אנו מודים לד"ר ארווינתן סמואל ומארק גרשו שעזרו לפתח את הגרסה הראשונית של המנגנון ההתנהגותי ומתיו באטי ששינה את המנגנון ההתנהגותי. מחקר זה נתמך על ידי נאמן גרנט מבית החולים לילדים בסינסינטי, JST / PRESTO, מרץ של דימס ו NIH R01 GM107582 כדי F.N.H.

1. הכנת זבובים
<ol><li>ניסויים בחושך בהיר (LD)
	<ol>
<li>העלה זבובים באינקובטורים (25 °C/40-60% לחות יחסית (RH)) תחת אור 12 שעות / כהה 12 שעות (LD) מחזורים. עוצמת האור של האינקובטורים היא ~ 500-1,000 לוקס.</li>
		<li>שתי אינקובטורים נחוצים כדי להשלים את מבחני ההתנהגות על פני תקופה של 24 שעות. שתי האינקובטורים צריכים להיות אור לתכנות עם פונקציות ON OFF. הם צריכים גם דלתות מוצקות שאינן חדירות לאור(כלומר אין זכוכית או פרספקס). הערה: חממה אחת צריכה להיות מוגדרת חממה "יום" ולהגדיר מחזור LD של 12 שעות אור 12 שעות כהה. החממה השנייה צריכה להיות מוגדרת חממה "לילה" ולהגדיר את ההופכי של הראשון עם 12 שעות כהה ואחריו אור 12 שעות. חממת הלילה חייבת להיות ממוקמת בחדר הנגיש בחושך, באופן כזה זבובים חווים תנאי לילה ניתן לגשת בקלות לניסויים.</li>
		<li>מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטורים ביום או בלילה. לאסוף זבובים שזה עתה בקעו בקבוקון טרי, 20-30 לכל מבחנה ולשמור באותה אינקובטור במשך 2-3 ימים.</li>
		<li>לאחר 2-3 ימים, יש להשתמש בזבובים לבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה.<ol>
<li>לניסויי יום (זמן צייטגבר (ZT) 0-12), יש לאסוף זבובים מהחממה היומית.</li>
			<li>ממש לפני הניסויים ההתנהגותיים, הוציאו את בקבוקוני הזבוב שנאספו מהחממה היומית.</li>
			<li>לניסויים ליליים (ZT 13-24), יש לאסוף זבובים מהחממה הלילית.</li>
			<li>ממש לפני הניסויים ההתנהגותיים, מוציאים את בקבוקוני הזבוב שנאספו מהחממה הלילית, עוטפים בנייר אלומיניום ומניחים בקופסה בחדר החשוך מתחת למנורה אדומה. הערה: מכיוון שבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה מתבצעת בחשיכה לניסויי הלילה, יש למנוע חשיפה לאור לזבובים עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים. הערה: הזבובים לא צריכים להיחשף לפחמן דו חמצני ביום הניסויים הם להתקיים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ניסויי חושך מתמיד (DD)
	<ol>
<li>
יום DD
		<ol>
<li>חממה נוספת נחוצה לניסויי יום DD, שאנו מכנים חממת "מעבר" לשאר כתב היד. חממת המעבר חייבת להיות ממוקמת בחדר הנגיש בחושך, באופן כזה זבובים חווים תנאי DD ניתן לגשת בקלות לניסויים. לוח זמנים קל לדוגמה עבור חממת מעבר ידליק את האור בין השעות 13:00-19:00 ואת האור כבוי בשעה 19:00-13:00(איור 1).</li>
			<li>לאסוף את הזבובים אשר גדלו באינקובטור היום. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטור המעבר בין 13:00-19:00, כאשר האור דולק. בדרך זו, הזבובים חשופים כראוי לאור עד השעה 19:00, אז האור נכבה.</li>
			<li>למחרת, לפני השעה 13:00, בתנאים כהים, מוציאים את בקבוקוני הזבוב מהחממה, עוטפים אותם בנייר אלומיניום ומניחים אותם בקופסה. שמור את הקופסה בכל אינקובטור לעוד יום אחד.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
לילה DD
		<ol>
<li>לאסוף את הזבובים אשר גדלו באינקובטור הלילה בחושך תחת מנורה אדומה. או בנוסף לאסוף את הזבובים כאשר אור החממה של הלילה דולק.</li>
			<li>לעטוף בקבוקונים שנאספו עם רדיד אלומיניום בחושך בכל פעם שהאורות כבויים ומניחים את הבקבוקונים בקופסה. שמור את התיבה בכל חממה למשך יומיים נוספים(איור 1B). הערה: מכיוון שבדיקה התנהגותית של העדפת הטמפרטורה מתבצעת בחשיכה לניסויי הלילה, יש למנוע חשיפה לאור לזבובים עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ניסויי אור קבוע (LL)
	<ol>
<li>
יום LL
		<ol>
<li>אינקובטור נוסף נחוץ לניסויי יום LL. חממה זו שומרת על מצב LL (25 °C (70 °F, 800 לוקס), עם האור על ברציפות.</li>
			<li>לאסוף זבובים אשר גדלו באינקובטור היום. מניחים את בקבוקוני הזבוב באינקובטור LL בכל עת במהלך "היום" שלהם.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
