אנו מודים לד"ר ארווינתן סמואל ומארק גרשו שעזרו לפתח את הגרסה הראשונית של המנגנון ההתנהגותי ומתיו באטי ששינה את המנגנון ההתנהגותי. מחקר זה נתמך על ידי נאמן גרנט מבית החולים לילדים בסינסינטי, JST / PRESTO, מרץ של דימס ו NIH R01 GM107582 כדי F.N.H.

1. הכנת זבובים
<ol><li>ניסויים בחושך בהיר (LD)
	<ol>
<li>העלה זבובים באינקובטורים (25 °C/40-60% לחות יחסית (RH)) תחת אור 12 שעות / כהה 12 שעות (LD) מחזורים. עוצמת האור של האינקובטורים היא ~ 500-1,000 לוקס.</li>
		<li>שתי אינקובטורים נחוצים כדי להשלים את מבחני ההתנהגות על פני תקופה של 24 שעות. שתי האינקובטורים צריכים להיות אור לתכנות עם פונקציות ON OFF. הם צריכים גם דלתות מוצקות שאינן חדירות לאור(כלומר אין זכוכית או פרספקס). הערה: חממה אחת צריכה להיות מוגדרת חממה "יום" ולהגדיר מחזור LD של 12 שעות אור 12 שעות כהה. החממה השנייה צריכה להיות מוגדרת חממה "לילה" ולהגדיר את ההופכי של הראשון עם 12 שעות כהה ואחריו אור 12 שעות. חממת הלילה חייבת להיות ממוקמת בחדר הנגיש בחושך, באופן כזה זבובים חווים תנאי לילה ניתן לגשת בקלות לניסויים.</li>
		<li>מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטורים ביום או בלילה. לאסוף זבובים שזה עתה בקעו בקבוקון טרי, 20-30 לכל מבחנה ולשמור באותה אינקובטור במשך 2-3 ימים.</li>
		<li>לאחר 2-3 ימים, יש להשתמש בזבובים לבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה.<ol>
<li>לניסויי יום (זמן צייטגבר (ZT) 0-12), יש לאסוף זבובים מהחממה היומית.</li>
			<li>ממש לפני הניסויים ההתנהגותיים, הוציאו את בקבוקוני הזבוב שנאספו מהחממה היומית.</li>
			<li>לניסויים ליליים (ZT 13-24), יש לאסוף זבובים מהחממה הלילית.</li>
			<li>ממש לפני הניסויים ההתנהגותיים, מוציאים את בקבוקוני הזבוב שנאספו מהחממה הלילית, עוטפים בנייר אלומיניום ומניחים בקופסה בחדר החשוך מתחת למנורה אדומה. הערה: מכיוון שבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה מתבצעת בחשיכה לניסויי הלילה, יש למנוע חשיפה לאור לזבובים עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים. הערה: הזבובים לא צריכים להיחשף לפחמן דו חמצני ביום הניסויים הם להתקיים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ניסויי חושך מתמיד (DD)
	<ol>
<li>
יום DD
		<ol>
<li>חממה נוספת נחוצה לניסויי יום DD, שאנו מכנים חממת "מעבר" לשאר כתב היד. חממת המעבר חייבת להיות ממוקמת בחדר הנגיש בחושך, באופן כזה זבובים חווים תנאי DD ניתן לגשת בקלות לניסויים. לוח זמנים קל לדוגמה עבור חממת מעבר ידליק את האור בין השעות 13:00-19:00 ואת האור כבוי בשעה 19:00-13:00(איור 1).</li>
			<li>לאסוף את הזבובים אשר גדלו באינקובטור היום. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטור המעבר בין 13:00-19:00, כאשר האור דולק. בדרך זו, הזבובים חשופים כראוי לאור עד השעה 19:00, אז האור נכבה.</li>
			<li>למחרת, לפני השעה 13:00, בתנאים כהים, מוציאים את בקבוקוני הזבוב מהחממה, עוטפים אותם בנייר אלומיניום ומניחים אותם בקופסה. שמור את הקופסה בכל אינקובטור לעוד יום אחד.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
לילה DD
		<ol>
<li>לאסוף את הזבובים אשר גדלו באינקובטור הלילה בחושך תחת מנורה אדומה. או בנוסף לאסוף את הזבובים כאשר אור החממה של הלילה דולק.</li>
			<li>לעטוף בקבוקונים שנאספו עם רדיד אלומיניום בחושך בכל פעם שהאורות כבויים ומניחים את הבקבוקונים בקופסה. שמור את התיבה בכל חממה למשך יומיים נוספים(איור 1B). הערה: מכיוון שבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה מתבצעת בחשיכה לניסויי הלילה, יש למנוע חשיפה לאור לזבובים עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ניסויי אור קבוע (LL)
	<ol>
<li>
יום LL
		<ol>
<li>אינקובטור נוסף נחוץ לניסויי יום LL. חממה זו שומרת על מצב LL (25 °C (70 °F, 800 לוקס), עם האור על ברציפות.</li>
			<li>לאסוף זבובים אשר גדלו באינקובטור היום. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטור LL בכל עת במהלך "היום" שלהם.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
