטפת פלסטיק. עזוב את הברים להתיישב בחלק התחתון של הצינור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסוציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום לנתיחה עם 2 מיליליטר של מדיום דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate ברי RMS בעדינות על ידי pipetting ההשעיה הבר למעלה ולמטה על 10x באמצעות פיפטה P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצינור עם שברי הרקמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את הפתרון שוב 10x ולהבטיח כי שברים שניתקו (ההשעיה צריכה להיות מעונן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב433 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בaliquot בינתיים את הכמות הנדרשת של siRNA / דנ&quot;א לתוך צינורות Eppendorf (בדרך כלל 3-5 DNA מיקרוגרם / shRNA או 5-9 אוליגו siRNA מיקרוגרם לnucleofection, עם זאת כמות ה-DNA / siRNA עשויה לדרוש אופטימיזציה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני עודפת וresuspend התא גלולה על ידי pipetting העדין ב 5 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים. מצפה ~ 1 x 10 6 תאים למוח גור חולדה. מינימום של 2.5 x 10 6 תאים נדרשים לכל nucleofection, בעודתוצאות אופטימליות מושגות באמצעות 3-4 x 10 6 תאים לכל nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב433 XG במשך 5 דקות. הקפד להסיר כמה שיותר בינוני ככל האפשר. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד resuspend התא גלולה בחולדה (או עכבר, אם תוך שימוש בתאי עכבר) פתרון nucleofection נוירון מודגרות בעבר בטמפרטורת חדר. השתמש לnucleofection 100 μl הערה:. בדרך כלל המלטת עכברים של 12 גורים היא מספיק כדי לבצע 4 nucleofections והמלטת עכבר (12 גורים) היא מספיק כדי לבצע 2 nucleofections. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה התא 100 μl לכל צינור Eppendorf המכיל siRNA / DNA ומערבבים בעדינות 2-3x ידי pipetting עם טפטפת P200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את המדגם (ההשעיה cell-DNA/siRNA) לחלק התחתון של nucleofectioncuvette, לטפל כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nucleofect באמצעות תכנית ה-G-013 (לתאי חולדה) או O-005 (עבורתאי עכבר). nucleofection אחד לוקח כ 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות להוסיף 1 מיליליטר של DMEM + FCS 10% prewarmed מדגם nucleofected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.4 ו2.5 לכל דוגמאות אחרות. הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, ההליך כולו nucleofection צריך להימשך לא יותר מ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל מדגם לצינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של DMEM + 10% FCS prewarmed באמצעות פיפטה הפלסטיק הניתנת על ידי ערכת nucleofection. הימנע מהעברה כל פסולת הסלולר לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 433 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל המדיום העודף וresuspend את הכדור ב25-30 μl של DMEM + 10% FCS prewarmed באמצעות פיפטה P20. אין להשתמש יותר מ 30 μl של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה כמו טיפה על הצד הפנימי של מיכסה צלחת P35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה על צלחת P35 המכילה 2 מיליליטר של מדיום שלם (ראה גם איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר בחממה (CO 2 37 ° C / 5%) בשעה 5 לפחות ועד 7 שעות. זמן דגירה ארוך יותר מאפשר reaggregation טוב יותר של צבירי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הטיפות התלויות מהמכסה לתוך המדיום השלם בצלחת באמצעות פיפטה P1000 עם קצה חתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C / 5% CO 2 למשך 24 שעות לnucleofections DNA ו48 שעות לnucleofections siRNA / shRNA. </li></ol> 3. הטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מלא (25 מיליליטר) וpreequilibrate זה על 37 ° C / 5% CO 2 למשך כמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את aliquots הקפואים של מטריצת קרום במרתף ממקפיא -80 ° C ו להפשיר על קרח בחדר הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל nucleofection להכין צלחת 6 סנטימטר המכילה עד שמונה coverlips סטרילי 13 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים בתיבת קרח מכוסים בניילון. זה חשוב כדי לשמור על coverslips מגניב כדי למנוע התמצקות מטריקס במהלך הליך ההטבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על לחות, במקום רצועה של רקמה לחה בתוך צלחת 15 סנטימטר כי wחולה לשמש כדי להחזיק עד שלוש מנות 6 סנטימטר המכילות neuroblasts המשובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני מלא למטריצה ​​מופשרת ביחס 1:3. לדוגמא, לערבב 40 μl של מדיום להשלים עם 120 μl של