לילה LL
		<ol>
<li>לאסוף זבובים אשר גדלו באינקובטור הלילה. מעבירים את בקבוקוני הזבובים מהחממה הלילית לחממה LL בזמן שהאור באינקובטור הלילה דולק. הערה: לדוגמה, האור נכבה בשעה 7 בבוקר באינקובטור הלילה. מעבירים את בקבוקוני הזבובים מהחממה הלילית לחממה LL לפני השעה 07:00 ושומרים את הבקבוקונים באינקובטור LL למשך 4 ימים נוספים. הערה: ביום 4 בתנאי LL, התנודות של פעילות לוקומוטור מבוטלת15,16, בעוד TPR הוא עדיין מתמשך 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. המנגנון לבדיקה התנהגותית העדפת טמפרטורה
<ol><li>הניחו כיסוי פרספקס (29 ס"מ על 19.2 ס"מ) (איור 4)על לוח אלומיניום.</li>
	<li>לפקח על טמפרטורת האוויר בין הצלחת לבין הכיסוי. שש בדיקות טמפרטורה מחוברות בתנוחות שונות בחלק הפנימי של המכסה בתוך אחד הנתיבים(איור 2). הערה: ודא שהבדיקות אינן נוגעות בצלחת האלומיניום או בכיסוי הפלקסיגלס. טמפרטורת האוויר צריכה להיות מוגדרת שיפוע מ 18-32 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הנח את המנגנון בחדר סביבתי המתוחזק ב 25 °C (65 °F) - 75% RH. צריך לאטום את החדר הזה מכל אור חיצוני. חדר סביבתי מצויד בדרך כלל במאווררים כדי לשמור על טמפרטורה ולחות מסוימות. הערה: סביר להניח שהאוויר מהמאוורר מפריע לשיפוע טמפרטורה יציב במנגנון. כדי למנוע זאת, אנו משתמשים בגיליון שקוף המכסה את האזור המקיף את המנגנון.</li>
	<li>הכינו מדחום ומד לחות לבדיקת הטמפרטורה והלחות בחדר הסביבתי. הערה: אור משפיע על העדפת הטמפרטורה של Drosophila3. אותה עוצמת אור צריכה להיות מסופקת על המנגנון באופן אחיד. עוצמת אורות החדר הסביבתי שלנו היא ~ 800 לוקס. הערה: כאשר הניסויים ההתנהגותיים נעשים, למקם צינור מחובר ממיכל CO2 או לספק ליד החור של החלק העליון של המנגנון על מנת להרדים להיפטר הזבובים.</li>
</ol>3. הכנת מנגנון לשימוש
<ol><li>הפעל את המנגנון למשך 30 דקות לפחות כדי לקבוע את שיפוע הטמפרטורה כראוי על פני הצלחת (איור 3).</li>
	<li>מעיל את הכיסוי של מנגנון ההתנהגות עם דוחה מים כדי למנוע זבובים לטפס על הקירות או התקרה של הכיסוי. לנגב את עודף המים דוחה ולהשאיר את הכיסוי במשך 25-30 דקות לייבוש.</li>
	<li>הסר כל עיבוי על צלחת האלומיניום. מניחים את כיסוי הפלקסיגלס על לוח האלומיניום ומאובטחים בשישה מהדקי C(איור 2). הערה: חשוב מאוד שהכיסוי יהיה אטום היטב, במידת הצורך ניתן להשתמש בסרט הדבקה כפול.</li>
	<li>השאירו את הכיסוי לפחות 15 דקות. שיפוע טמפרטורת האוויר בין צלחת האלומיניום לכיסוי נוצר מ 18-32 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. בדיקת התנהגות העדפת טמפרטורה
<ol><li>העמיסו את הזבובים לחלל שבין לוח האלומיניום לכיסוי הפלקסיגלס של המנגנון דרך חורים קטנים במרכז כל נתיב של העטיפה(איורים 2 ו-4). לכסות את החורים עם תלושי כיסוי כדי למנוע את הזבובים לברוח.</li>
	<li>לתנאים האפלים, כבו את כל האורות בחדר הסביבתי. מנורה אדומה יכולה לשמש כאשר הזבובים ממוקמים לתוך המנגנון. ודאו שהזבובים אינם חשופים לאורות מלבד מנורה אדומה עד לסיום הניסויים ההתנהגותיים.</li>
	<li>עבור כל ניסיון, השתמש 20-25 זבובים מבוגרים, אשר אין לעשות בהם שימוש חוזר בניסויים הבאים. ההסתעפות ההתנהגותית מבוצעת במשך 30 דקות. צלם כמה תמונות עם או בלי הבזק. היזהר לא לעשות הרבה רעש או כל תנועות פתאומיות במהלך הניסויים.</li>
	<li>רשום את הטמפרטורה של כל ששת הבדיקות במנגנון. שימו לב לטמפרטורת החדר, כמו גם ללחות.</li>
	<li>הרדמה את הזבובים במנגנון עם גז פחמן דו חמצני, לשחרר את המהדקים, להסיר את כיסוי plexiglass, ולהסיר את הזבובים מהצלחת. לאחר כל ניסוי, הזבובים מושלכים. לנגב כל עיבוי או לחות מהצלחת. החלף את הכיסוי על הצלחת והדק עם המהדקים כהכנה לניסוי הבא.</li>