לילה LL
		<ol>
<li>לאסוף זבובים אשר גדלו באינקובטור הלילה. מעבירים את בקבוקוני הזבובים מהחממה הלילית לחממה LL בזמן שהאור באינקובטור הלילה דולק. הערה: לדוגמה, האור נכבה בשעה 7 בבוקר באינקובטור הלילה. מעבירים את בקבוקוני הזבובים מהחממה הלילית לחממה LL לפני השעה 07:00 ושומרים את הבקבוקונים באינקובטור LL למשך 4 ימים נוספים. הערה: ביום 4 בתנאי LL, התנודות של פעילות לוקומוטור מבוטלת15,16, בעוד TPR הוא עדיין מתמשך 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. המנגנון לבדיקה התנהגותית העדפת טמפרטורה
<ol><li>הניחו כיסוי פרספקס (29 ס"מ על 19.2 ס"מ) (איור 4)על לוח אלומיניום.</li>
	<li>לפקח על טמפרטורת האוויר בין הצלחת לבין הכיסוי. שש בדיקות טמפרטורה מחוברות בתנוחות שונות בחלק הפנימי של המכסה בתוך אחד הנתיבים(איור 2). הערה: ודא שהבדיקות אינן נוגעות בצלחת האלומיניום או בכיסוי הפלקסיגלס. טמפרטורת האוויר צריכה להיות מוגדרת שיפוע מ 18-32 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הנח את המנגנון בחדר סביבתי המתוחזק ב 25 °C (65 °F) - 75% RH. צריך לאטום את החדר הזה מכל אור חיצוני. חדר סביבתי מצויד בדרך כלל במאווררים כדי לשמור על טמפרטורה ולחות מסוימות. הערה: סביר להניח שהאוויר מהמאוורר מפריע לשיפוע טמפרטורה יציב במנגנון. כדי למנוע זאת, אנו משתמשים בגיליון שקוף המכסה את האזור המקיף את המנגנון.</li>
	<li>הכינו מדחום ומד לחות לבדיקת הטמפרטורה והלחות בחדר הסביבתי. הערה: אור משפיע על העדפת הטמפרטורה של Drosophila3. אותה עוצמת אור צריכה להיות מסופקת על המנגנון באופן אחיד. עוצמת אורות החדר הסביבתי שלנו היא ~ 800 לוקס. הערה: כאשר הניסויים ההתנהגותיים נעשים, למקם צינור מחובר ממיכל CO2 או לספק ליד החור של החלק העליון של המנגנון על מנת להרדים להיפטר הזבובים.</li>
</ol>3. הכנת מנגנון לשימוש
<ol><li>הפעל את המנגנון למשך 30 דקות לפחות כדי לקבוע את שיפוע הטמפרטורה כראוי על פני הצלחת (איור 3).</li>
	<li>מעיל את הכיסוי של מנגנון ההתנהגות עם דוחה מים כדי למנוע זבובים לטפס על הקירות או התקרה של הכיסוי. לנגב את עודף המים דוחה ולהשאיר את הכיסוי במשך 25-30 דקות לייבוש.</li>
	<li>הסר כל עיבוי על צלחת האלומיניום. מניחים את כיסוי הפלקסיגלס על לוח האלומיניום ומאובטחים בשישה מהדקי C(איור 2). הערה: חשוב מאוד שהכיסוי יהיה אטום היטב, במידת הצורך ניתן להשתמש בסרט הדבקה כפול.</li>
	<li>השאירו את הכיסוי לפחות 15 דקות. שיפוע טמפרטורת האוויר בין צלחת האלומיניום לכיסוי נוצר מ 18-32 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. בדיקת התנהגות העדפת טמפרטורה
<ol><li>העמיסו את הזבובים לחלל שבין לוח האלומיניום לכיסוי הפלקסיגלס של המנגנון דרך חורים קטנים במרכז כל נתיב של העטיפה(איורים 2 ו-4). לכסות את החורים עם תלושי כיסוי כדי למנוע את הזבובים לברוח.</li>
	<li>לתנאים האפלים, כבו את כל האורות בחדר הסביבתי. מנורה אדומה יכולה לשמש כאשר הזבובים ממוקמים לתוך המנגנון. ודאו שהזבובים אינם חשופים לאורות מלבד מנורה אדומה עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים.</li>
	<li>עבור כל ניסיון, השתמש 20-25 זבובים מבוגרים, אשר אין לעשות בהם שימוש חוזר בניסויים הבאים. ההסתעפות ההתנהגותית מבוצעת במשך 30 דקות. צלם כמה תמונות עם או בלי הבזק. היזהר לא לעשות הרבה רעש או כל תנועות פתאומיות במהלך הניסויים.</li>
	<li>רשום את הטמפרטורה של כל ששת הבדיקות במנגנון. שימו לב לטמפרטורת החדר, כמו גם ללחות.</li>
	<li>הרדמה את הזבובים במנגנון עם גז פחמן דו חמצני, לשחרר את המהדקים, להסיר את כיסוי plexiglass, ולהסיר את הזבובים מהצלחת. לאחר כל ניסוי, הזבובים מושלכים. לנגב כל עיבוי או לחות מהצלחת. החלף את הכיסוי על הצלחת והדק עם המהדקים כהכנה לניסוי הבא.</li>
