אנו מודים בני הזוג. אלכס גלברד וילם Overwijk עצה על העברת גנים הידרודינמית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מNIH (AI098099, מע), במרכז אנדרסון לסרטן אפיגנטיקה, מרכז MD Anderson לדלקות וסרטן (מע), וקרן RE בוב סמית החינוך (HSL).

יש לקבל את האישור מוסדי מראש לכל מניפולציות הניסוי שתוארו במסמך זה כרוך בעכברים. אלה כוללים שימוש בעכברי C57BL6 לבידוד של תאי אב במח עצם, Ifnar - / - עכברים כנמענים להעברת מאמצת של אבות hematopoietic ושימוש בHGT לביטוי יתר של ציטוקין in vivo. דיור הולם וטיפול בבעלי החיים גם חייבים להינתן על ידי החוקר או מוסד. יתר על כן, ייתכן שיידרש אישור מוסדי לפלסמידים המשמשים בהעברה הידרודינמית גן (כלומר אישור ה-DNA רקומביננטי). המחקרים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש ב UT MD Anderson Cancer Center. 1. ין העברה הידרודינמית (HGT) צעד זה צריך להתבצע 2 ימים לפני העברת המאמצת של CDPs כדי לגרום למחזור Flt3L להרחבת DC in vivo 5. יחסי ציבורepare לפחות 5 עכברים / קבוצת נמען. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג HGT יעיל, כלי השיט של הנמען Ifnar דם - / - עכברים (+ CD45.2) צריכים להיות מורחב על ידי חשיפת עכברים למנורת חימום ל5-10 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 5 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד Flt3L ב2 מיליליטר של PBS סטרילי לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27. לקבוצת הביקורת, להזריק 5 מיקרוגרם של וקטור ריק (pORF) דרך וריד הזנב כפי שצוין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור למשך 2 ימים. </li></ol> 2. בידוד של Hematopoietic אבות מעכבר מח עצם יש לבצע שלב זה 2 ימים לאחר HGT. השתמש CD45.1 + עכברי congenic כמקור לתאי אב במח עצם להעברת מאמצת לנמען Ifnar - /- בעלי חיים (CD45.2 +). בפרוטוקול זה, זני congenic נדרשים להבחין תורם וDCS-נגזר נמען, וכן כדי למנוע דלדול בתיווך חיסונית בשל חוסר התאמת MHC. כ 10-20 עכברים יידרשו כדי לספק כמות מספקת של תאי אבות היווצרות הדם (10 5 תאים / עכבר נמען) לניסויי ההעברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים CD45.1 congenic 10 + עכברים על ידי CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל פגר על מגש נתיחה ולעקר את הבטן ורגליים עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך באמצע הבטן וחתך את העור מהבטן לכל רגל, חיתוך עור לאורך רגלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את העור מכל רגל, ולחתוך ולהסיר את הרגליים מן הפגר במפרק הירך באמצעות מספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את השרירים מהירך ועצם השוק של כל רגל באמצעות סכין חד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסירשני הקצוות של עצם הירך ועצם שוק עם אזמל חד ולמקם את העצמות בצלחת תרבות המכילה מלא RPMI (RMPI 10% בסרום חום מומת שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ ו50 β-mercaptoethanol מיקרומטר) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק המכיל 1 מיליליטר של RPMI השלם, מחובר למחט G 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכניס את מחט 27 G לתוך קצה אחד של עצם הירך או שוקה. לשטוף את מח העצם מהירך או השוקה בעדינות על ידי הזרקת RPMI להשלים לתוך העצם. ודא שתאי מח עצם הוצאתו מהעצמות, זה יכול להתבצע על ידי בחינה ויזואלית איתור מדיה גורשה שמופיעה מעונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שטיפת כל 3x עצם ירך ועצם השוק כדי להסיר ביסודיות תאי מח עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting בעדינות תאים למעלה ולמטה 3-5x בצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר שאריות על ידי העברת תאי מח עצם דרך מסננת 40 תא מיקרומטר, הצבת התאים הקרינו לcultur חדשהצלחת דואר. לשבש כל גושי תאים המופיעים במסננת על ידי לחץ עדין עם סוף בוכנת מזרק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאי דם האדום (RBC) הנמצאים בהשעית התא במח עצם המוחלטת עם מאגר תמוגה RBC מסחרי להוראות