	<li>על מנת לקבל ייצוג של העדפת הטמפרטורה לאורך כל היום, פרק הזמן של 24 שעות מחולק לשמונה אזורי זמן, ארבעה במהלך היום וארבעה בלילה. לדוגמה, אנו משתמשים ב- ZT או CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ו- 22-24. הערה: מאחר ווריאציות פנוטיפ הנגרמות על-ידי אפקטי מיסוך צפויות מיד לאחר הפעלת האור (ZT0) או כבוי (ZT12), איננו בוחנים את התנהגות העדפת הטמפרטורה בזמנים אלה (ZT או CT 0-1, 11.5-13 ו- 23.5-24). לפחות חמישה ניסויים חייבים להיעשות בכל אזור זמן כדי שהתוצאות יהיו מבוססות סטטיסטית.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>חישוב מעבר הטמפרטורה באופן הבא: קבע היכן ממוקמות בדיקות הטמפרטורה בהתבסס על שני הסרגלים הממוקמים בצד העליון והתחתון של כיסוי הפלקסיגלס לאורך הקצוות (איור 2A).</li>
	<li>שיפוע הטמפרטורה בין בדיקות הטמפרטורה מוערך להיות ליניארי. בהתבסס על המיקומים של בדיקות הטמפרטורה, כמו גם הטמפרטורות המתועדות המתאימות שלהם, לצייר קווים המייצגים כל דרגה של טמפרטורה במיקום המתאים על התמונות. ספור את מספר הזבובים הממוקמים בכל מרווח מעלות. אל תכלול זבובים על הקירות או על תקרת המכסה.</li>
	<li>חשב את אחוז הזבובים בכל טווח טמפרטורות של כל נתיב. טמפרטורה מועדפת ממוצעת מחושבת על-ידי סיכום המוצרים של אחוז הזבובים והטמפרטורה של כל מרווח, כפי שמוצג להלן: % של זבובים x 18°C + % זבובים x 19°C + % של זבובים x 20 °C (70 °F) ....+ % של זבובים x 31 °C (69 °F + % של זבובים x 32 °C (69 °F).</li>
	<li>חישוב הטמפרטורה המועדפת הממוצעת בכל אזור זמן: התנהגות העדפת טמפרטורה מתבצעת >5 פעמים בכל אזור זמן (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 ו- 22-24). כדי לחשב את הטמפרטורה המועדפת הממוצעת בכל אזור זמן, הטמפרטורה המועדפת הממוצעת של כל ניסיון ממוצעת יחד. קווי השגיאה של s.e.m. שווים לשגיאה בין הניסיונות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment.">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view.">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li><li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila.">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li><li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila.">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li><li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+hot+and+cold:+behavioral+strategies,+neural+circuits,+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila..">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila..</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila.">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li><li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Thermal+preference+in+Drosophila.">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and.">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li><li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain.">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li><li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms.">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li><li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+rhythm+of+body+temperature.">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li><li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people.">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li><li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms.">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li><li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants.">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li><li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function.">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li><li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+sleep.">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li><li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit.">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li></ol>