מטריצה ​​על ידי pipetting. סכום זה של מטריצה ​​מספיק להטבעת מצרפים על שמונה coverslips 12 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צבירי תאי reaggregated לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 433 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני עודפת וresuspend את הכדור ב10 μl של מדיום שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 μl של השעיה המצרפי תא על coverslip כל סטרילי ולהוסיף 18 μl של מטריצה ​​/ תערובת בינונית מלאה. השתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את המטריצה ​​על כל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד מניח את צלחת 6 סנטימטר המכילה coverslips בצלחת 15 סנטימטר ולהשאיר בחממה (CO 2 37 ° C / 5%) ל15-20 דקות. כאשר המטריצה ​​יש הקרושה, בעדינות להוסיף 5 מיליליטר בינוני מלא לכל טיפול לקיחת מנה 6 סנטימטר לדחוףאת כל coverslip צף עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 לתת neuroblasts להעביר מתוך אגרגטים התא. </li></ol> 4. 3D הגירת Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות דרושים לimmunostaining. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הבלוק: פתרון לחסום עיזים (50 מיליליטר) בופר פוספט (PBS) - 5 מיליליטר סרום עיזים - 7.5 מיליליטר 10% טריטון X-100-1.5 מיליליטר BSA - 50 מ&quot;ג H 2 O - 36 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון תיקון: תיקון פתרון (100 מיליליטר) Paraformaldehyde (PFA) - 4 גרם זהירות: תמיד להתמודד עם PFA מתחת למכסת מנוע סוכרוז - 20 g (אופציונלי) PBS עד 100 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פלטה חשמלית ותחת בחישה מתמדת לפזר את PFA ב80 מיליליטר PBS נשמר ב65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שPFA נמס, להוסיף 20 גרם של סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל-pH7.4 (בדרך כלל על ידי הוספה ~ 60 μl 1 M NaOH לפתרון 100 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא עד נפח כולל של עם PBS 100 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח coverslips בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coverslips עם PBS 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מצרפי neuroblast RMS עם פתרון תיקון ל45 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coverslips עם 3x PBS (5 דקות / לשטוף - על פלטפורמת נדנדה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום לדקות 30-60 עם פתרון לחסום עז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים עיקריים בפתרון לחסום עז ודגירת הלילה בשעה 4 ° C. (אם תרצו, phalloidin ניאון (1:400) ולצבוע Hoechst (1:10,000) ניתן גם להוסיף לפתרון הנוגדן הראשוני לדמיין אקטין וגרעיני פילמנטיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coverslips עם PBS 3x (5 דקות / לשטוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים משני בפתרון לחסום עז ודגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coversliנ.ב. עם 3x PBS (5 דקות / לשטוף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips עם מדיום הרכבה ניאון ולהשאיר לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות של אגרגטים neuroblast RMS קבועים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 10X. כולל סרגל קנה מידה בתמונה לדוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את קנה המידה לכימות, למדוד את סרגל קנה מידה בתמונה על ידי בחירה באפשרות &quot;הקו ישר&quot; בסרגל כלי ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האפשרות &quot;לנתח&quot; ולחץ על &#39;קבע את קנה המידה &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון קנה המידה להגדיר את &#39;המרחק הידוע &quot;וסמן את התיבה&#39; הגלובלית &#39;כדי לשמור על אותן ההגדרות לכל המדידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי &#39;הקו מקוטע&#39; בסרגל כלי ImageJ כדי למדוד את המרחק מהקצה של המצרף לneuroblast היגרה הרחוקה ב6 מגזרים שונים ברחבי הצירוף כולו (איור 3). שקול רק AG מבודדתgregates לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מרחק הגירה ממוצע מהערכים 6 התקבלו לכל המצרפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 10-20 מצרפים עבור כל תנאי בכל עצמאי תוצאות ניסוי ובריכה ממינימום של שלושה ניסויים בלתי תלויים. תמיד כולל שליטת nucleofection (למשל. GFP או sh שליטה / siRNA). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Mammalian+Brain:+Significant+Answers+and+Significant+Questions.">Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adult-born+neurons+facilitates+learning+and+and+memory.">Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory.</a> Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Jin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Kim, Y., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+subventricular+zone+stem+cells+after+neuronal+injury.">Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury.</a> Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).</li><li>Massouh, M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-routing+neuronal+precursors+in+the+adult+brain+to+sites+of+injury:+Role+of+the+vasculature.">De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature.</a> Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Neuronal+Migration+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li><li>Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+migration+of+neuronal+precursors.">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Neuronal+Migration+Changes+the+Fate+of+Developing+Neurons+in+the+Postnatal+Olfactory+Bulb.">Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Battista, D., Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polysialic+Acid+Triggers+Dispersion+of+Subventricularly+Derived+Neuroblasts+into+Surrounding+CNS+Tissues.">Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues.</a> J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).</li><li>Conover, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Eph/ephrin+signaling+affects+migration+and+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone.">Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone.</a> Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).</li><li>Mobley, A. K., McCarty, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta+8+Integrin+is+Essential+for+Neuroblast+Migration+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream.</a> Glia. 59, 1579-1587 (2011).</li><li>Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+slits+in+the+control+of+cell+migration+in+the+rostral+migratory+stream.">Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).</li><li>Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+regulates+migration+of+olfactory+interneuron+precursors+in+the+rostral+migratory+stream+through+Met-Grb2+coupling.">Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling.</a> J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).</li><li>Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+signaling+in+postnatal+neurogenesis:+The+first+leg.">Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg.</a> Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).</li><li>Dityateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+electroporation-based+gene+transfer+into+primary+dissociated+neurons.">Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons.</a> J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).</li><li>Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Regulates+Cell+Soma+Translocation+and+the+Distribution+of+Adhesion+Proteins+in+Migrating+Neurons.">Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons.">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e2373 (2011).</li><li>Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+primary+neurons.">Nucleofection of primary neurons.</a> Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).</li><li>Causeret, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p21-Activated+Kinase+Is+Required+for+Neuronal+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).</li><li>Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+knockdown+of+neuropilin-1+in+the+developing+chick+nervous+system+by+siRNA+hairpins+phenocopies+genetic+ablation+in+the+mouse.">Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse.</a> Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li><li>Ward, M., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+neuronal+migration+in+the+central+nervous+system.">Investigations of neuronal migration in the central nervous system.</a> Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Selection+for+High-Expression+Transfectants+with+a+Novel+Eukaryotic+Vector.">Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Acute+Slices+of+the+Adult+Mouse+Forebrain.">Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Vis. Exp. , e4061 (2012).