	<li>על מנת לקבל ייצוג של העדפת הטמפרטורה לאורך כל היום, פרק הזמן של 24 שעות מחולק לשמונה אזורי זמן, ארבעה במהלך היום וארבעה בלילה. לדוגמה, אנו משתמשים ב- ZT או CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ו- 22-24. הערה: מאחר ווריאציות פנוטיפ הנגרמות על-ידי אפקטי מיסוך צפויות מיד לאחר הפעלת האור (ZT0) או כבוי (ZT12), איננו בוחנים את התנהגות העדפת הטמפרטורה בזמנים אלה (ZT או CT 0-1, 11.5-13 ו- 23.5-24). לפחות חמישה ניסויים חייבים להיעשות בכל אזור זמן כדי שהתוצאות יהיו מבוססות סטטיסטית.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>חישוב מעבר הטמפרטורה באופן הבא: קבע היכן ממוקמות בדיקות הטמפרטורה בהתבסס על שני הסרגלים הממוקמים בצד העליון והתחתון של כיסוי הפלקסיגלס לאורך הקצוות (איור 2A).</li>
	<li>שיפוע הטמפרטורה בין בדיקות הטמפרטורה מוערך להיות ליניארי. בהתבסס על המיקומים של בדיקות הטמפרטורה, כמו גם הטמפרטורות המתועדות המתאימות שלהם, לצייר קווים המייצגים כל דרגה של טמפרטורה במיקום המתאים על התמונות. ספור את מספר הזבובים הממוקמים בכל מרווח מעלות. אל תכלול זבובים על הקירות או על תקרת המכסה.</li>
	<li>חשב את אחוז הזבובים בכל טווח טמפרטורות של כל נתיב. טמפרטורה מועדפת ממוצעת מחושבת על-ידי סיכום המוצרים של אחוז הזבובים והטמפרטורה של כל מרווח, כפי שמוצג להלן: % של זבובים x 18°C + % זבובים x 19°C + % של זבובים x 20 °C (70 °F) ....+ % של זבובים x 31 °C (69 °F + % של זבובים x 32 °C (69 °F).</li>
	<li>חישוב הטמפרטורה המועדפת הממוצעת בכל אזור זמן: התנהגות העדפת טמפרטורה מתבצעת >5 פעמים בכל אזור זמן (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ו- 22-24). כדי לחשב את הטמפרטורה המועדפת הממוצעת בכל אזור זמן, הטמפרטורה המועדפת הממוצעת של כל ניסיון ממוצעת יחד. קווי השגיאה של s.e.m. שווים לשגיאה בין הניסיונות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment.">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view.">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li><li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila.">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li><li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila.">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li><li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+hot+and+cold:+behavioral+strategies,+neural+circuits,+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila..">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila..</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila.">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li><li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Thermal+preference+in+Drosophila.">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and.">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li><li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain.">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li><li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms.">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li><li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+rhythm+of+body+temperature.">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li><li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people.">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li><li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms.">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li><li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants.">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li><li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function.">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li><li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+sleep.">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li><li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit.">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li></ol>