אין מה לחשוף.

כאן, אנו ממחישים את הפרטים של מנגנון התנהגות העדפת הטמפרטורה וניתוח של התנהגות TPR. דרוזופילה מציגה את המאפיינים הבולטים, החזקים והניתנים לשחזור של TPR הנשלט על ידי השעון. עם זאת, הנתונים שלנו מראים כי לפחות שני גורמים, אור הסביבה וגיל, להפריע באופן משמעותי פנוטיפים התנהגותיים TPR.
<p class="...

טמפרטורה היא רמז סביבתי בכל מקום. בעלי חיים מפגינים מגוון התנהגויות על מנת למנוע טמפרטורות מזיקות ולחפש טמפרטורות נוחות. Drosophila להפגין התנהגות העדפת טמפרטורה חזקה6,7. כאשר זבובים משתחררים לתוך שיפוע טמפרטורה מ 18-32 מעלות צלזיוס, הזבובים להימנע הן טמפרטורות חמות וקרות ולבסוף לבחור טמפרטורה מועדפת של 25 מעלות צלזיוס בבוקר3. חיישני הטמפרטורה החמים הם קבוצה של נוירונים תרמוסנסוריים, נוירונים AC, אשר מבטאים Drosophila פוטנציאל קולטן ארעי (TPR) ערוץ, TRPA16,9. חיישני הטמפרטורה הקרה ממוקמים בקטעי האנטנה השלישית, שכן בלימת מקטעי האנטנה השלישית גורמת לחוסר הימנעות טמפרטורה קרה6. לאחרונה, חלבון TRPP Brivido (Brv) זוהה10. מכיוון ש-Brv מתבטא בקטעי האנטנה השלישית ומתווך בזיהוי קר, Brv היא מולקולת חישה קרה אפשרית, שהיא קריטית להתנהגות העדפת הטמפרטורה. לסיכום, הזבובים משתמשים בשני חיישני טמפרטורה אלה כדי למנוע את הטמפרטורות החמות והקרות ולמצוא טמפרטורה מועדפת.
בעוד יונקים ליצור חום כדי לווסת את טמפרטורת הגוף שלהם, ectotherms בדרך כלל להתאים את טמפרטורות הגוף שלהם לטמפרטורתהסביבה 11. כמה ectotherms ידועים להפגין התנהגות TPR יומי אשר הוא האמין להיות אסטרטגיה עבור ectotherms לווסת BTR שלהם12. כדי לקבוע אם הזבובים הציגו TPR, חזרנו על ניתוח התנהגותי העדפת הטמפרטורה בנקודות שונות במהלך טווח של 24 שעות. מצאנו כי Drosophila התערוכה TPR יומי, אשר נמוך בבוקר וגבוה בערב ועוקב אחר דפוס דומה לזה של BTR בבני אדם13.
ב Drosophila, ישנם ~ 150 נוירונים שעון במוח. נוירוני השעון המווסתים את פעילות הלוקומוטור נקראים מתנדים M ו- E. עם זאת, מעניין, מתנדים M ו- E אינם מווסתים TPR, במקום זאת, הראינו כי נוירונים שעון DN2 במוח לווסת TPR אבל לא פעילות לוקומוטור. נתונים אלה מצביעים על כך ש- TPR מוסדר באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור. יש לציין, BTR יונקים מוסדר גם באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור. מחקרי אבלציה בחולדות מראים כי BTR נשלטת באמצעות נוירונים SCN ספציפיים כי היעד קבוצה שונה של נוירונים באזור subparaventricular מאלה השולטים פעילות לוקומוטור14. לכן, הנתונים שלנו בוחנים את האפשרות כי BTR יונקים TPR לטוס נשמרים מבחינה אבולוציונית3, שכן הן לטוס TPR ו BTR יונקים התערוכה ביולוגית שעונים תלויי טמפרטורה, אשר מוסדר באופן עצמאי מפעילות לוקומוטור.
כאן, אנו מתארים את הפרטים של איך לנתח את TPR מבחני התנהגות ב Drosophila. שיטה זו מאפשרת חקירה של לא רק המנגנון המולקולרי והמעגלים העצביים של TPR, אלא גם כיצד המוח משלב רמזים סביבתיים שונים ושעונים ביולוגיים פנימיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="578">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:172px;">Bright Lab Jr. Safelight</td>
			<td style="width:109px;">Amazon</td>
			<td style="width:153px;">#B00013J8UY</td>
			<td style="width:144px;">Red light for dark rooms</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:172px;">Rain X</td>
			<td style="width:109px;">SOPUS products</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">Water repellent: Apply the plexiglass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:172px;">C-Clamp</td>
			<td style="width:109px;">Home Depot</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:172px;">Temperature/hygrometer</td>
			<td style="width:109px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">15-077-963</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:172px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:172px;">Peltier devices</td>
			<td style="width:109px;">TE Technology, Inc.</td>
			<td style="width:153px;">HP-127-1.4-1.15-71P</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:172px;">Thermometer</td>
			<td style="width:109px;">Fluke</td>
			<td style="width:153px;">Fluke 52II</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:172px;">Bench top controller</td>
			<td style="width:109px;">Oven Industries</td>
			<td style="width:153px;">5R6-570-15R and 5R6-570-24R</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:172px;">Temperature sensor probe</td>
			<td style="width:109px;">Oven Industries</td>
			<td style="width:153px;">TR67-32</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:172px;">Generic 480 Watt ATX power supply</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:172px;">MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:172px;">MCP350 In-Line 12V DC pump</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:172px;">MCW50 graphics Card liquid cooler</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:172px;">Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan</td>
			<td style="width:109px;">Crazy PC</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and analysis of temperature preference behavior and its circadian rhythm in drosophila

