סנכרון דרוסופילה כדי להגדיר את הזמנים הביולוגיים הוא הצעד הראשון בחקר אירועים ששולטים או מגיבים לשעון הביולוגי. סנכרון של כל הדגמים יעקוב אחר אותה גישה בסיסית. ישנם צעדים רבים לעשות את זה מעשי וזה אולי נראה מכריע לשים את כולם יחד.
צפו לנסות כמה פעמים לפני שזה מרגיש טבעי. שמור על טמפרטורות יציבות ואני רוצה את האור החוצה במהלך שלושת הצעדים שלוש דקות. מכינים את מזון הזבובים בסיר קרוק ב 121 מעלות צלזיוס, ערבוב כמו החומרים מתווספים.
מכסים את קרוק-פוט ומביאים את התוכן לרתיחה מתגלגלת, מערבבים את התוכן כל 10 דקות. לאחר 20 דקות ברתיחה מתגלגלת, לכבות את החום, ולהוסיף 83.6 מיליליטר של מים כדי Crock-Pot. השאירו את המכסה כבוי כשהאוכל מתקרר.
בזמן שהאוכל מתקרר, מערבבים אותו כל 10 דקות כדי להימנע מלאפשר לסרט להיווצר בחלק העליון. כמו כן למדוד את הטמפרטורה כל 10 דקות עם מדחום זכוכית. לאחר שהאוכל התקרר אל מתחת ל-60 מעלות צלזיוס, הוסיפו טגוספט וחומצה פרופיונית, כמתואר בכתב היד.
מערבבים היטב ומתאימים את קרוק-פוט כדי לשמור על טמפרטורה, רק כמה מעלות פחות מ 60 מעלות צלזיוס. השתמש במשאבה פריסטואלית כדי להפיץ את מזון הזבובים. עבור בקבוקונים צרים, לשאוב 10 מיליליטר, ועל שישה בקבוקים תחתונים מרובעים גרם, משאבה 60 מיליליטר.
לאחסן זבובים מסוג בר ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 ימים, עד כ 200 גלמים מחוברים החלק הפנימי של הבקבוק. כדי להסיר את המבוגרים מהבקבוק, להטות אותם לתוך בקבוק חדש, ולהשתמש בקצה המשעמם של מספר אפס מכחול כדי לדחוף את כל המבוגרים הנותרים פנימה מנגבים את מברשת הצבע עם 70% אתנול לפני ואחרי השימוש.
דגירה הגלמים ב 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לדור הבא לצאת. לאחר שלושה ימים, הזבובים יהיו בני אפס עד שלושה ימים. זכור כי טמפרטורה, אור, ואפילו הבחירה שלך של מזון ישפיע על entrainment.
הקפד לשמור אותם, כל שליטה במהלך הניסוי שלך. בנקודות הזמן המיועדות לאיסוף, השתמש כרית הרדמה פחמן דו חמצני כדי לשתק את הזבובים, ולאסוף 100 זכרים ו -100 נקבות. זבובים נקביים הרבה יותר גדולים מהזכרים.
הזבובים יכולים להיות מובחנים גם על ידי בחינת איברי המין. לזכרים יש איברי מין מעוגלים כהים, בעוד שלנקבות יש איברי מין בהירים ומחודדים יותר. מניחים זכרים ונקבות בבקבוקונים נפרדים עם 100 נקבות לבקבוקון ו-50 זכרים לבקבוקון.
אינטראקציות חברתיות גבריות מובילות למקרי מוות רבים כאשר ישנם 100 אנשים בבקבוקון. כדי לאפשר את התרחשות המנה הביולוגית, מניחים את הבקבוקונים באינקובטורים מוסדרים לאור למשך שלושה עד חמישה ימים. כדי לייצר זבובים לכניסה עתידית, מקום 25 של הנקבות הנותרות, וחמישה עד שבעה מהזכרים הנותרים בבקבוק חדש.
דגירה הבקבוק ב 25 מעלות צלזיוס. על כל 100 זבובים שייאספו. הכן בקבוקון צר על-ידי הוספת 4.8 מיליליטר של תיקון.
מניחים את הבקבוקונים הצרים בדלי קרח, ולקחת את הדלי, מגבות נייר, נייר כסף, וקלטת לאנקובטור. כדי לאסוף את הזבובים, מניחים משפך בבקבוקון הצר, ולאחר מכן להסיר את הכובע מן הבקבוקון של זבובים במהירות להפוך אותו לתוך המשפך. הקישו בעדינות כדי להנחות את הזבובים לתוך בקבוקון התיקון.
בעת איסוף זכרים, לשלב שני בקבוקונים של 50 זבובים לתוך בקבוקון צר אחד. עוטפים את הבקבוקונים עבור ZT13 ו- ZT19 בנייר כסף. לאחר העברת הזבובים, מדביקים את הכובעים במקום כדי למנוע שפיכה.
מניחים את הבקבוקונים על מערבל אגוזים ב 165 סל"ד, וארבע מעלות צלזיוס, במשך ארבע שעות. הזבובים כבר אינם רגישים לאור, ולכן, ניתן להסיר את רדיד הכסף כדי לוודא שהזבובים שקועים בתיקון. לאחר הסרת הבקבוקונים מן מערבל Nutating, להסיר את פורמלדהיד, ולאחר מכן לשטוף את הזבובים שלוש פעמים עם 3000 microliters של 1X PBS, היפוך הבקבוקון במהלך כל לשטוף.
אחסן את הבקבוקונים בארבע מעלות צלזיוס, כדי לחכות לשפעת חיסונית עתידית. אור וחושך שימשו להלכדת זבובים למחזורים הביולוגיים. המנה אומתה על ידי immunoblotting, וניתוח immunofluorescence של חלבון התקופה, סמן עבור מנה ביולוגית.
Immunoblotting של תמציות תאים שלמים, מוכן מראשים של זבובים entrained מראה דפוס קנוני של ניידות חלבון תקופתי ועוצמה. שפעת חיסונית של מוחות מואצים, שנאספו ב- ZT1, מראה חלבונים תקופתיים בתבנית אופיינית. שיטה זו היא נקודת זינוק עבור immunofluorescent, immunoplotting, immunoprecipitation, ניתוח התנהגותי, וכל טכניקה אחרת ייתכן שתרצה להשתמש כדי להשוות כיצד המסלול משתנה כמו השעון הביולוגי מתקתק.
עם היכולת ללכוד את האורגניזם מודל שלך, אתה יכול לשאול אם המסלול האהוב עליך משתנה לאורך זמן, והאם ההשפעות במסלול האהוב עליך יכול להוביל לשיבוש של הביולוגי. מספר מחלות מחמירות כאשר השעון הביולוגי משובש. זיהוי המנגנונים הבסיסיים יעזור לנו ליצור תרופות יעילות יותר עבור אנשים הסובלים ממחלות, כגון אלצהיימר ומחלת פרקינסון.