אין מה לחשוף.

כאן, אנו ממחישים את הפרטים של מנגנון התנהגות העדפת הטמפרטורה וניתוח של התנהגות TPR. דרוזופילה מציגה את המאפיינים הבולטים, החזקים והניתנים לשחזור של TPR הנשלט על ידי השעון. עם זאת, הנתונים שלנו מראים כי לפחות שני גורמים, אור הסביבה וגיל, להפריע באופן משמעותי פנוטיפים התנהגותיים TPR.
<p class="...

טמפרטורה היא רמז סביבתי בכל מקום. בעלי חיים מפגינים מגוון התנהגויות על מנת למנוע טמפרטורות מזיקות ולחפש טמפרטורות נוחות. Drosophila להפגין התנהגות העדפת טמפרטורה חזקה6,7. כאשר זבובים משתחררים לתוך שיפוע טמפרטורה מ 18-32 מעלות צלזיוס, הזבובים להימנע הן טמפרטורות חמות וקרות ולבסוף לבחור טמפרטורה מועדפת של 25 מעלות צלזיוס בבוקר3. חיישני הטמפרטורה החמים הם קבוצה של נוירונים תרמוסנסוריים, נוירונים AC, אשר מבטאים Drosophila פוטנציאל קולטן ארעי (TPR) ערוץ, TRPA16,9. חיישני הטמפרטורה הקרה ממוקמים בקטעי האנטנה השלישית, שכן בלימת מקטעי האנטנה השלישית גורמת לחוסר הימנעות טמפרטורה קרה6. לאחרונה, חלבון TRPP Brivido (Brv) זוהה10. מכיוון ש-Brv מתבטא בקטעי האנטנה השלישית ומתווך בזיהוי קר, Brv היא מולקולת חישה קרה אפשרית, שהיא קריטית להתנהגות העדפת הטמפרטורה. לסיכום, הזבובים משתמשים בשני חיישני טמפרטורה אלה כדי למנוע את הטמפרטורות החמות והקרות ולמצוא טמפרטורה מועדפת.
בעוד יונקים ליצור חום כדי לווסת את טמפרטורת הגוף שלהם, ectotherms בדרך כלל להתאים את טמפרטורות הגוף שלהם לטמפרטורתהסביבה 11. כמה ectotherms ידועים להפגין התנהגות TPR יומי אשר הוא האמין להיות אסטרטגיה עבור ectotherms לווסת BTR שלהם12. כדי לקבוע אם הזבובים הציגו TPR, חזרנו על ניתוח התנהגותי העדפת הטמפרטורה בנקודות שונות במהלך טווח של 24 שעות. מצאנו כי Drosophila התערוכה TPR יומי, אשר נמוך בבוקר וגבוה בערב ועוקב אחר דפוס דומה לזה של BTR בבני אדם13.
ב Drosophila, ישנם ~ 150 נוירונים שעון במוח. נוירוני השעון המווסתים את פעילות הלוקומוטור נקראים מתנדים M ו- E. עם זאת, מעניין, מתנדים M ו- E אינם מווסתים TPR, במקום זאת, הראינו כי נוירונים שעון DN2 במוח לווסת TPR אבל לא פעילות לוקומוטור. נתונים אלה מצביעים על כך ש- TPR מוסדר באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור. יש לציין, BTR יונקים מוסדר גם באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור. מחקרי אבלציה בחולדות מראים כי BTR נשלטת באמצעות נוירונים SCN ספציפיים כי היעד קבוצה שונה של נוירונים באזור subparaventricular מאלה השולטים פעילות לוקומוטור14. לכן, הנתונים שלנו בוחנים את האפשרות כי BTR יונקים TPR לטוס נשמרים מבחינה אבולוציונית3, שכן הן לטוס TPR ו BTR יונקים התערוכה ביולוגית שעונים תלויי טמפרטורה, אשר מוסדר באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור.
כאן, אנו מתארים את הפרטים של איך לנתח את TPR מבחני התנהגות ב Drosophila. שיטה זו מאפשרת חקירה של לא רק המנגנון המולקולרי והמעגלים העצביים של TPR, אלא גם כיצד המוח משלב רמזים סביבתיים שונים ושעונים ביולוגיים פנימיים.