השעון הביולוגי מווסת היבטים רבים של החיים, כולל שינה, פעילות לוקומוטורית וטמפרטורת גוף (BTR) מקצבים1,2. לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, שנקרא קצב העדפת הטמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה 3. באופן מפתיע, פעילות TPR ו לוקומוטור נשלטים באמצעות נוירונים צירקדיים מובהקים3. פעילות לוקומוטור Drosophila היא תפוקה התנהגותית צירקדית ידועה וסיפקה תרומות חזקות לגילוי גנים ומנגנוני שעון ביולוגיים שמורים רבים של יונקים4. לכן, הבנת TPR תוביל לזיהוי מנגנונים ביולוגיים מולקולריים ותאיים לא ידועים עד כה. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע ולנתח את מבחני TPR. טכניקה זו לא רק מאפשרת לנתח את המנגנונים המולקולריים והנוירונים של TPR, אלא גם מספקת תובנות חדשות על המנגנונים הבסיסיים של תפקודי המוח המשלבים אותות סביבתיים שונים ומווסתים התנהגויות של בעלי חיים. יתר על כן, הנתונים שפורסמו לאחרונה שלנו מראים כי TPR לטוס מניות תכונות עם יונק BTR3. Drosophila הם ectotherms, שבו טמפרטורת הגוף מוסדר בדרך כלל התנהגותית. לכן, TPR היא אסטרטגיה המשמשת ליצירת טמפרטורת גוף קצבית בזבובים אלה5-8. אנו מאמינים כי חקירה נוספת של Drosophila TPR יקל על אפיון המנגנונים שבבסיס בקרת טמפרטורת הגוף בבעלי חיים.

דוגמה לקצב העדפת הטמפרטורה מוצגת באיור 5. אם הליך ההתנהגות נעשה בהצלחה, הזבובים צריכים להפגין TPR שבו הם מעדיפים טמפרטורה נמוכה בבוקר וטמפרטורה גבוהה יותר בערב. ~ 1-1.5 מעלות צלזיוס עלייה בשעות היום בהעדפת הטמפרטורה יש לצפות במהלך היום, ללא קשר לרקע הגנטי, שכן הראינו כי w1118, <...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila at JoVE.com

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, קצב העדפת טמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה. TPR מוסדר באופן עצמאי מתפוקה צירקדית אחרת, פעילות לוקומוטורית. כאן אנו מתארים את העיצוב והניתוח של TPR בדרוסופילה.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

design-analysis-temperature-preference-behavior-its-circadian-rhythm

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Unit 1

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

8.0K Views.  Cincinnati Childrens Hospital Medical Center. לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, קצב העדפת טמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה. TPR מוסדר באופן עצמאי מתפוקה צירקדית אחרת, פעילות לוקומוטורית. כאן אנו מתארים את העיצוב והניתוח של TPR בדרוסופילה.

Video: Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

השתלת עדשה של דג הזברה Application שלה ניתוח של מוטאנטים העין

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

ניתוח התנהגות גדילה תודרנית לבנה באיכויות שונות אור

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this rhythm and to understand the resulting outputs, entrainment of model organisms to defined circadian time-points is required. Here we detail a procedure to entrain many Drosophila to a defined circadian rhythm. Furthermore, we detail post-entrainment steps to prepare samples for immunofluorescence, nucleic acid, or protein extraction-based analysis.

Here, we detail how to synchronize Drosophila to a circadian day. This is the first, and most important step necessary for studying biological rhythms and chronobiology.

היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...