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling.">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Vessels+Form+a+Migratory+Scaffold+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li><li>Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Postnatal+Electroporation+and+Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Mouse+Acute+Brain.">In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain.</a> J. Vis. Exp. , (2013).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation.">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ההגירה של neuroblasts לאורך RMS למיקום הסופי בOB היא צעד מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. עם זאת, המנגנונים המולקולריים השליטה תהליך מורכב זה הם רחוק מלהיות מובן במלואו. הליך הניסוי המתואר כאן מאפשר הלימוד של הגירת neuroblast במבחנה. יש לנו להתאים פרוטוקול שפורסם בעבר לבידוד neuroblasts RMS מתחילת עכבר או חולדה 25 לאחר לידה. כדי להשיג תוצאות אופטימליות חשוב להשתלט על הצעד לנתיחה, שכן הוא חיוני כדי לשמור על מרווח הזמן בין הנתיחה וnucleofection למינימום. לאחר nucleofection, ניתן reaggregated neuroblasts, משובץ במטריצה ​​תלת ממדית והשאיר להגר על פני תקופה hr 24. לחלופין, למטרות אחרות מהגירה (למשל immunofluorescence או ניתוח כתם מערבי), תאים יכולים להיות מצופים מייד לאחר nucleofection על polyornithine/laminin-coverslips מצופה, שבו הם ישרדו עד 4-5 ימים. neuroblasts העכבר והחולדה להעביר בMatrigel במידה דומה, עם זאת תאי עכבר מופיעים יש נטייה חזקה יותר להעברה ברשתות מאשר תאי חולדה. בהתאם למטרה של המחקר, ניתן nucleofected neuroblasts עם פלסמידים שונים קידוד חלבוני ניאון או חלבונים מסוג / מוטציה פראיות של עניין. לפלסמידים ביטוי חלבון אופטימליים עם אמרגן CAG (אמרגן β-אקטין עם משפר CMV ו poly-זנב גלובין β) 26 מומלצים ביותר. יתר על כן, ניתן nucleofected oligos siRNA או פלסמידים shRNA למציאת מטרות של עניין. דלדול חלבון יעיל ניתן דמיינו ידי immunofluorescence או על ידי כתם מערבי (בדרך כלל lysing אגרגטים מוטבעים מגור חולדה 1 עם 50 μl של חיץ תמוגה הסטנדרטי). Nucleofection הוא שיטה פשוטה יחסית לtransfect neuroblasts הראשונית, מציע אלטרנטיבה קלה יותר ומהירה יותר לVItransfection RAL וקטור בתיווך, והוא יכול להשיג יעילות transfection (~ 70-80%) גבוהה. זה קריטי כדי לעבוד במהירות במהלך הליך nucleofection, מאז שעזב את neuroblasts בפתרון nucleofection במשך זמן ממושך באופן דרסטי מפחית את כדאיויות תא. תשואת התא הממוצעת מנתיחת RMS היא נמוכה יחסית לעכברי P7 (~ 5 x 10 5 תאים / מוח) בהשוואה לחולדות P7 (~ 1 x 10 6 תאים / מוח) ולפחות 3 x 10 6 תאים לכל nucleofection נדרשים כדי להשיג transfection עם ~ 50% ביעילות. יתר על כן, neuroblasts העכברוש מופיעה להתנגד עדיף nucleofection לעומת neuroblasts עכבר. לכן, גורי חולדה לאחר הלידה מוקדמת (P6-P7) עשויים לייצג מקור neuroblast נוח, גם בהתחשב בכך שהארגון של RMS חולדה והעכבר להפליא סימי27 lar וכי היקף הגירת neuroblast חולדה ועכבר במבחנה הוא גם דומה. רצוי לא לשמור את אשכולות reaggregated של neuroblasts nucleofected בהשעיה לזמן רב יותר מאשר 48 שעות כדי למנוע תופעות חריגות על מורפולוגיה של תאים והגירה (התצפיות שלא פורסמו שלנו). Assay 3D המתואר כאן יכול לשמש כדי לכמת הגירת neuroblast בנקודת זמן קבועה לאחר ההטבעה במטריצה ​​(למשל. 24hr). אגרגטים בגדלים שונים ניתן להשתמש בניתוח, שכן אין קשר מובהק בין הגודל של אגרגטים ומרחק הגירה (תצפיות שלא פורסמו שלנו). כדי להמחיש עוד יותר לחקור את הדינמיקה של הגירת neuroblast, ניתן להשתמש בהדמיה הזמן לשגות. מומלץ לבצע את ניתוח ההגירה בתוך מרווח שעות 24 לאחר ההטבעה, שכן המהירות של neuroblasts מופיעה כדי להקטין באופן דרסטי בנקודות זמן ארוכות יותר (תצפיות שלא פורסמו שלנו). &lt;/ P&gt; ישנן מספר מגבלות לפרוטוקול זה. ראשית, nucleofection יכול עד כה לשמש לneuroblasts המכרסם לאחר לידה המוקדמת, ואילו זיהום עם וקטורים ויראליים נשאר השיטה transfection היעילה ביותר לneuroblasts המבוגר 28. שנית, במבחנה assay ההגירה לא לשחזר באופן מלא את הארכיטקטורה המורכבת של RMS נצפה in vivo. ואכן, למרות שneuroblasts לשמור על היכולת להעביר באופן דומה לin vivo עמיתיהם, בהגדרת הניסוי שתוארה כאן חסר להם אינטראקציות עם רכיבי RMS אחרים כגון האסטרוציטים וכלי דם, שגם תורמים לתנועתיות שלהם לווסת 9,29, 30. בעיה זו עלולה להיות מופנה בעתיד על ידי אופטימיזציה של מערכות מודל coculture תלת ממדי. לסיכום, שילוב של nucleofection עם assay הגירת 3D מייצג כלי רב ערך כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיסהגירת neuroblast. הליך ניסיוני זה מספק שיטה ראשונית, מהירה ופשוטה יחסית כדי להעריך את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast, שבו ניתן תוקף נוסף על ידי גישות אחרות כמו in vivo electroporation לאחר הלידה והזמן לשגות הדמיה של תרבויות פרוסה מוח 28,31,32 .