<table><tbody><tr><td>Bright Lab Jr. Safelight</td><td>Amazon</td><td>#B00013J8UY</td><td>Red light for dark rooms</td></tr><tr><td>Rain X</td><td>SOPUS products</td><td></td><td>Water repellent: Apply the plexiglass cover</td></tr><tr><td>C-Clamp</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature/hygrometer</td><td>Fisher</td><td>15-077-963</td><td></td></tr><tr><td>Peltier devices</td><td>TE Technology, Inc.</td><td>HP-127-1.4-1.15-71P</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Fluke</td><td>Fluke 52II</td><td></td></tr><tr><td>Bench top controller</td><td>Oven Industries</td><td>5R6-570-15R and 5R6-570-24R</td><td></td></tr><tr><td>Temperature sensor probe</td><td>Oven Industries</td><td>TR67-32</td><td></td></tr><tr><td>Generic 480 Watt ATX power supply</td><td></td><td></td><td>computer cooling system</td></tr><tr><td>MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir&amp;nbsp;</td><td>Swiftech</td><td></td><td>computer cooling system</td></tr><tr><td>MCP350 In-Line 12V DC pump</td><td>Swiftech</td><td></td><td>computer cooling system</td></tr><tr><td>MCW50 graphics Card liquid cooler</td><td>Swiftech</td><td></td><td>computer cooling system</td></tr><tr><td>Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan</td><td>Crazy PC</td><td></td><td>computer cooling system</td></tr></tbody></table>

design and analysis of temperature preference behavior and its circadian rhythm in drosophila

השעון הביולוגי מווסת היבטים רבים של החיים, כולל שינה, פעילות לוקומוטורית וטמפרטורת גוף (BTR) מקצבים1,2. לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, שנקרא קצב העדפת הטמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה 3. באופן מפתיע, פעילות TPR ו לוקומוטור נשלטים באמצעות נוירונים צירקדיים מובהקים3. פעילות לוקומוטור Drosophila היא תפוקה התנהגותית צירקדית ידועה וסיפקה תרומות חזקות לגילוי גנים ומנגנוני שעון ביולוגיים שמורים רבים של יונקים4. לכן, הבנת TPR תוביל לזיהוי מנגנונים ביולוגיים מולקולריים ותאיים לא ידועים עד כה. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע ולנתח את מבחני TPR. טכניקה זו לא רק מאפשרת לנתח את המנגנונים המולקולריים והנוירונים של TPR, אלא גם מספקת תובנות חדשות על המנגנונים הבסיסיים של תפקודי המוח המשלבים אותות סביבתיים שונים ומווסתים התנהגויות של בעלי חיים. יתר על כן, הנתונים שפורסמו לאחרונה שלנו מראים כי TPR לטוס מניות תכונות עם יונק BTR3. Drosophila הם ectotherms, שבו טמפרטורת הגוף מוסדר בדרך כלל התנהגותית. לכן, TPR היא אסטרטגיה המשמשת ליצירת טמפרטורת גוף קצבית בזבובים אלה5-8. אנו מאמינים כי חקירה נוספת של Drosophila TPR יקל על אפיון המנגנונים שבבסיס בקרת טמפרטורת הגוף בבעלי חיים.