היצרן. השתמש 2 מיליליטר buffer/4-6 תמוגה RBC x 10 7 תאים (בדרך כלל בתאים מעכבר אחד) וזמן דגירה של 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי מח עצם על ידי pelleting תאים על ידי צנטריפוגה במשך 4 דקות בשעה XG 500, בעדינות aspirating מדיום התרבות, resuspending ב10 מיליליטר חיץ FACS (1x PBS + 2 מ&quot;מ EDTA + 1% FBS), תאי pelleting ידי צנטריפוגה ובעדינות aspirating לשטוף מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף, כמתואר בשלב 2.13, עבור סכום כולל של 2 שוטף. </li></ol> 3. סלולרי הקרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד CDPs צעד זה דורש גישה למפריד תא MidiMACS ועמודות MACS LD להליך בחירה שלילית ראשוני,כמו גם מכונה FACS עם לפחות 3 בלייזרים על מנת לטהר את קבוצת משנה אב ססגוניות לאחר צביעה עם נוגדנים מצומדות fluorescently. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף את השני בשלב 2.14, לספור את תאי מח עצם. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS כדי להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 7 תאים לכל 30 μl של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את התאים לFACS, תאי שושלת שלילית מועשרים ראשון על ידי טכניקת סלקציה שלילית שמסירה תאי שושלת חיובית מתערובת מח עצם באמצעות כרומטוגרפיה עמודת חרוז מגנטי. להליך הבחירה השלילי, להוסיף 1 מיקרוגרם של כל אחד מהנוגדנים הבאים החולדה מסחרית אנטי עכבר (שרירי בטן) שמזהים סמני שושלת hematopoietic: CD3, CD19, CD11c, CD11b, וטר-119 אבס. שרירי הבטן יש להוסיף בנפח של 2 μl / Ab להשעית תא 30 μl בחיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה התא על 4 מעלות צלזיוס במשך 30דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 7 cells/40 μl של חיץ FACS. הוסף 20 μl של עז אנטי עכברוש microbeads המגנטי IgG לכל 40 μl של השעיה תא. מערבבים בעדינות ולדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטוף תאים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עד 10 תאי מח עצם ב8 500 μl של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עמודת LD MACS על מפריד תא MidiMACS להוראות היצרן וprerinse הטור עם חיץ FACS 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את ההשעיה התא במח עצם לעמודה, טעינה עד 5 x 10 8 תאים ב2.5 מיליליטר של חיץ FACS. ודא צינור איסוף (צינור חרוטי 15 מיליליטר) ממוקם מתחת לעמודה. לשטוף את עמודת 3x עם 2 מיליליטר של חיץ FACS / לשטוף, ולאסוף את התאים שעוברים דרך העמודה, שיהיה מועשרת עבורתאי שושלת שלילית. ספירת התאים בחומר eluted (לשטוף דרך) מהטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע סלקציה חיובית של תת אב hematopoietic על ידי FACS, תאי כתם עם שרירי הבטן הבאים fluorescently מצומדות:-IL-7R (פסיפיק בלו), FLT3 (PE), SCA-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit שרירי בטן (APC.Cy7), בתוספת תערובת של אבס סמן השושלת מכוון נגד CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 וTer119 (כל כותרתו עם PerCP Cy5.5). השתמש 0.5-1 μl של כל Ab בנפח כולל של 100 μl. דגירה השעיה תא על 4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS בריכוז של 2-3 x 10 7 תאים / מיליליטר. סנן תאים דרך צינור כובע מסננת תא 35 מיקרומטר כדי להסיר גושי תא. השלב אחרון זה הוא חיוני כדי למנוע סתימה במכונה FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההשעיה התא בצינור FACS על הבמה FACS ולמיין CDPs (לין - c-kit והנה CD115 + FLT3 +) עלבסיס פרופיל הסמן המצוין. איסוף תאים מטוהרים בצינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של RPMI המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים בסוף ריצת FACS. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend ב סטרילית PBS לניסויי העברת מאמצת. </li></ol> 4. העברת מאמצת של CDPs צעד זה נעשה בדרך כלל במתקן בעלי החיים שבו עכברי הנמען הם שוכנו. בהתאם למיקום של המכונה FACS, זה עשוי להיות כרוך בהובלה של אוכלוסיות תאים ובתאים המטוהרים למתקן בעלי החיים לפני העברת מאמצת. צריכה להיות כל הזמן השעיות תא אב סטריליים ומועברות על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות תא להזרקה על ידי דילול 10 5 CDPs מטוהר בהיקף כולל של 100 סטרילי PBS μl. הנח השעיה תא במזרק המצורף למחט G 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הנמען Ifnar - / - </sup&gt; עכברים (CD45.2 +) למנורת חימום ל5-10 דקות כדי להשיג זריקה יעילה דרך וריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 10 CDPs 5 מטוהר FACS-ב100 μl PBS לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור. </li></ol> 5. בידוד של PP ומדידה של PDC סכומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב7-10 ימים לאחר העברת מאמצת, להרדים עכברי הנמען. בעדינות לפתוח את העכבר על ידי לנתיחה ולחשוף את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל המעי ולמקם אותו במגבות נייר ספוגות PBS. לאסוף את כל PPS הגלוי לאורך הקיר של המעי הדק באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר. יש עכברים בדרך כלל 5-10 PP / עכבר, שהם שונים מזקיקי הלימפה מבודדים מצאו - C57BL6 וIfnar - /לאורך המעי הדק 18. שים לב שPPS הוא לעתים קרובות מבני ברור אפילו בתוך עכבר אחת, להבטיח כל כך בזהירות את כל PPS מזוהים וגזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח PPS בצלחת פטרי המכילה PBS, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר את צואה. חזור על תהליך זה פעמיים כדי לנקות PPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Digest PPS עם מ&quot;ג / IV collagenase מיליליטר 1 ב10 פתרון מיליליטר של 1x האנק מאוזן מלח (HBSS) ב50 מיליליטר בקבוקון עם ערבוב נמרץ במשך שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את PP מתעכל בתא העליון של תאי מסננת תא וכוח 40 מיקרומטר דרך מסננת עם בוכנת מזרק סטרילי. אסוף את ההשעיה תא PP בצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאי PP מתוחים על ידי צנטריפוגה ב XG 500 לדקות 5 ו resuspend ב 6 מיליליטר של 37% פתרון Percoll (37% Percoll בRPMI בינוני). מניח בעדינות 6 מיליליטר של 70% פתרון Percoll (70% Percoll במדיום RPMI) מתחת להשעית התא, כדי ליצור שיפוע צעד Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ל20 דקותt XG 800 עם צנטריפוגה לנתק. תאים חד גרעיניים יעברו לממשק 37/70%. לאחר צנטריפוגה, אוכלוסיית התאים חד הגרעיניים צריכה להיות שנאספו על ידי pipetting זהיר באזור הממשק. גלולה שנאספו תאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעמיים ב50 מיליליטר של RPMI / לשטוף מלא. נפח גדול משמש כדי להבטיח הסרת Percoll מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאי PP נאספו עם הנוגדנים הבאים כדי לזהות pDCs העכברי הנובעים מהאבות העבירו adoptively (CD45.1 +), או עכברי נמען (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (פסיפיק בלו), CD11b (Cy5.5 PerCP), B220 (APC), Siglec-H (PE) וPDCA-1 (ABS FITC). לבצע ניתוח cytometry זרימה של תאי PP כפי שצוין בצעדים 3.9 ו3.10. לזהות pDCs ידי CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + פנוטיפ. מספרי PDC מוחלטים ניתן לקבוע על ידי המשוואה הבאה:% pDCs x למספר תא tal PP = PP pDCs. </li></ol>

<ol>
	<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+monocytes+migrate+to+inflamed+lymph+nodes+and+produce+large+amounts+of+type+I+interferon.">Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon.</a> Nat. Med. 5 (8), 919-923 .</li><li>Siegal, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+the+principal+type+1+interferon-producing+cells+in+human+blood.">The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood.</a> Science. 284 (5421), 1835-1837 .</li><li>Asselin-Paturel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology.">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .</li><li>Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Peyer's+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+(pDCs)+produce+low+levels+of+type+I+interferons:+possible+role+for+IL-10,+TGFbeta,+and+prostaglandin+E2+in+conditioning+a+unique+mucosal+pDC+phenotype.">Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype.</a> J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).</li><li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+role+for+IFN-alpha-STAT1+signals+in+regulating+murine+Peyer+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+and+conditioning+an+inflammatory+response.">Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response.</a> Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).</li><li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3.">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 .</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+dendritic+cell+development+and+homeostasis.">In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo.">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> 8 (11), 1217-1226 .</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+differentiation:+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells.">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121 (1), 11-19 .</li><li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBPbeta+is+required+for+'emergency'+granulopoiesis.">C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis.</a> Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+and+antitumor+effects+of+IL-23+as+a+cancer+vaccine+adjuvant.">Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant.</a> J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).</li><li>Cervantes-Barragan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+control+T-cell+response+to+chronic+viral+infection.">Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).</li><li>Goubier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+mediate+oral+tolerance.">Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance.</a> Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).</li><li>Lande, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+activate+plasmacytoid+dendritic+cells+by+releasing+self-DNA-peptide+complexes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.</a> Sci. Transl. Med. 3 (73), .</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent,+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice.">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li><li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+IgA+synthesis:+regulation+of+front-line+body+defences.">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).</li><li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development.">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li><li>Blasius, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cell+antigen+2+is+a+specific+marker+of+type+I+IFN-producing+cells+in+the+naive+mouse,+but+a+promiscuous+cell+surface+antigen+following+IFN+stimulation.">Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation.</a> J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).</li><li>Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Th17+cells+in+the+gut+pathogenic+or+protective.">Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective.</a> Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

טכניקת העברת המאמצת המתוארת כאן העריכה תרומת CDPs באוכלוסיית PP PDC עכברים נמען כי חסרים PP pDCs (למשל Ifnar - / - עכברים). בניסויים עתידיים, זה יהיה חשוב להעריך את הפוטנציאל של תת אב אחר ביצירת pDCs PP, בפרט אם pDCs PP נובע מFLT3 + CLPs. על שאלה זו הינה משמעותית שכן עדיין לא בר...

הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול להעריך האם אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs) מסוגלים לתת עלייה לתאים דנדריטים plasmacytoid אוכלוסייה (PDC) בתיקון של Peyer (PP). המטרה הכללית של שימוש בשיטה זו הייתה להעריך את הרגולציה ההתפתחותי של pDCs בתיקון של Peyer (PP PDC). מהסיבה זו חשובה היא שpDCs PP שונה מpDCs נמצא ברקמות אחרות, כוללים מח עצם, דם וטחול, ולכן לא ברור אם pDCs PP ואוכלוסיות PDC אחרות הן מבחינה התפתחותית ו / או תפקודי בנושא. באופן ספציפי, pDCs ידוע נרחב על היותו הסוג העיקרי אני אינטרפרון מפיקים (IFN) בתוך מערכת hematopoietic, בתגובה לחיוג כמו קולטן 7 ו 9 גירוי (TLR7 / 9) על ידי מהיר IFN ההפרשה 1-3. יחד עם זאת, pDCs PP חסר בייצור הסוג אני IFN בתגובה לגירוי 4,5 אגוניסט TLR. זאת ועוד, PP pDCs גם שונה מpDCs נמצא במח עצם וטחול בהדורש אותות מהסוג אני אינטרפרון רצפטור (IFN) (IFNAR1) או IFN איתות STAT1 מולקולה לפיתוח ו / או ההצטברות 5 שלהם. נתונים אלה הציעו את האפשרות שמנגנוני פיקוח שונים לשלוט pDCs PP לעומת pDCs באיברים אחרים (למשל מח עצם, טחול) 5. הרציונל שהוביל לפיתוחה של שיטה זו היה מבוסס על ההתקדמות בהבנת ביולוגיה של תאים דנדריטים (DC). רוב, אם לא כולם, תת DC נובעים מאבות hematopoietic המבטאים את FMS-כמו טירוזין קינאז 3 קולט (FLT3) 6-10, עם זאת, פיתוח DC אינו מוגבל למיאלואידית הקלאסית ומסלולי הלימפה. לדוגמא, + אבות FLT3 נפוצים מיאלואידית (CMPs, לין - IL-7R - SCA-1 - c-kit + CD34 + FcγR lo / -) להצמיח CDPs (לין - c-kit lo CD115 + FLT3 +), אשרשעות נוספות להבדיל לpDCs וDCs הקונבנציונלי (cDCs) 9,10. לעומת זאת, FLT3 + אבות הלימפה נפוצים (CLPs, לין - והנה + SCA-1 lo c-kit IL-7R) לפתח בעיקר לpDCs 11. לכן, מחקרים קודמים מצביעים על pDCs לנבוע מלפחות 2 אוכלוסיות אבות היווצרות הדם נפרדות לפי תקנה של Flt3L, אם כי הניתוח הטיפוסי הוגבל למח עצם, הטחול ו / או תת PDC הדם. לכן, אוכלוסיית האב (ים) שיוצרת PP pDCs נדרשת חקירה. הבנת מקורותיה של PP pDCs תשפוך אור על השאלה האם הם חולקים מסלולים התפתחותיים משותפים עם אוכלוסיות PDC אחרות, או לנצל את המנגנונים שונים בדורם בPP. יתרון ייחודי של הגישה המתוארת כאן הוא השימוש בעכברים מראים כי מחסור חמור בPP pDCs כנמענים להעברת המאמצת של אבות היווצרות הדם. עכברים עם גןמחיקת טיק בגן המקודד IFNAR1 (Ifnar - / - עכברים) או STAT1 (Stat1 - / -) גילתה דלדול בולט בPP pDCs 5. לכן, זנים אלה מספקים סביבה שבה pDCs PP מופחתים, המאפשרים לימודי העברת מאמצת שיש לבצע בהיעדר משטרי אבלציה הסלולרי חזקים כמו קרינה קטלנית. כוח נוסף של השיטה המוצגת כאן הוא השימוש בהעברת גנים הידרודינמית (HGT) כדי לעורר את הכמויות במחזור גבוהות של Flt3L. זה מספק גישה יעילה עלות לגרום Flt3L in vivo, לעומת הזרקה של חלבון רקומביננטי. מחקרים רבים, כוללים אלה במעבדה שלנו, יש מועסקי HGT לגרום כמויות ציטוקינים במגוון רחב של תנאי ניסוי 5,12,13. חלוקת העבודה ותפקידים חיסוניים מדויקים לDCS היא עניין המרכזי באימונולוגיה. בפרט, pDCs הם מתווכים חשובים של סובלנות אוראלית ואנטי ויראלית המערכתיתתשובות, ובכל זאת הם מופיעים גם לתרום לפיתוח וההתמדה של אוטואימוניות והסרטן 14-17. הפרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר למנגנוני התפתחות ויסות PP pDCs כדי להיחקר באופן מלא יותר. בנוסף, גישה זו עשויה לאפשר מחקרים כדי להעריך את תפקוד PP PDC, וניתן להארכה להבנת הוויסות והתפקוד של אוכלוסיות אחרות של מערכת חיסון בתוך PPS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">664</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">B6.SJL</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">2014</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">11875-093</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352070</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile surgical tweezers</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile small pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile large pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352340</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352235</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RBC lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">R7757</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:260px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Percoll</td>
			<td style="width:201px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:177px;">17089102</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10XHBSS</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4641</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:201px;">Worthington</td>