ביונקים לאחר הלידה המוח, הדור של נוירונים חדשים (נוירוגנזה) מתרחש לאורך כל חיים, והוא מוגבל לשתי נישות נוירוגנית: אזור subventricular (SVZ) של החדרים לרוחב ואזור subgranular של gyrus משוננת של ההיפוקמפוס 1. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את התפקיד החשוב של neurogenesis למבוגרים בהנחיית משימות למידה וזיכרון 2,3. יתר על כן, ראיות של התפשטות וגיוס של אבות עצביים בעקבות פגיעה מוחית 4-7 מעלה את האפשרות של הפעלה תרופתית הנוירוגנזה בתיקון עצבי. נוירוגנזה אחרי לידה מוסדרת בקפדנות בכל שלביה, הכוללים ריבוי עצבי אב, הגירה, התמיינות, הישרדות, ואינטגרציה הסינפטי סופית של נוירונים שזה עתה נולד 8. אבות עצביים (neuroblasts) שמקורם בתאי גזע בSVZ נודדים על פני מרחקים גדולים באמצעות הנודדות מקוריזרם (RMS) לכיוון הנורה חוש הריח (OB) שבו הם יבשילו לנוירונים פונקציונליים 9. neuroblasts נודדת הן בעיקר חד קוטבי, עם גוף תא מוארך הארכת תהליך מוביל אחד. תאים אלה עוברים ברשתות באופן קולקטיבי, מחליקים על אחד 10 אחרת. הגירה היא צעד חיוני להבשלה המאוחרת של אבות נגזרים SVZ לנוירונים פונקציונלי 11 ונשלטת על ידי גורמים רבים ומולקולות הנחיה כוללים: מולקולת polysialylated העצבית הידבקות תא (PSA-NCAM) 12, 13 Ephrins, Integrins 14, 15 חרכים, צמיחת גורמי 16 ונוירוטרנסמיטורים 17, לעומת זאת המנגנונים המולקולריים שבבסיס התהליך הזה אינם מובנים במלואם. חוקר את מסלולי איתות תאיים הסדרת הגירת neuroblast לא רק לספק הבנה טובה יותר של neurogenesis למבוגרים, אלא גם יתרום להתפתחות הטיפולית החדשגישות לקידום תיקון מוח. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ללמוד את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast במבחנה באמצעות nucleofection וassay הגירת 3D. Nucleofection הוא טכניקת transfection תא המבוססת על שיטה משופרת של electroporation. הנוכחי תאים מהסוג ספציפי חשמל ופתרון nucleofection לאפשר ההעברה של מקרומולקולות polyanionic כגון וקטורי DNA וshRNA וoligonucleotides siRNA ישירות לתוך גרעין התא וtransfection היתר של החלוקה לאט או mitotically תאים פעילים כמו תאי עצב עובריים ויונקים 18. שיטה זו היא מהירה, קלה יחסית לביצוע והתוצאות בtransfection השחזור מאוד של מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי עצב וneuroblasts 19-21 העיקריים. דיסוציאציה של רקמת RMS מאפשרת הבידוד של neuroblasts נודד, אשר ניתן nucleofected בהצלחה עם ה-DNA / SHRוקטורי NA או oligos siRNA מיקוד גנים של עניין. בעקבות nucleofection, neuroblasts הם reaggregated בתליית טיפות ומשובצות לאחר מכן במטריצת Matrigel תלת ממדי. תנאים אלה מאפשרים neuroblasts להגר אל מחוץ לאגרגטים התא משחזרים את מצב ההגירה נצפה in vivo, ובכך לספק מערכת מודל מצוינת לחקור מסלולי איתות מעורבים בהגירה neuroblast ולהעריך את השפעתם של טיפולים תרופתיים בתנועתיות של תאים אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