דוגמה לקצב העדפת הטמפרטורה מוצגת באיור 5. אם הליך ההתנהגות נעשה בהצלחה, הזבובים צריכים להפגין TPR שבו הם מעדיפים טמפרטורה נמוכה בבוקר וטמפרטורה גבוהה יותר בערב. ~ 1-1.5 מעלות צלזיוס עלייה בשעות היום בהעדפת הטמפרטורה יש לצפות במהלך היום, ללא קשר לרקע הגנטי, שכן הראינו כי w1118, <...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila at JoVE.com

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, קצב העדפת טמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה. TPR מוסדר באופן עצמאי מתפוקה צירקדית אחרת, פעילות לוקומוטורית. כאן אנו מתארים את העיצוב והניתוח של TPR בדרוסופילה.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

design-analysis-temperature-preference-behavior-its-circadian-rhythm

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Unit 1

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

8.0K Views.  Cincinnati Childrens Hospital Medical Center. לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, קצב העדפת טמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה. TPR מוסדר באופן עצמאי מתפוקה צירקדית אחרת, פעילות לוקומוטורית. כאן אנו מתארים את העיצוב והניתוח של TPR בדרוסופילה.

Video: Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Neuroscience

A Computational Method to Quantify Fly Circadian Activity

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. Fundamental mechanisms that underlie this temporal control are widely studied using the fruit fly Drosophila melanogaster as a model organism. In flies, the clock is typically studied by analyzing multiday locomotor recording. Such a recording shows a complex bimodal pattern with two peaks of activity: a morning peak that happens around dawn, and an evening peak that happens around dusk. These two peaks together form a waveform that is very different from sinusoidal oscillations observed in clock genes, suggesting that mechanisms in addition to the clock have profound effects in producing the observed patterns in behavioral data. Here we provide instructions on using a recently developed computational method that mathematically describes temporal patterns in fly activity. The method fits activity data with a model waveform that consists of four exponential terms and nine independent parameters that fully describe the shape and size of the morning and evening peaks of activity. The extracted parameters can help elucidate the kinetic mechanisms of substrates that underlie the commonly observed bimodal activity patterns in fly locomotor rhythms.

A method to quantify the main temporal features seen in fly circadian locomotor rhythms is presented. The quantification is achieved by fitting fly activity with a multi-parametric model waveform. The model parameters describe the shape and size of the morning and evening peaks of daily activity.

שיטה חישובית לכמת פעילות היממה לעוף

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. ...

Behavior

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific responses to changing temperatures according to their physiological tolerance and adaptability. Drosophila flies also possess a temperature sensing system that has become fundamental to understanding the neural basis of temperature processing in ectotherms. We present here a temperature-controlled arena that permits fast and precise temperature changes with temporal and spatial control to explore the response of individual flies to changing temperatures. Individual flies are placed in the arena and exposed to pre-programmed temperature challenges, such as uniform gradual increases in temperature to determine reaction norms or spatially distributed temperatures at the same time to determine preferences. Individuals are automatically tracked, allowing the quantification of speed or location preference. This method can be used to rapidly quantify the response over a large range of temperatures to determine temperature performance curves in Drosophila or other insects of similar size. In addition, it can be used for genetic studies to quantify temperature preferences and reactions of mutants or wild-type flies. This method can help uncover the basis of thermal speciation and adaptation, as well as the neural mechanisms behind temperature processing.

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

Here we present a protocol to automatically determine the locomotor performance of Drosophila at changing temperatures using a programmable temperature-controlled arena that produces fast and accurate temperature changes in time and space.

שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which enables them to seek out their preferred thermal landscape. To define the temperature preferences of larvae over a defined linear range, we developed an assay using a temperature gradient. To establish a single-directional gradient, two aluminum blocks are connected to independent water baths, each of which controls the temperature of individual blocks. The two blocks set the lower and upper limits of the gradient. The temperature gradient is established by placing an agarose-coated aluminum plate over the two water-controlled blocks so that the plate spans the distance between them. The ends of the aluminum plate that is set on the top of the water blocks defines the minimum and maximum temperatures, and the regions in-between the two blocks form a linear temperature gradient. The gradient assay can be applied to&#160;larvae of different ages and can be used to identify mutants that exhibit phenotypes, such as those with mutations affecting genes encoding TRP channels and opsins, which are required for temperature discrimination.