			<td style="width:177px;">LS004188</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Goat ant-rat IgG microbeads</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-048-501</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LD column</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-042-901</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-D3</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">555273</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD19</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553783</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11b</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553308</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11c</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553799</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-Ter119</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553671</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD3 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0031</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD19 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0193</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11b (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-F4/80 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-4801</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Ter119 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-5921</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Sca-1 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-5981</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD115 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">17-1152</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-c-kit (APC.Cy7)&#160;</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">47-1171</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-1271</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Flt3 (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-1351</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.1 (APC.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">560579</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.2 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">Biolegend</td>
			<td style="width:177px;">109830</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-B220 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-0452</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Siglec-H (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-0333</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-PDCA-1 (FITC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">Nov-72</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">e.g. BD Fortessa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heat lamp</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">309602</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">27&#189; G needles (sterile)</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">305109</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the development of murine plasmacytoid dendritic cells in peyer's patches using adoptive transfer of hematopoietic progenitors

פרוטוקול זה מפרט שיטה לנתח את היכולת של אבות היווצרות הדם מטוהרים כדי ליצור תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) בתיקון של Peyer מעיים (PP). אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs, לין - c-kit lo CD115 + FLT3 +) היו מטוהרים ממח העצם של עכברי C57BL6 ידי FACS והועברו לעכברי נמען שאין אוכלוסיית PDC משמעותית בPP, במקרה זה, Ifnar - / - עכברים שימשו כמקבלי העברה. בחלק מהעכברים, ביטוי יתר של גורם גדילה ליגנד תאים דנדריטים FLT3 (Flt3L) נאכף לפני מאמצי העברת CDPs, באמצעות העברת גנים הידרודינמית (HGT) של פלסמיד Flt3L הקידוד. ביטוי יתר Flt3L מרחיב אוכלוסיות DC מקורם אבות הועברו (או אנדוגני) hematopoietic. ב7-10 ימים לאחר העברת אב, pDCs שעולה מהאבות העבירו adoptively נבדלו מתאי נמען עלבסיס של ביטוי סמן CD45, עם pDCs מCDPs הועבר להיות CD45.1 + ומקבלי להיות + CD45.2. היכולת של CDPs הועבר לתרום לאוכלוסיית PDC בPP ולהגיב לFlt3L הוערכה על ידי cytometry זרימה של השעיות תא בודדות PP מעכברי נמען. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק אם אוכלוסיות אב אחרות הן מסוגלים לייצר PP pDCs. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התפקיד של גורמים שהם חזו להשפיע על התפתחות PDC בPP, על ידי העברה תת אב עם מציאה מתאימה, נוקאאוט או ביטוי יתר של הגורם ו / או התפתחותי המשוערת על ידי מניפולציה ציטוקינים במחזור באמצעות HGT . שיטה זו גם עשויה לאפשר ניתוח של כמה pDCs PP משפיע על התדירות או פונקציה של תת חיסון אחר בPPS. תכונה ייחודית של שיטה זו היא השימוש בIfnar - / - עכברים, אשר מראה מדולדל קשות ביחס PP pDCs לבעלי חיים מסוג בר, ובכך allowiהכינון מחדש ng של PP pDCs בהעדר תופעות של בלבול מקרינה קטלנית.

התוצאות שלנו מראות אסטרטגית gating לבידודה של CDPs מתאי מח עצם של עכבר (איור 1), כמפורט בפרוטוקולים 2 ו -3. CDPs יהווה כ 0.1% בסך הכל תאי מח עצם, ויכול להיות מבודד בערך 4-6 x 10 4 CDPs מעכבר אחד. עם העברת מאמצת, CDPs להתמיין pDCs וcDCs 10. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always" sty...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors at JoVE.com

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

11.1K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer. 

Video: Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...