אזור subventricular (SVZ) הממוקם בקיר לרוחב של החדרים לרוחב ממלא תפקיד מהותי בneurogenesis למבוגרים. באזור מוגבל זה של המוח, תאי גזע עצביים להתרבות וליצור כל הזמן neuroblasts שנודדים בנקודת השקה ברשתות לאורך הנחל מקורי נודד (RMS) כדי להגיע לנורת חוש הריח (OB). פעם אחת בOB, neuroblasts לעבור להגירה רדיאלי ולאחר מכן להתמיין לתאים בוגרים מסוגלים לשלב ברשת העצבית שכבר קיימת. הגירת neuroblast הנכונה היא צעד מהותי בנוירוגנזה, על מנת להבטיח את ההבשלה הפונקציונלית הנכונה של נוירונים יילוד. בהתחשב ביכולת של neuroblasts נגזר SVZ להתמקד באזורים פגועים במוח, חוקר את המנגנונים תאיים בבסיס תנועתיות שלהם לא רק לשפר את ההבנה של נוירוגנזה אלא גם עשוי לקדם את הפיתוח של אסטרטגיות neuroregenerative. כתב יד זה מתאר מפורטפרוטוקול עבור transfection של מכרסם העיקרי RMS neuroblasts לאחר לידה והניתוח של תנועתיות שלהם באמצעות במבחנה assay הגירת 3D משחזר מצבם של הגירה ציין in vivo. שתי neuroblasts החולדה והעכבר יכולה להיות במהירות וביעילות transfected באמצעות nucleofection גם עם ה-DNA פלסמיד, סיכת ראש קטן RNA (sh) או התערבות קצרה (si) oligos RNA מיקוד גנים של עניין. כדי לנתח את ההגירה, תאי nucleofected הם reaggregated ב&#39;טיפות תלויות &#39;ולאחר מכן משובץ במטריצה ​​תלת ממדית. Nucleofection כשלעצמו אינו פוגעים באופן משמעותי את ההגירה של neuroblasts. טיפול תרופתי של neuroblasts nucleofected וreaggregated גם ניתן לבצע כדי ללמוד את התפקיד של איתות מסלולים מעורבים בהגירה neuroblast.

Neuroblasts ניתן לבודד בהצלחה מהרקמה הגזורה RMS (איור 1 א) ומשובץ במטריצה ​​תלת ממדית. תאים מבודדים או עכברוש או RMS לאחר הלידה עכבר הם immunopositive עבור סמני neuroblast נודדים, כגון doublecortin, טובולין βIII או PSA-NCAM (איורים 1 ב-C) (DCX). neuroblasts ניתקה ניתן nucleofected ביעילות עם ה-DNA (למשל. פלסמיד ה-GFP-קידוד, איור 2) או פלסמידים shRNA (איור 4) כדי להשיג דלדול חלבון, אשר יכול להיות מוערכים על ידי ניתוח כתם מערבי (איור 4) או immunofluorescence (לא מוצגים) . תאי nucleofected עם פלסמידים קידוד ה-GFP-להגר רדיאלית החוצה אשכולות reaggregated neuroblast (איור 3 א). כימות הודעה היחסית שהועברו מרחק 24 שעות הטבעה (איור 3 ב) לא מראה שום הבדל בהגירה בין ה-GFP-להניח<html> ive תאים ו, תאי ה-GFP-שלילית nonnucleofected (איור 3 ג), המציין כי nucleofection כשלעצמה לא לשבש הגירה. אין גם הבדל משמעותי בהיקף ההגירה בין neuroblasts nucleofected וneuroblasts ישירות נודדת מתוך explants RMS (מידע לא מוצג). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. נתיחה של neuroblasts RMS. (א) ייצוג סכמטי של נתיחת neuroblast RMS. לתיאור מפורט עיינו בטקסט. (ב) תאי RMS החולדה מבודדים הם immunopositive למקבלי neuroblast הנודדים DCX וטובולין βlll. תאים בר, 20 מיקרומטר. (C) נודדים מexplants RMS העכבר לבטא neuroblast נודדת סמני DCX וPSA-NCAM. בר, 20 מיקרומטר.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. nucleofection neuroblast עכבר. הניתק העכבר RMS neuroblasts הייתה nucleofected עם Pmax-GFP, reaggregated, משובצת במטריצה ​​תלת ממדים ואפשרו להגר ל6 שעות. Neuroblasts נודדות מתוך מקבץ תאי reaggregated (למעלה, בתמונות בניגוד שלב) מראות יעילות גבוהה transfection (תחתון, תמונות ערוץ GFP). לוחות העמודה הימני מראים תמונות בהגדלה גבוהות יותר המתאימות לריבועים מודגשים בפנלי העמודה השמאליות. ברים, 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:c<html> ontent-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = /&gt; &quot;500px&quot; איור 3. assay הגירת 3D. () Neuroblasts עכברוש הייתה nucleofected עם Pmax-GFP (GFP) או pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, משובץ במטריצה ​​והשאיר להגר ל24 שעות. תאים אז היו קבועים immunostained עבור ה-GFP (ירוק) וטובולין βIII (אדום). בר, 50 מיקרומטר. (ב) מדידת מרחק הגירה באמצעות ImageJ. אשכול תא reaggregated מחולק 6 מגזרים שווים. המרחק בין הקצה של האשכול (קו מקווקו) והתא היגר הרחוק נמדד עבור כל מגזר. כימות (ג) למרחק היחסי היגרה ידי תאי nucleofected, תאי nonnucleofected (GFP חיובי) ובקרה (ה-GFP-שלילית) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="&lt;/ Html">&quot;איור 4&quot; עבור: תוכן width = &quot;6in&quot; רוחב src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; = /&gt; &quot;500px&quot; איור 4. ניטור נדידת neuroblast לאחר nucleofection shRNA. () Neuroblasts עכברוש הייתה nucleofected עם וקטור שליטת shRNA (PCA-B-EGFPm5 משתיק 3, שמבטא גם EGFP 23) או את אותו וקטור המכיל, חלבון bundling-אקטין shRNA מיקוד fascin 24. תאים היו reaggregated מעל 48 שעות, משובץ במטריצה ​​והשאירו להגר ל24 שעות. מצרפים אז היו קבועים immunostained עבור ה-GFP (ירוק) וטובולין βIII (אדום). fascin האפקטיבי בר, 50 מיקרומטר. (B) דלדול ניתן לאתרם 50 שעות לאחר shRNA nucleofection על ידי ניתוח כתם מערבי. אקטין מוצג כאן כביקורת טעינה (ג) ניתוח כמותי של מרחק הגירה יחסי מראה כי דלדול fascin פוגע הגירת neuroblast באופן משמעותי. (ממוצע ± SEM; ** p &lt;0.01, n = 3 ניסויים בלתי תלויים). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro at JoVE.com

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

הגירת neuroblast היא צעד חיוני בנוירוגנזה לאחר לידה. הפרוטוקול מתואר כאן ניתן להשתמש בם כדי לחקור את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast ידי העסקת nucleofection DNA / RNA סיכת הראש קטן (shRNA) וassay הגירת 3D עם neuroblasts מבודדת מהזרם הנודדות מקורי לאחר הלידה המכרסם.

Nucleofection של neuroblasts מכרסמים לחקר הגירת neuroblast<em&gt; במבחנה</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

11.3K Views.  King's College London.  הגירת neuroblast היא צעד חיוני בנוירוגנזה לאחר לידה. הפרוטוקול מתואר כאן ניתן להשתמש בם כדי לחקור את התפקיד של רגולטורים מועמד של הגירת neuroblast ידי העסקת nucleofection DNA / RNA סיכת הראש קטן (shRNA) וassay הגירת 3D עם neuroblasts מבודדת מהזרם הנודדות מקורי לאחר הלידה ה...

Video: Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

עכבר המוח האחורי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר הגירת Branchiomotor Neuron פנים

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...