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Here, we present a protocol to determine the preferred environmental temperature of Drosophila larvae using a continuous thermal gradient.

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant environmental parameters that synchronize animal circadian clocks. In Drosophila circadian photo-responses are mediated by a solely blue light photoreceptor named CRYPTOCHROME (CRY). Upon photoreception, CRY changes its conformation and initiates the proteosomal dependent degradation of TIMELESS (TIM). TIM is an important pacemaker protein, thus degradation of TIM will reset the circadian clock. Under constant light conditions (LL), wild type flies quickly become arrhythmic because of the constant degradation of TIM, while flies bearing defects with circadian photo-responses will still be rhythmic. Thus LL triggered arrhythmicity has been used for screening of components in circadian light input pathways. A brief short light pulse in the night can also dramatically shift phases of circadian rhythms. As expected, this phase shift response is reduced in flied with defects in circadian photoresponse. Thus analyzing locomotion behavior rhythmicity under LL or phase changes after short light pulse in constant darkness (DD) are two major methods to study circadian photoresponse. Here we describe how to design and analyze LL and phase response experiments. LL arrhythmicity is suitable for screening light input pathways mutants, whereas phase response validates the results and provide further information for light sensitivity.

Drosophila locomotor activity is a robust and quantitative measurement of circadian photo-responses. We describe protocols for designing behavior experiments for circadian photo-responses and analyzing the data. Studying the circadian photo-responses is important for dissecting the neuronal and molecular mechanisms of light entrainment.

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant ...

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this rhythm and to understand the resulting outputs, entrainment of model organisms to defined circadian time-points is required. Here we detail a procedure to entrain many Drosophila to a defined circadian rhythm. Furthermore, we detail post-entrainment steps to prepare samples for immunofluorescence, nucleic acid, or protein extraction-based analysis.

Here, we detail how to synchronize Drosophila to a circadian day. This is the first, and most important step necessary for studying biological rhythms and chronobiology.

היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on their fitness, as well as other characteristics. Consequently, many such ectotherms seek out their optimal temperature range. Although temperature preferences of mosquitoes and other insects have been well studied, the traditional experimental setup is performed using a temperature gradient on an aluminum surface in a highly enclosed space. In some cases, this equipment restricts many natural behaviors, such as flying, which may be important in preference selection.
The objective of this study is to observe insect preference for air temperature by using a two-chamber apparatus with sufficient room for flight. The two chambers consist of independent temperature-controlled incubators, each with a large aperture. The incubators are connected by these apertures using a short acrylic bridge. Inside the incubators are two netted cages, linked via the apertures and bridge, allowing the insects to freely fly between the different conditions. The acrylic bridge also acts as a temperature gradient between the two incubators.
Due to the spacious area in the cage and easy construction, this method can be used to study any small ectotherm and/or any manipulation which may alter temperature preference including sensory organ manipulation, diet, gut flora, and endosymbiont presence at biosafety levels 1 or 2 (BSL 1 or 2). Additionally, the apparatus can be used for the study of pathogen infection using further containment (e.g., inside of a biosafety cabinet) at BSL 3.

Insects have an optimal environmental temperature range which they seek to remain within, and many external and internal factors can alter this preference. Here, we describe a cost-effective and simple method to study temperature choice, which allows insects to freely exhibit their natural behaviors.

קביעת העדפת טמפרטורה של יתושים ואקטותרמיות אחרות

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

Temperature Gradient Assay: A Method to Test Temperature Preference in Drosophila Larvae

Source: Liu, J., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57963/" target="_blank">A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2018).
Drosophila fruit flies can distinguish small changes in temperature and therefore select environments with favorable thermal conditions. This video describes a behavioral assay that tests the temperature preference of Drosophila larvae on a linear thermal gradient.

בדיקת שיפוע טמפרטורה: שיטה לבדיקת העדפת טמפרטורה בזחלי דרוזופילה

Source: Liu, J., et al. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2018).
Drosophila fruit flies ...

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית